Полиморфизм геновренин-ангиотензиновой системы и риск развития сосудистой патологии у беременных женщин с гестозом
- Авторы: Глотов А.С.1, Вашукова Е.С.1, Канаева М.Д.2, Бикмуллина Д.Р.1, Курилов Р.В.2, Зайнулина М.С.1, Иващенко Т.Э.1, Баранов В.С.1
-
Учреждения:
- ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
- Санкт-Петербургский государственный университет
- Выпуск: Том 61, № 3 (2012)
- Страницы: 61-68
- Раздел: Статьи
- Статья получена: 15.06.2012
- Статья опубликована: 15.06.2012
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/1288
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD61361-68
- ID: 1288
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ Одним из наиболее социально-значимых заболеваний беременных женщин, в основе которого лежит патология сосудистой системы организма человека, является гестоз или преэклампсия [19]. Основу патогенеза заболевания составляет генерализованное повреждение эндотелия сосудов, приводящее к нарушениям процессов имплантации и плацентации [13, 27]. Гестоз является одним из наиболее опасных осложнений беременности: он может стать причиной преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты [11], наступления преждевременных родов, плацентарной недостаточности, рождения детей с малой массой тела и т. д.[10, 11]. Гестоз является заболеванием, специфичным для беременности и исчезает после ее завершения, занимает одно из первых мест в структуре материнской смертности [1]. Частота его в России в зависимости от региона колеблется от 6 до 20 % всех беременных. Чаще гестоз возникает у беременных, имеющих экстрагенитальные заболевания (в 20–40 % случаев), но также встречается и у здоровых беременных (6–12 % случаев) [1]. Много десятилетий проблеме гестоза ученые разных направлений и специальностей (акушеры, гинекологи, кардиологи, иммунологи, биохимики, генетики) уделяют огромное внимание. Однако несмотря на большое число исследований, до сих пор нет единого представления о причинах его возникновения, отсутствуют точные сведения о патогенезе заболевания, не разработаны достоверные лабораторные методы диагностики и, как следствие, нет действенных мер профилактики и лечения [3]. В генетическом отношении гестоз является типичным мультифакториальным заболеванием. К факторам риска гестоза относят: сердечно-сосудистые заболевания (артериальную гипертонию), заболевания почек, печени, желудочно-кишечного тракта, эндокринные нарушения (ожирение, сахарный диабет), аутоиммунные заболевания (антифосфолипидный синдром), хронические инфекции, многоплодную беременность, возраст, социальный статус, генетическую предрасположенность [1, 10, 11]. Вклад генетических факторов в патогенез гестоза оценивают приблизительно в 55 % [12, 32]. Ряд исследователей полагают, что в основе генетической составляющей гестоза лежит аномальное функционирование плаценты (изменения профиля экспрессии некоторых генов, эпигенетические факторы), другие связывают риск развития заболевания с «дефектами» в материнских генах, третьи предполагают, что болезнь вызвана изменением в балансе «работы» геномов плода и матери [3, 4, 32], четвертые считают, что развитие заболевания происходит вследствие изменения экспрессии генов микроРНК, принимающих участие в посттранскрипционной регуляции функций генома и в процессах РНК-зависимого метилирования [30, 25]. В настоящее время выделяют более 70 генов-кандидатов риска развития гестоза [32]. К ним относят гены различных систем: свертывания крови и фибринолиза, ренин-ангиотензиновой, функции эндотелия и ангиогенеза, иммунной и эндокринной систем, детоксикации и оксидативного стресса, липидного обмена [3, 3, 8, 15, 18, 16, 24, 23, 21, 14, 32]. Гены гестоза картированы на различных хромосомах. Неравновесие по сцеплению найдено между этой патологией и локусами на хромосомах 2 (2p.11, 2p.13, 2p.22, 2p.25), 9 (9p.13) и 10 (10q21), а также в локусах хромосом 4, 5, 12, 22 [20, 32]. Одним из критериев для постановки диагноза «гестоз» является повышенное артериальное давление [1]. Кроме того, диагноз «гипертония» является одним из наиболее частых у беременных женщин, предшествующих развитию гестоза [1, 10, 11]. Таким образом, есть основания полагать, что гены-регуляторы артериального давления вносят особый вклад в развитие данной патологии. В настоящее время активно изучаются гены, относящиеся к основным системам регуляции артериального давления (АД) — ренин-ангиотензиновая, кинин-брадикининовая, и эндотелиальная [3]. Ранее в нашей лаборатории была показана ассоциация между полиморфизмом гена ACE (I/D) и гестозом [2]. Исследователями других стран также были выявлены ассоциации между аллелями генов AGT, AGTR1, AGTR2 и риском гестоза [15, 21, 32]. В результате проведенного мета-анализа было показано, что аллель T гена AGT (полиморфизм M235T) увеличивает риск развития преэклампсии в 1,62 раза. Однако в большинстве указанных исследований не проводили комплексного анализа всех генов, продукты которых вовлечены в единый каскад биохимических реакций ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем. В единичных публикациях приведены исследования совместного влияния нескольких генетических вариантов генов ренин-ангиотензиновой системы на риск развития гестоза. В одной из таких работ было показано, что сочетанные варианты генов ACE, AGT, AGTR1 влияют на риск развития гестоза, в другой удалось установить одновременную ассоциацию с гестозом вариантов генов ACE, AGTR1 [17, 29]. Учитывая вышесказанное, целью настоящей работы явилось изучение особенностей полиморфизма (частот аллелей) генов REN (I9–83G > A), AGT (M235T), AGTR1 (1166A > C), AGTR2 (3123C > A), BKR2 (–58T > C) у беременных женщин с гестозом, у женщин с физиологической беременностью и в группе доноров Северо-Западного региона России. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Создание коллекций образцов ДНК и формирование групп Нами созданы коллекции образцов ДНК беременных женщин с патологией беременности (гестоз) (ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН») и без таковой (Роддом № 18 г. Санкт-Петербурга) общей численностью 222 человек, а также образцы ДНК доноров — 228 человек (ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии» ФМБА России и ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта СЗО РАМН»). В дальнейшей работе были исключены образцы ДНК неславянского этнического происхождения, а также образцы ДНК не соответствующие ниже приведенным критериям. Группу беременных женщин с гестозом, из которой были исключены пациентки с тромбозами в анамнезе составили 72 женщины с гестозом средней и тяжелой степени, а также с преэклампсией (согласно классификации Савельевой и соавт. (2005). Диагноз гестоз устанавливали при наличии не менее двух клинических проявлений в следующих сочетаниях: повышение артериального давления (АД) и отеки, отеки и протеинурия, сопровождающаяся повышением АД, а также классическая триада симптомов — отеки, гипертензия, протеинурия. В контрольную группу женщин с физиологическим течением беременности были включены 82 пациентки, у которых в анамнезе отсутствовали тромбозы, хронические и инфекционные заболевания, акушерская патология. Группу доноров составили 228 человек (154 мужчин и 74 женщин) славянской национальности, не имеющих выраженных патологий в анамнезе. Основные характеристики групп представлены в таблице 1. Образцы ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови фенольным методом, как описано ранее [6], или в соответствии с методикой Миллер с соавт. (Miller et al., 1988) с модификациями. Для выявления полиморфизма генов REN (I9–83G > A), AGT (M235T), AGTR1 (1166A > C), AGTR2 (3123C > A), BKR2 (–58T > C) образцы ДНК анализировали с помощью «Кардио-биочипа». Исследование ДНК включало следующие этапы: первый раунд мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР), второй раунд мультиплексной ПЦР, гибридизацию меченого продукта на микрочипе и интерпретацию результатов гибридизации [5]. В качестве статистического метода сравнения выборок использовали метод χ2, для построения модели предсказания наличия гестоза у беременных использовали логистическую регрессию. Вычисления проводили в среде для статистических вычислений R [31]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Частоты генотипов и аллелей генов REN, AGT, AGTR1, AGTR2, BKR2 в изученных группах представлены в таблице 2. Распределение соответствующих генотипов по всем генам в исследуемых группах соответствовало уравнению Харди-Вайнберга (p > 0,07). Частоты генотипов в группе доноров, так же как и частоты генотипов в исследуемых группах, соответствовали данным для европейских популяций [28]. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по всем изученным генам (REN, AGT, AGTR1, AGTR2, BKR2) в отдельности не выявил статистически значимых отличий между группами беременных с гестозом и контрольной группой беременных женщин (p < 0,45, χ2 < 0,56 и p < 0,28, χ2 < 2,54, для аллелей и генотипов соответственно); а также между группами беременных и группой женщин доноров (p < 0,18, χ2 < 1,76 и p < 0,09, χ2 < 4,70, для аллелей и генотипов соответственно) и между группами беременных с гестозом и группой женщин доноров (p < 0,27, χ2 < 1,22 и p < 0,13, χ2 < 4,09, для аллелей и генотипов соответственно). Таким образом, среди «неблагоприятных» вариантов генов ренин-ангиотензиновой системы и рецептора к брадикинину нами не были обнаружены факторы риска материнского здоровья. Выборка беременных женщин с гестозом в целом не отличалась от контрольной и популяционной выборок по полиморфизму генов «гипертонии» (p > 0,05). Однако после стратификации беременных женщин с гестозом в зависимости от экстрагенитальной патологии (рис. 1) были выявлены специфические ассоциации полиморфизма изученных генов с определенной экстрагенитальной патологией. Так, было установлено, что частоты генотипов гена AGTR2 у беременных с гестозом на фоне хронического пиелонефрита статистически значимо (p < 0,05) отличаются от таковых без пиелонефрита и в контрольной группе (рис. 2). Ген AGTR2 является одним из ключевых в группе генов ренин-ангиотензиновой системы. Он локализован на длинном плече Х хромосомы в локусе Xq22-q23 и содержит 3 экзона размером в 3,8 т. п. о. Рецептор 2 к ангиотензину II экспрессируется, главным образом, в сердце, под контролем эстрогенов. AGTR2, так же как и AGTR1, участвует в ангиотензин II опосредованных реакциях, но является его антагонистом — определяет вазодилататорную функцию: натрийуретическое действие, высвобождение NO и простациклина, а также антипролиферативное действие [3]. Известно несколько полиморфизмов в гене AGTR2. Одним из наиболее изученных является полиморфизм 3123С > A, сцепленный с вариантом +1675G > A в интроне 1 и влияющий на начало транскрипции [22]. Ранее была показана ассоциация генотипа G/G полиморфизма 1675G > A гена AGTR2 с гестозом [15], что согласуется с нашими результатами. Другими исследователями была установлена ассоциация между гестозом и определенными гаплотипами гена AGTR2 [21]. Подобные факты свидетельствуют о возможном участии этого фермента в развитии гестоза. По всей видимости, при наличии «неблагоприятного» генотипа по гену AGTR2 нарушаются специфические пути метаболизма, следствием чего и является гестоз. Однако такие нарушения метаболизма возможны только при наличии соответствующей сопутствующей патологии. Ранее в нашем институте было показано, что частоты неблагоприятных генотипов и аллелей генов, участвующих в регуляции функции эндотелия, варьируют в зависимости от наличия фоновых заболеваний у беременных с гестозом [7]. Было установлено значительное возрастание частоты неблагоприятных генотипов по генам PLAT, PAI1, eNOS и TNFА у беременных с гестозом на фоне вегето-сосудистой дистонии по гипертоническому типу, достоверное увеличение частоты генотипа –238A/G гена TNFА при гестозе на фоне почечной патологии, возрастание частоты генотипа D/D гена ACE на фоне гипертонической болезни [7]. Эти данные, так же как и наши результаты, свидетельствуют о пользе дифференцированной оценки риска осложнений беременности в зависимости от многих других факторов, прежде всего, от сопутствующей