Анализ доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов с нарушением фертильности

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Среди супружеских пар детородного возраста частота бесплодия во многих странах, в том числе и в России, достигает 15 %, то есть каждый 5–6 брак является бесплодным [1, 8]. Этиологическим фактором отсутствия беременности более чем в 50 % случаев являются нарушения мужской репродуктивной функции, при этом на долю изолированного мужского фактора приходится 25–30 %, в 20–30 % случаев заболевания выявлены у обоих супругов (сочетанный фактор) [24]. В настоящее время одними из основных критериев оценки мужской репродуктивной функции являются показатели параметров спермиологического анализа (концентрация, подвижность и доля морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте). Однако в 10–15 % случаев этиология супружеского бесплодия неизвестна (идиопатическое бесплодие) [24], что делает необходимым дальнейшее развитие лабораторных методов диагностики мужского бесплодия и оценки качества эякулята. Так, дискутируется введение в практику как одного из способов, оценивающих мужской репродуктивный потенциал, различных методов оценки целостности ДНК сперматозоида. Фрагментация ДНК сперматозоида связана с появлением одно- и двунитевых разрывов молекулы ДНК, некоторое количество которых необходимо для нормального сперматогенеза [32]. Однако при различных нарушениях сперматогенеза степень повреждения ДНК увеличивается. Описано 6 основных причин, приводящих к возникновению разрывов в ДНК: 1. Апоптоз в процессе сперматогенеза, 2. Разрывы нитей ДНК в процессе компактизации хроматина в спермиогенезе, 3. Фрагментация ДНК в процессе транспорта сперматозоидов по семенным канальцам и придатку яичка, 4. Фрагментация ДНК, вызванная активностью каспаз и эндонуклеаз, 5. Действие химио- и радиотерапии, 6. Действие факторов окружающей среды [5, 21]. Исследования показывают, что нарушение целостности ДНК сперматозоида не сказывается на его оплодотворяющей способности, однако является одной из основных причин, приводящих к остановке развития и элиминации эмбриона на ранних этапах эмбриогенеза [19, 18]. Также нарушение целостности ДНК сперматозоида оказывает влияние на первые деления дробления эмбриона, имплантацию и течение беременности [22]. Анализ современных данных позволяет связывать до 20 % случаев идиопатического бесплодия с нарушением целостности ДНК сперматозоидов [25]. Одним из методов оценки целостности ДНК сперматозоида является TUNEL (Terminal deoxynucleotidil transferase (TdT)-mediated dUTP Nick and Labelling) [22]. Данный метод позволяет детектировать одно- и двунитевые разрывы ДНК с сохранением морфологии сперматозоида, исключая, таким образом, из анализа клетки сперматогенного ряда и соматические клетки. Целью данной работы являлась оценка доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у доноров спермы и пациентов с нарушением фертильности. Исследована взаимосвязь между долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК и параметрами спермограммы (концентрацией, подвижностью, долей морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте), а также морфологическими особенностями головки сперматозоида. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Материалом для исследования служили образцы периферической крови и эякуляты от 40 пациентов с нарушением фертильности, а также образцы эякулята 7 доноров спермы. Для всех пациентов и доноров спермы проводили стандартный цитогенетический анализ кариотипа на метафазных пластинках из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови с последующим дифференциальным окрашиванием (QFH) [2]. По результатам кариотипирования выделены две группы: пациенты с нормальным мужским кариотипом (46, XY) и полиморфными вариантами хромосом 1, 3, 22 (n = 36) и носители структурных перестроек кариотипа (n = 4): 46, XY, t (6;19) (р22; q12), 46, XY, t (1;5) (p22; q32), t (6;12) (q15; q21), 46, XY, t (2;3) (q33; q29), 46, XY, der (13;14) (q10; q10). Для всех пациентов был проведен стандартный спермиологический анализ [33]. Снижение показателей концентрации, подвижности и доли морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте — олигоастенотератозооспермия — наблюдалось у 6 из 40 пациентов (15 %): 4 (66,7 %) пациентов с