Особенности полиморфизма генов рецепторов эстрогенаи прогестерона у женщин с миомой матки
- Авторы: Осиновская Н.С.1, Иващенко Т.Э.1, Джемлиханова Л.Х.2, Баранов В.С.3, Ткаченко А.Н.2, Султанов И.Ю.3
-
Учреждения:
- ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН
- Санкт-Петербургский государственный университет
- ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН
- Выпуск: Том 61, № 3 (2012)
- Страницы: 109-114
- Раздел: Статьи
- Статья получена: 15.06.2012
- Статья опубликована: 15.06.2012
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/1294
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD613109-114
- ID: 1294
Цитировать
Полный текст
Аннотация
Ключевые слова
Полный текст
ВВЕДЕНИЕ В последнее десятилетие во всем мире, в том числе и в России, отмечается повышение частоты возникновения гормонозависимых опухолей у женщин. Лидирующие позиции в структуре гинекологических заболеваний занимают миома матки и эндометриоз. Лейомиома матки — доброкачественная гиперплазия тканей, развитие которой происходит из мышечной и адвентициальной оболочек сосудов и прилегающего эндометрия. В зависимости от соотношения паренхимы и стромы ЛМ ранее имела различные названия: миома, фиброма, фибромиома. У большинства больных выявляют множественную ЛМ [5]. Частота ЛМ в женской популяции составляет от 20 до 77 %, по данным разных авторов [1;6]. Одно из ключевых мест в изучении патогенеза ЛМ занимает вопрос об особенностях гормонального статуса и функциональном состоянии репродуктивной системы по мере развития заболевания. В основе развития ЛМ лежат гормонально зависимые процессы пролиферации. Традиционное мнение о ведущей роли эстрогенов в патогенезе миомы подтверждается данными современных исследований [2; 14]. Известно, что после длительного лечения (3–4 мес) агонистами гонадолиберина (гипоталамический рилизинг-фактор) отмечается уменьшение объемов миоматозных узлов и значительное снижение содержания рецепторов эстрогенов в миометрии и тканях лейомиомы, что подтверждает гипотезу о роли эстрогенов в патогенезе заболевания. Cодержание эстрогенов при ЛМ изучали многие исследователи, однако выводы, к которым они пришли, противоречивы. По мнению одних исследователей, значение имеет не столько уровень эстрогенов в периферической крови, сколько нарушение их экскреции и метаболизма, а также нарушение качественного соотношения между фракциями эстрогенов. По данным других — прогестерон наряду с эстрогенами стимулирует рост ЛМ. Оба эти гормона играют значительную роль в патогенезе заболевания. Прослеживается также выраженная генетическая предрасположенность к развитию ЛМ. В связи с этим важен поиск молекулярных маркеров данной патологии, который может способствовать повышению возможностей выявления опухолевых заболеваний на ранних стадиях, а также внедрению новых методов их лечения и профилактики. В настоящее время во всем мире идет активное молекулярно-генетическое исследование ЛМ с использованием различных методов. Одним из направлений является изучение ассоциаций полиморфных локусов генов, вовлеченных в патогенез заболевания. Ген рецептора эстрогена — ERα локализован на хромосоме 6q25.1. Наиболее изученный полиморфизм данного гена представляет собой однонуклеотидную замену тимина на цитозин (T397C) в первом интроне гена и замену аденина на гуанин (A351G) в интронной области гена ERα. Известно, что эстрогеновые рецепторы необходимы для реализации действия эстрогенов. Нарушения в гене ERα могут приводить к изменениям гормоночувствительности клеток и даже к ее утрате. В работе японских авторов показано, что полиморфизм интронной области гена ERα (PvuII) ассоциирован с риском развития ЛМ и эндометриоза [15]. Ген рецептора прогестерона — PGR картирован на хромосоме 11q22. Наличие аллеля с Alu-инсерцией размером 306 п. о. в интроне 7 может способствовать появлению неполноценных форм прогестероновых рецепторов с измененными свойствами лиганд- и гормон-связывающих областей, что выражается в изменении действия прогестерона в тканях [16]. Данный полиморфизм приводит к избыточному образованию В-изоформы рецептора, которая является более мощным фактором транскрипции [7]. Данные литературы свидетельствуют о снижении риска развития рака груди у женщин, в возрасте 50 лет, несущих, по крайней мере, один аллель с Alu-инсерцией [11]. В работах, посвященных изучению полиморфизма гена PGR у женщин с ЛМ, не выявлено