патологии. Наличие сопутствующей патологии в совокупности с комплексным исследованием влияния полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем легло в основу построения нами статистической модели вероятности гестоза. Для этого мы применили метод логистической регрессии. Этот метод часто используется для описания отношения между независимыми переменными и бинарным ответом [26, 33]. В данной задаче бинарным ответом является наличие или отсутствие гестоза при беременности, а переменными — генотипы по полиморфизму генов REN, AGT, AGTR1, AGTR2, BKR2 и фенотипические параметры. В общем виде вероятность риска развития гестоза представляется формулой: , где z(x) — это функция, зависящая от генотипа и фенотипических параметров. При выборе конкретной модели в качестве исходных мы использовали данные о генотипах по полиморфизму рассматриваемых генов и наличие хронического пиелонефрита (как фактора, показавшего свое значение при моногенных сравнениях) по общей выборке беременных из 154 человек (с гестозом и контрольной группы женщин с физиологической беременностью). При выборе конкретной модели в качестве исходных мы использовали данные о генотипах по полиморфизму рассматриваемых генов, и данные о наличии хронического пиелонефрита (ХП) и ожирения (только по этим двум патологиям имелось достаточное для проведение анализа количество положительных случаев в группе женщин с гестозом и контрольной группе) по общей выборке беременных из 154 человек. В ходе перебора различных моделей параметры, отвечающие за полиморфизмы генов REN, AGT и параметр, связанный с ожирением были отброшены, как не вносящие существенный вклад. В результате нами была выбрана модель с наименьшим критерием AIC (информационный критерий Акайке), обладающая наибольшей точностью предсказания: Значения коэффициентов и параметров данной модели приведены в таблицах 3 и 4, соответственно. Значения коэффициентов модели показывают вклад каждого из них в конечный фенотип. И чем ниже рассчитанная вероятность для коэффициента, тем больше его вклад в риск развития заболевания (табл. 3). Значения параметров для генотипов по всем приведенным в таблице 4 генам увязаны с функцией, кодируемого ими фермента. Генотип, связанный с повышенной экспрессией гена обозначен «1», пониженной — «–1», гетерозигота — «0». Наличию заболевания также соответствует значение «1». Таким образом, в нашей работе нам не удалось подтвердить роль полиморфизма гена AGT как одного из ведущих маркеров гестоза, полученных в результате мета-анализа (Medica et al., 2007). Возможная причина такого несоответствия может заключаться в особенностях нашей выборки, в которую были включены больные с гестозом разной степени тяжести и с широким спектром сочетанной патологии. На основании данной модели мы предложили «границу» риска развития гестоза. Она рассчитана эмпирическим путем на основании нашей выборки. Если предполагаемое значение вероятности p > 0,47, то считаем, что существует риск развития гестоза, если меньше — риска нет. Сбалансированная точность (среднее арифметическое чувствительности и специфичности) данной модели, применительно к нашей выборке, составляет 69 %. Например, если генотип беременной женщины по генам BKR2, AGTR1, AGTR2 — С/С, A/C, С/A соответственно, и у нее отсутствует хронический пиелонефрит, то вероятность развития гестоза составляет: что говорит об отсутствии риска гестоза у данной женщины. И, несмотря на то, что данная модель нуждается в верификации на других выборках, она свидетельствует о том, что адекватную оценку риска гестоза, как мульфакторного заболевания, можно рассчитать на основании комплексной математической оценки клинических, анамнестических и генетических данных. Эффективность подобной математической модели была продемонстрирована в работе Salimi с коллегами, где они установили совместный вклад полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы и некоторых анамнестических данных с риском развития гестоза у иранских женщин [17]. Однако в другой работе, где исследовали вклад хронической