нормальным кариотипом и 2 — с аномалиями кариотипа (33,3 %). У 14 (35 %) пациентов отмечалось снижение доли подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов — астенотератозооспермия. Тератозооспермия (снижение доли морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте) была обнаружена у 20 пациентов (50 %): 18 (90 %) пациентов с нормальным кариотипом и 2 (10 %) — с аномалиями кариотипа. В качестве материала при проведении оценки целостности ДНК для доноров спермы использовали криоконсервированный эякулят, центрифугированный в градиенте плотности силиконовых частиц. Здоровье, возраст и параметры спермограммы доноров удовлетворяют требованиям, предъявляемых донорам согласно ВОЗ [33]. Цитологические препараты сперматозоидов из эякулята готовили по стандартной методике [2]. Для определения доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в исследуемых образцах эякулята применяли метод TUNEL с использованием dUTP, конъюгированных с флуоресцентным красителем — флуоресцеином. Флуоресцентное мечение одно- и двунитевых разрывов ДНК проводили с использование готовых наборов фирмы Roche согласно методике, рекомендуемой фирмой производителем (Roche, Germany). Для каждого анализируемого образца было посчитано 2000 сперматозоидов. Анализ распределения флуоресцентного сигнала в головках сперматозоидов проводили на микроскопах DNLS (Leica, Германия), Axioskop (Opton, Германия), оснащенных блоками светофильтров для ФИТЦ, ТРИТЦ, ДАПИ и йодистого пропидия, Axiostar plus (Zeiss, Германия). Статистический анализ данных проводили на ПК с помощью программ StatGraphics, GraphPad Software. РЕЗУЛЬТАТЫ По результатам исследования в контрольную группу вошли 5 образцов эякулята, в которых доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК варьировала от 0,15 % до 0,35 %, составляя в среднем 0,26±0,09 %, статистически достоверно не отличавшихся друг от друга (р = 0,3422). В эякуляте двух доноров спермы доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК составила 0,85 % и 1,05 % и была выше соответствующих показателей других доноров спермы (р = 0,0004), вследствие чего данные доноры в контрольную группу включены не были (табл. 1). Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в группе пациентов, в конституциональном кариотипе которых были выявлены перестройки с участием аутосом (n=4), варьировала от 0,45 % до 1,4 %, составляя в среднем 0,91 ± 0,53 % и была выше, чем в контрольной группе (р = 0,0294) (табл. 1). В эякуляте пациентов с олигоастенотератозооспермией доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК варьировала от 0,1 % до 1,4 %, составляя в среднем 0,9 ± 0,58 % и была выше, чем в контрольной группе (р = 0,0372). Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов с астенотератозооспермией варьировала от 0,25 % до 2,2 %, составляя в среднем 1,12 ± 0,56 % и была выше, чем в контрольной группе (р = 0,0041). В группе пациентов с тератозооспермией доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК варьировала в пределах от 0,1 % до 2,9 %, составляя в среднем 0,66 ± 0,64 и не отличалась от контрольной группы (р = 0,1809) (табл. 1). Между параметрами спермограммы: концентрацией, долей подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов статистически достоверной корреляции обнаружено не было. Наряду со стандартной морфологической оценкой был проведен учет морфологических особенностей головки сперматозоидов. Согласно строгому критерию Крюгера [16] выделяли следующие морфологические формы головок сперматозоидов: нормальная, с небольшой патологией, большая, сигарообразная, грушевидная, вакуолизированная, аморфная, двойная, точечная, округлая и патологии акросомы. В качестве анализируемых выбраны следующие формы патологии: вакуолизированная головка, грушевидная головка и головка с уменьшением размеров акросомы. Для анализа взаимосвязи между данными патологиями головки и целостностью генетического материала был проведен регрессионный анализ. Между долей вакуолизированных форм головок сперматозоидов в эякуляте и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК была выявлена прямая линейная корреляция средней силы (r = 0,44; p = 0,0049) (рис. 1). При анализе взаимосвязи между долей грушевидных, аморфных форм головок сперматозоидов, а также между долей сперматозоидов с аномалиями