ассоциации аллеля с Alu-инсерцией и развитием заболевания [17]. В настоящее время не существует препаратов для радикального лечения ЛМ, а традиционные схемы гормонального лечения направлены на устранение клинических проявлений заболевания. Нередко, особенно при поздней диагностике, консервативное лечение заболевания оказывается неэффективным. Оперативное лечение ЛМ в настоящее время остается основным методом лечения. В связи с тем, что заболевание встречается в основном у женщин репродуктивного возраста, планирующих реализацию репродуктивной функции, приоритетным направлением в терапии ЛМ стали органосохраняющие операции. В то же время, при условии ранней диагностики, своевременная терапия может отодвинуть сроки или уменьшить объем последующего хирургического вмешательства. Необходимость разработки оптимальных методов диагностики и лечения ЛМ предполагает поиск генов-кандидатов и уточнение роли их полиморфных вариантов в формировании и развитии ЛМ. Целью данной работы явилось изучение частоты полиморфных вариантов генов рецепторов эстрогена и прогестерона у больных с ЛМ и анализ их возможной ассоциации с клиническими проявлениями гиперпластических процессов органов репродуктивной системы женщин. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа была выполнена на образцах ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови. Выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови проводили в соответствии с методикой, приведенной в руководстве Sambrook et al. с некоторыми модификациями [18]. Основная группа: 54 женщины с ЛМ в возрасте от 27 лет до 66 лет (средний возраст 40,0 ± 5,36 лет). Длительность заболевания ЛМ к моменту операции составила в среднем 6,3 (от 8 лет до 1 года). Показания к оперативному лечению: быстрый рост ЛМ, планирование беременности, бесплодие, наличие сочетанной патологии яичников, рецидив заболевания, синдром хронических тазовых болей. Проведенное обследование включало в себя клинико-анамнестическое обследование, ультразвуковое исследование органов малого таза, гистологическое исследование операционного материала, таким образом, диагноз во всех случаях верифицирован морфологически. Возраст менархе в основной группе колебался от 11 до 16 лет, в среднем 13,05 ± 0,55. У 47 обследованных женщин менструальный цикл на момент оперативного лечения был регулярный (от 26 до 32 дней), 8 отмечали нарушения менструального цикла: межменструальные кровотечения — 1, альгоменорея — 2; гиперполименоррея — 5 женщин (у всех женщин с гиперполименоррей имелась множественная ЛМ). Бесплодие отмечено у 19 женщин, из них первичное — у 6, вторичное — у 13 женщин. Роды в анамнезе отмечали 32 женщины. Беременность и роды у 18 женщин протекали до выявления заболеваний, у 7 — на фоне диагностированной ЛМ, в двух случаях — после консервативной миомэктомии. У двух женщин с диагнозом субмукозная миома матки произошло самопроизвольное прерывание беременности на сроке до 12 недель. Внематочная беременность диагностирована у 2 женщин с интрамурально-субмукозной локализацией миоматозных узлов. Экстирпация и надвлагалищная ампутация матки были выполнены у 12 больных, что составило 22 %, у остальных проводилась консервативная миомэктомия. Множественная ЛМ выявлена у 16 женщин, что составило 30 %. Наиболее часто встречалась субсерозная форма заболевания 72,2 ± 0,1 %. С учетом результатов гистологического исследования послеоперационного материала выявлено сочетание ЛМ и аденомиоза у 7 женщин; сочетание ЛМ с наружным генитальным эндометриозом — у 9 женщин. В группу популяционного контроля вошли 103 женщины — популяционная выборка женщин одной расы, место рождения и проживания которых ограничивались одним регионом. Средний возраст — 36,54± 3,64 лет (от 22 до 50 лет). Критериями включения в группу популяционного контроля для настоящего исследования стали: 1) возраст — старше 18 лет; 2) пол — женский; 3) раса — европеоидная; 4) регион проживания — северо-запад России; 5) добровольное участие в исследовании. Методом полимеразной цепной реакции исследованы частоты генотипов и аллелей генов ERα и PGR у 54 больных с ЛМ и у 103 человек из популяционной выборки. Cмесь для амплификации обьемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1U Taq-ДНК-полимеразы (производства «Бион», Москва). Для амплификации фрагментов гена ERα и PGR использовали следующие условия ПЦР: после денатурации (94 °С, 7 мин.) проводили 30 циклов амплификации в режиме: 94 °С — 40 с; 55 °С — 40 с; 72 °С — 1 мин. Последовательности олигонуклеотидов для ERα: F-CTC AAA CTA CAG GGC TTA AAC; R-GGT GTT GCC TAT TAT ATT AAC CTT, PGR: F-GCCTCTAAAATGAAAGGCAGAAAGC; R-GTATTTTCTTGCTAAATGTCTG. Продукты амплификации анализировали в 7,5 % полиакриламидном геле с последующей окраской этидиумбромидом и визуализацией в УФ свете. Для идентификации аллелей гена ERα проводили расщепление полученного ПЦР продукта рестриктазами PvuII и XbaI, продукты рестрикции подвергали элекрофорезу в 7,5 % полиакриламидном геле и после окраски этидиумбромидом анализировали в проходящем УФ свете. Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерной программы “GraphPad InStat, версия 3.05,32“. При сравнении отдельных частот генотипов использовали критерий Фишера, при групповом сравнении — стандартный критерий χ 2. РЕЗУЛЬТАТЫ В настоящей работе проведен анализ ассоциации ЛМ с аллельными вариантами генов рецепторов эстрогена (ERα) и прогестерона (PGR). Результаты представлены в таблице 1. Появление рестрикционного полиморфизма XbaI обусловлено заменой аденина на гуанин в интронной области гена ERα (dbSNP rs9340799, IVS1–351A>G). В литературе нормальный аллель А гена ERα обозначается как «х», а его полиморфный аллель G как — «Х» [9]. Появление дополнительного сайта для эндонуклеазы рестрикции PvuII происходит в результате однонуклеотидной замены тимина на цитозин (dbSNP rs2234693, IVS1–397T>C). Аллель *Т обозначается *р, а *С — *Р. Сравнительный анализ частот аллелей гена ERα (Xba1-полиморфизм и PvuII-полиморфизм) в группе женщин с ЛМ и в контрольной группе не выявил статистически значимых различий (p > 0,05) (табл. 1). Распределение частот генотипов по полиморфизму Xba1 и полиморфизму PvuII гена ERα представлено в таблице 2. Сравнительный анализ распределения частот генотипов в группе женщин с ЛМ и в популяционной выборке также не выявил статистически значимых различий (р > 0,05). На рисунке 1 представлены результаты анализа частот сочетанных генотипов по полиморфным сайтам рестрикции Xba1 и PvuII. Ни в одной из групп не были идентифицированы генотипы XxPP, xxPP и xxPp. Распределение частот генотипов достоверно не различалось в исследованных группах (р > 0,05). Однако можно отметить, что наблюдается некоторое увеличение частоты «мутантного» генотипа XXPP в группе женщин с ЛМ (35 %) по сравнению с популяционной выборкой (25 %). Проведен анализ ассоциации Alu-инсерционного полиморфизма гена прогестеронового рецептора (PGR) с ЛМ. Полиморфный вариант гена прогестеронового рецептора, содержащего Alu-инсерцию в интроне G, размером 306 п. о. получил название Progins (аллель T2) [7]. Частота полиморфных аллелей гена рецептора прогестерона в двух исследуемых группах достоверно не отличалась (р > 0,05) (табл. 1). Сравнительный анализ не выявил статистически значимых отличий частот генотипов Т1/T1, T1/T2 и T2/T2 гена PGR в группе женщин с ЛМ и в популяционной выборке (р > 0,05) (табл. 2). В таблице 3 представлены результаты анализа распределения частот генотипов по Alu-инсерционному полиморфизму гена рецептора прогестерона у женщин с ЛМ и в контрольной группе, имеющих «мутантный» генотип XXPP по полиморфным локусам Xba1 и PvuII гена рецептора эстрогена. Мы не выявили достоверных отличий по данному показателю (р > 0,05). Однако частота генотипов T2/T2 и T1/T2, несущих Alu-инсерцию составила в группе женщин с ЛМ 26 %, и была значительно выше таковой в популяционной выборке (12 %). ОБСУЖДЕНИЕ К настоящему времени в гене ERα идентифицировано несколько полиморфных локусов, из которых наиболее изучены полиморфизм по сайтам рестрикции PvuII и XbaI. На сегодняшний день остается открытым вопрос о том, как эти полиморфные варианты, локализованные в интроне, влияют на функцию белка. Тем не менее, отдельные исследования свидетельствуют о функциональной значимости этих аллелей [10]. Нарушение баланса эстрогенов и прогестерона при различных формах овариальной недостаточности, а также дисбаланс соотношения эстрогеновых и прогестероновых рецепторов создают условия для развития гиперпластических процессов в гормонально-зависимых тканях. Процесс гипертрофии гладкомышечных клеток (ГМК), аналогичный процессу их гипертрофии во время беременности, может возникать только при сочетанном воздействии сравнительно высоких концентраций эстрадиола и прогестерона. Высокий митотический индекс в