гипертензии и полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы в риск гестоза, подобные связи установлены не были [29]. Небольшое число публикаций в оценке риска мультифакториальных заболеваний свидетельствует о том, что эти исследования еще находятся в начале пути. Однако нет сомнений в том, что использование новых методов оценки риска с учетом как генетических, так и клинических характеристик открывает новые возможности для объективизации результатов молекулярно-генетических исследований частых мультифакторных заболеваний [9]. Таким образом, результаты настоящего исследования и анализ литературы свидетельствуют о наличии корреляции полиморфизма некоторых генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем с риском развития сосудистых нарушений у беременных женщин на фоне сочетанной патологии — пиелонефрита. Необходимы дальнейшие проспективные и ретроспективные молекулярно-генетические исследования, чтобы объективно оценить значение предложенной нами формулы для расчета риска развития мультифакторной патологии.Об авторах
Андрей Сергеевич Глотов
ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
Email: anglotov@mail.ru
к. б. н., старший научный сотрудник
Елена Сергеевна Вашукова
ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
Email: iagmail@ott.ru
лаборант-исследователь
Мария Дмитриевна Канаева
Санкт-Петербургский государственный университет
Email: iagmail@ott.ru
студентка
Дина Рустемовна Бикмуллина
ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
Email: iagmail@ott.ru
врач
Роман Владимирович Курилов
Санкт-Петербургский государственный университет
Email: iagmail@ott.ru
студент
Марина Сабировна Зайнулина
ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
Email: iagmail@ott.ru
д. м. н., главный врач, заместитель директора по лечебной и научной работе
Татьяна Эдуардовна Иващенко
ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
Email: iagmail@ott.ru
профессор, д. б. н., ведущий научный сотрудник
Владислав Сергеевич Баранов
ФГБУ «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
Email: iagmail@ott.ru
Заведующий Лабораторией пренатальной диагностики врожденных и наследственных заболеваний, д. м. н., член–корр. РАМН, профессор
Список литературы
- Айламазян Э. К., Мозговая Е. В. Гестоз: теория и практика. — М.: МЕДпресс-информ, 2008. — 272 с.
- Ассоциация полиморфных аллелей генов АСЕ и eNOS с развитием гестозов / Малышева О. В. [и др.] // Медицинская генетика. — 2003. — №. 2. — С. 78–82.
- Баранов В. С. Генетический паспорт — основа индивидуальной и предиктивной медицины. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. — 528 с.
- Баранов В. С., Айламазян Э. К. Определение наследственной предрасположенности к некоторым частым заболеваниям при беременности. Генетическая карта репродуктивного здоровья: методические рекомендации. — СПб.: Изд-во Н-Л, 2009. — 66 с.
- Зависимость между возникновением стабильной артериальной гипертензии у детей и полиморфизмом генов ренин-ангиотензиновой и кинин-брадикининовой систем / Глотов А. С. [и др.] // Молекулярная биология. — 2007. — Т. 41, № 1. — С. 18–25.
- Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. — М.: Мир, 1984. — 480 с.
- Мозговая Е. В. Исследование генетической предрасположенности к гестозу: полиморфизм генов, участвующих в регуляции функции эндотелия // Журнал акушерства и женских болезней. — 2003. — Т. LII, № 2. — С. 25–34.
- Молекулярная генетика тромбофилии при поздних гестозах / Зайнуллин И. А. [и др.] // Медицинская генетика. — 2007. — Т. 6, № 7. — С. 12–17.
- Пузырев В. П. Генетический взгляд на феномен сочетанной патологии у человека // Медицинская генетика. — 2008. — Т. 8. № 9. — С. 3–9.
- Радзинский В. Е., Галина Т. В. Проблемы гестоза и подходы к их решению // Казанский медицинский журнал. — 2007. — Т. 88. — С. 114–117.
- Репина М. А. Преэклампсия и материнская смертность. — СПб., 2005. — 208 с.
- Современные подходы к диагностике наследственных форм тромбофилии / Вашукова Е. С. [и др.] // Российский педиатрический журнал. — 2008. — № 5. — С. 48–53.