акросомы в эякуляте и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК статистически достоверной корреляции обнаружено не было. ОБСУЖДЕНИЕ Исследования последних лет, посвященные анализу частоты фрагментации ДНК в сперматозоидах у мужчин c нормозооспермией, определяют эту величину в достаточно широких пределах от 0 % и до 25 % [30, 11, 10, 15, 28]. Наблюдаемые колебания можно объяснить некоторыми объективными и субъективными причинами: различной национально-этнической принадлежностью доноров спермы, различными требованиями, предъявляемыми к их здоровью и, возможно, различным сроком полового воздержания до проведения анализа, а так же отличиями методов (TUNEL, SCSA, CometAssay) или применением различных критериев анализа. Так, при использовании метода TUNEL и микроскопического анализа особую сложность представляет собой выбор базового уровня флуоресценции головки сперматозоида. Тем не менее, большинство авторов, использующих метод TUNEL и микроскопический анализ, оценивают долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов с нормозооспермией в пределах от 0,1 % и до 4 % [7, 31, 30, 28], что вполне соответствует нашим результатам (0,26 ± 0,09 %). В настоящем исследовании в образцах эякулята двух из семи доноров спермы доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК составила 0,85 % и 1,05 % (доноры 6 и 7) и была достоверно выше соответствующих показателей у других доноров спермы, составляющих контрольную группу (табл. 1). В современной практике положительное решение о возможном донорстве эякулята принимается на основании результатов спермограммы и результатов обследования здоровья мужчины. Однако требования к отцовству предполагаемого донора не являются обязательными. Между тем, показано, что у 20 % мужчин с нормальными показателями спермограммы доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте повышена [4, 26]. Поэтому целесообразным может быть введение дополнительных методов оценки репродуктивного потенциала мужчины, участвующего в программе донорства. По мнению некоторых исследователей высокий уровень сперматозоидов с фрагментированной ДНК связан с наличием хромосомных перестроек в конституциональном кариотипе пациента [6, 29, 14]. Действительно, доля сперматозоидов в эякуляте пациентов с кариотипами 46, XY, der (13;14) (q10; q10) и 46, XY, t (2;3) (q33; q29) составила 1,4 % и 1,35 %, соответственно, и превышала показатели контрольной группы (0,26± 0,09 %) (табл. 1). Однако у двух других пациентов этой группы с кариотипами 46, XY, t (6;19) (р22; q12) и 46, XY, t (1;5) (p22; q32), t (6;12) (q15; q21) повышение частоты сперматозоидов с фрагментацией ДНК было недостоверным (0,45 %). Следует отметить, что значительное снижение стандартных параметров спермограммы (концентрации, доли подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов) наблюдается у пациентов с повышенной долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК. У пациентов с незначительным повышением сперматозоидов с поврежденной ДНК отмечена только легкая степень тератозооспермии. Действительно, некоторые исследователи находят прямую зависимость между долей сперматозоидов с поврежденной ДНК и ухудшением параметров спермиологического анализа [19]. В других работах такой зависимости обнаружено не было [27]. Таким образом, на сегодняшний день не существует единого мнения по данному вопросу. Возможно, перестройки конституционального кариотипа связаны с увеличением доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК лишь опосредованно, нарушая процессы мейоза и спермиогенеза. Однако у пациента с двумя реципрокными транслокациями в кариотипе 46, XY, t (1;5) (p22; q32), t (6;12) (q15; q21) параметры спермограммы и доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК незначительно отличались от контрольной группы. Поэтому для детального анализа данного вопроса требуются дальнейшие исследования. В нашем исследовании у пациентов с нормальным кариотипом корреляции между показателями спермиологического анализа и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК не выявлено. Тем не менее, в группах ОАТ и АТ доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК была выше относительно показателей контрольной группы. Следовательно, увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК свойственно как