клетках ЛМ в лютеиновую фазу менструального цикла подтверждает значительную этиопатогенетическую роль прогестерона в развитии заболевания. Сведения о балансе рецепторов эстрогена и прогестерона в ЛМ и в интактном миометрии противоречивы. По данным Sadan et al., содержание рецепторов эстрогена в миоме и нормальном миометрии достоверно не отличается, тогда как содержание прогестероновых рецепторов выше, чем в обычном миометрии [12]. В другом исследовании не показано достоверных отличий в содержании рецепторов прогестерона и эстрогенов в ткани ЛМ и интактном миометрии [3]. На основании многочисленных исследований обнаружено, что миометрий у женщин с ЛМ, в большей степени реагирует на колебания уровня половых гормонов; эстрадиол индуцирует образование сначала своих рецепторов, а подъем уровня прогестерона в крови приводит к снижению как рецепторов эстрогенов, так и рецепторов прогестерона. Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфным сайтам PvuII и XbaI гена ERα и Alu-инсерционному полиморфизму гена PGR в группе женщин с ЛМ и группе контроля не выявил статистически значимых различий (р > 0,05). Хотя наблюдалась тенденция к снижению частоты гомозигот по нормальному генотипу рр (PvuII-полиморфизм) у больных (19 %) по сравнению с группой контроля (26 %) и повышению частоты гомозигот по «мутантному» аллелю *Р 35 % и 25 %, соответственно. Такая же тенденция прослеживается и при анализе генотипов по полиморфизму Xba1. Частота гомозигот по нормальному аллелю *х у женщин с ЛМ соответствовала 6 %, тогда как в популяционной выборке — 10 %, и гомозигот по «мутантному» аллелю*Х — 50 % и 42 %, соответственно. В настоящее время полиморфные сайты PvuII и XbaI гена ERα активно изучаются в связи с другими заболеваниями женской репродуктивной системы и опухолей. Показано, что носители РР генотипа имеют более высокую минеральную плотность кости, чем индивидуумы с генотипом Pp и pp [10]. Эти сведения указывают на то, что локальное действие эстрогенов более сильное у гомозигот по *P-аллелю, чем у гетерозигот или гомозигот по *р-аллелю. Клеточные линии миометрия, с генотипом РР демонстрировали усиленный пролиферативный ответ на действие эстрогенов in vitro по сравнению с линиями с генотипом рр [13]. Выявлена так же ассоциация полиморфизма гена ERα с другими эстроген-зависимыми заболеваниями, включая эндометриоз, аденомиоз, ЛМ и т. д. [15]. Данные об ассоциации полиморфного локуса PvuII гена ERα с ЛМ немногочисленными и неоднозначны [4]. Показано, что наличие аллеля *P гена ERα является фактором риска развития миомы, эндометриоза и аденомиоза в японской популяции и миомы матки у афро-американок [15; 13]. Massart F. et al. не выявили достоверных различий в распределении частот генотипов как PvuII, так и XbaI полиморфизмов гена ERα у итальянских женщин с ЛМ и без нее [8]. Тогда как Hsieh Y.-Y. et al. показали, что наличие «мутантных» генотипов/аллелей PvuII и XbaI повышает риск развития эндометриоза и ЛМ [17]. В этой же работе делается вывод, что Alu-инсерционный полиморфизм гена PGR, ассоциирован с гиперпролактинемией, но не с ЛМ. Нами не выявлена ассоциация изученных полиморфных локусов генов рецепторов эстрогена и прогестерона с ЛМ. Однако отмечена тенденция к увеличению частоты носительства «мутантных» аллелей и генотипов по исследуемым генам у женщин с миомой по сравнению с женщинами из популяционной выборки. Возможно, дальнейшие генетические исследования позволят уточнить данные тенденции. Поиск новых генов-кандидатов, ассоциированных с ЛМ, будет способствовать внедрению методов молекулярно-генетической диагностики в профилактику и лечение гиперпластических процессов женского репродуктивного тракта.Об авторах
Наталья Сергеевна Осиновская
ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМН
Email: natosinovskaya@mail.ru
к. б. н., научный сотрудник лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней
Татьяна Эдуардовна Иващенко
ФГБУ «НИИАГ им. Д.О. Отта» СЗО РАМНд. б. н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней
Ляиля Харрясовна Джемлиханова
Санкт-Петербургский государственный университетк. м. н., доцент, медицинский факультет, кафедра акушерства, гинекологии и репродуктологии
Владислав Сергеевич Баранов
ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМНзаведующий лабораторией пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека, член-корр. РАМН, з. д. н., д. м. н., проф.