- Современные подходы к диагностике, профилактике и лечению гестоза: метод. указания / Савельева Г. М. [и др.]. — М, 1968.
- A low COMT activity haplotype is associated with recurrent preeclampsia in a Norwegian population cohort (HUNT2) / Roten L. T. [et al.] // Mol. Hum. Reprod. — 2011. — Vol. 17, № 7. — P.439–446.
- Angiotensin II type 1 and 2 receptors gene polymorphisms in pre-eclampsia and normal pregnancy in three different populations / Akbar S. A. [et al.] // Acta. Obstet. Gynecol. Scand. — 2009. — Vol. 88, № 5. — P. 606–611.
- Apolipoprotein E polymorphism in South African Zulu women with preeclampsia / Chikosi A. B. [et al.] // Hypertens. Pregnancy. — 2000. — Vol. 19. — P. 309–314.
- Association of angiotensin-converting enzyme intron 16 insertion/deletion and angiotensin II type 1 receptor A1166C gene polymorphisms with preeclampsia in South East of Iran / Salimi S. [et al.] // J. Biomed. Biotechnol. — 2011. — Vol. 10. — P. 515.
- Chappell S., Morgan L. Searching for genetic clues to the causes of pre-eclampsia // Clinical Science. — 2006. — Vol. 110. — P. 443–458.
- Dekker G. A., de Vries J. I. P., Doelitzsch P. M. Underlying disorders associated with severe early-onset preeclampsia // Am. J. Obstet Gynecol. — 1995. — Vol.173. — P. 1042–1048.
- Genetics of preeclampsia: paradigm shifts / Oudejans C. B. [et al.] // Hum. Genet. — 2007. — Vol. 120, № 5. — P. 607–612.
- Haplotypes of the angiotensin II receptor genes AGTR1 and AGTR2 in women with normotensive pregnancy and women with preeclampsia / Plummer S. [et al.] // Hum. Mutat. — 2004. — Vol. 24, № 1. — P. 14–20.
- Interactions among related genes of rennin-angiotensin system associated with type 2 diabetes / Yang J. K. [et al.] // Diabetes Care. — 2010. — Vol. 33, № 10. — P. 2271–2273.
- Lin J, August P. Genetic thrombophilias and preeclampsia. A meta-analysis // Obstet. Gynecol. — 2005. — Vol. 105. — P. 182–192.
- Lipoprotein lipase gene mutations and the genetic susceptibility of preeclampsia / Kim Y. J. [et al.] // Hypertension. — 2001. — Vol. 38. — P. 992–996.
- Maternal peripheral blood gene expression in early pregnancy and preeclampsia / Enquobahrie D. A. [et al.] // Int. J. Mol. Epidemiol. Genet. — 2011. — Vol. 2, № 1. — P. 78–94.
- McCullagh P., Nelder J. Generalized Linear Models. — 2-nd edn. — N. Y.: Chapman Hall, 1989.
- Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C / Bertina R. M. [et al.] // Nature. — 1994. — Vol. 369, № 6475. — P. 64–67.
- National Center for Biotechnology Information URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/ (дата обращения 12.12.2011).
- Prolylcarboxypeptidase gene, chronic hypertension, and risk of preeclampsia / Wang L. [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. — 2006. — Vol. 195, № 1. — P. 162–171.
- Serum microRNA expression in pregnancies with preeclampsia / Gunel T. [et al.] // Genet. Mol. Res. — 2011. — Vol. 10, № 4.
- The R Project for Statistical Computing URL: http://www.R-project.org. Development Core Team (дата обращения: 15.01.2012).
- Williams P. J., Pipkin F. B. The genetics of pre-eclampsia and other hypertensive disorders of pregnancy // Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. — 2011. — Vol. 25, № 4. — P. 405–417.
- Xu S., Hu Z. Generalized linear model for interval mapping of quantitative trait loci // Theor. Appl. Genet. — 2010. — Vol. 121, № 1. — P. 47–63.