Антонина Николаевна Ткаченко
Санкт-Петербургский государственный университетстудентка, медицинский факультет
Искендер Юрьевич Султанов
ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМНлаборант лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней
Список литературы
- Антропова Е. Ю., Тухватуллина Л. М. Эмболизация маточных артерий в лечении больных миомой матки // Трудный пациент. — 2006. — № 9. — С. 33–35.
- Вихляева Е. М. Молекулярно-генетические детерминанты опухолевого роста и обоснование современной стратегии при лейомиоме матки // Вопросы онкологии. — 2001. — Т. 47, № 2–3. — С. 215–216.
- Иммуногистохимические особенности экспрессии сигнальных молекул в миометрии и эндометрии больных с сочетанными гиперпластическими процессами матки / Смирнова М. Ю. [и др.] // Науч. ведомости Белгородск. гос. ун-та. Сер. Медицина. Фармация. — 2011. — Вып. 13/1, Т. 4, № 99. — С. 11–16.
- Современные представления о молекулярно-генетических основах миомы матки / Егорова О. В. [и др.] // Медицинская генетика. — 2007. — Т. 6, №.9. — С. 11–16.
- Шиляев А. Ю. Лейомиома матки // Гинекология. — 2005. — Т. 7,№ 1. — С. 65–70.
- A novel selective progesterone receptor modulator asoprisnil (J867) inhibits proliferation and induces apoptosis in cultured human uterine leiomyoma cells in the absence of comparable effects on myometrial cells / Chen W. [et al.] // Clin. Endocrinol. Metab. — 2006. — Vol. 1, № 4. — P. 1296–1304.
- Activation of the Src/p21ras/Erk pathway by progesterone receptor via cross-talk with estrogen / Migliaccio A. [et al.] // EMBO J. — 1998. — Vol. 17. — P. 2008–2018.
- Analysis of estrogen receptor (ERalpha and ERbeta) and progesterone receptor (PR) polymorphisms in uterine leiomyomas / Massart F. [et al.] // Med. Sci. Monit. — 2003. — Vol. 9, № 1. — Р. 25–30.
- Association of 5' estrogen receptor alpha gene polymorphisms with bone mineral density, vertebral bone area and fracture risk / van Meurs J. B. [et al.] // Hum. Mol. Genet. — 2003. — Vol. 12, № 14. — Р. 1745–1754.
- Association of bone mineral density with polymorphism of the estrogen receptor gene / Kobayashi S. [et al.] // J. Bone Miner. Res. — 1996. — Vol. 11. — P. 306–311.
- BRCA2 mutations in primary breast and ovarian cancers / Lancaster J. M. [et al.] // Nature Genetics. — 1996. — Vol. 13. — P. 238–240.
- Endocrine profile associated with estrogen and progesterone receptors in leiomyoma and normal myometrium / Sadan O. [et al.] // Gynecol. Endocrinol. — 1990. — Vol. 4. — Р. 133–142.
- Estrogen metabolite 2-methoxyestradiol induces apoptosis and inhibits cell proliferation and collagen production in rat and human leiomyoma cells: a potential medicinal treatment for uterine fibroids / Salama S. A. [et al.] // J. Soc. Gynecol. Investig. — 2006. — Vol. 13, № 8. — P. 542–550
- Flake G. P., Andersen J., Dixon D. Etiology and pathogenesis of uterine leiomyomas: a review // Environ. Health. Perspect. — 2003. — Vol. 111. — P. 1037–1054.
- Oestrogen receptor-alfa gene polymorphism is associated with endometriosis, adenomyosis and leiomyomata / Kitawaki J. [et al.] // Hum. Reprod. — 2001. — Vol. 16. — P. 51–55.
- Ovarian carcinoma-associated TaqI restriction fragment length polymorphism in intron G of the progesterone receptor gene id due to an Alu sequence insertion / Rowe S. M. [et al.] // Cancer Res. — 1995. — Vol. 55. — P. 2743–2745.
- PROGINS Alu sequence insertion is associated with hyperprolactinaemia but not leiomyoma susceptibility / Hsieh Y. Y. [et al.] // Clin. Endocrinol. — 2005. — Vol. 62, № 4. — P. 492–497.
- Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. — New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. — P. 1–245.