пациентам с нарушениями кариотипа, так и пациентам с нормальным кариотипом и сниженными показателями параметров спермограммы. У пациентов с тератозооспермией доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК статистически достоверно не отличалась от соответствующих показателей контрольной группы, однако, отмечался широкий разброс значений. По мнению ряда авторов, при тератозооспермии наблюдается увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК [13, 12, 28]. Однако особого внимания заслуживают преобладающие в эякуляте морфологические формы головок сперматозоидов, такие как, например, макроцефалические (увеличение размеров головки сперматозоида), вакуолизированные, грушевидные или другие [5, 13, 12]. Тем более, существуют данные о корреляции между некоторыми формами головок сперматозоидов и частотой гетероплоидии [17, 20, 3]. Можно предполагать, что наличие вакуолей в головке сперматозоида является следствием повреждения ДНК сперматозоида. Действительно, в нашем исследовании мы обнаружили положительную корреляцию между долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК и долей вакуолизированных форм сперматозоидов (r=0,44; P=0,0049), что подтверждается данными других исследователей [16]. По-видимому, увеличение сперматозоидов с вакуолизированной формой головки является маркером нарушения целостности ДНК сперматозоидов. Глобозооспермия, характеризующаяся преобладанием в эякуляте сперматозоидов с отсутствием или значительным уменьшением размеров акросомы, также является часто встречающейся формой патологии головки сперматозоида. Эта форма патологии вызывает особый интерес, в связи с тем, что сперматозоиды с подобными морфологическими отклонениями не способны к оплодотворению и обладают сниженным потенциалом активации ооцита. В нашем исследовании корреляции между долей сперматозоидов с аномалией акросомы и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК выявлено не было. Действительно, по некоторым данным такой зависимости не обнаруживается [9]. Хотя, по мнению ряда авторов, нарушение некоторых процессов, происходящих в сперматогенезе, например, протаминирования ДНК [12], приводит не только к появлению брешей в ДНК, но также влияет на изменение морфологии дозревающего сперматозоида, в частности, нарушает целостность акросомы [30]. Также не было обнаружено взаимосвязи между формированием грушевидной или аморфных головок и повышением доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. В заключение следует подчеркнуть, что существующие в настоящее время в клинической практике методы оценки репродуктивного потенциала мужчины имеют определенные ограничения. С помощью стандартных методов оценки фертильности не всегда точно можно определить причину бесплодия, в особенности у тех пациентов, которые имеют нормальные показатели спермиологического анализа. Развитие и внедрение в практику новых методов оценки качества сперматозоидов позволит не только точно установить причину нарушения фертильности, но и дать корректный репродуктивный прогноз. Это также позволит осветить и ряд фундаментальных вопросов, таких как, например, особенности организации генетического материала в головке сперматозоида, роль отцовского генома в процессе оплодотворения и последующем эмбриональном развитии. На основании данных о нарушении целостности ДНК сперматозоидов и взаимосвязи данного показателя с параметрами спермиологического анализа или индивидуальными морфофункциональными характеристиками сперматозоидов может быть предложен ряд рекомендаций по дополнительному молекулярно-цитогенетическому методу исследования пациентов клиник ЭКО и доноров спермы. Результаты подобных исследований будут представлять несомненную практическую значимость при выборе оптимального метода преодоления бесплодия и оценке риска рождения ребенка с наследственной патологией.

Об авторах

Евгения Михайловна Шильникова

ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН

Email: iagmail@ott.ru
аспирант, кафедра генетики и селекции, Санкт-Петербургский Государственный Университет; лаборатория пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека, отделение вспомогательных репродуктивных технологий, ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН

Ирина Дмитриевна Федорова

ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН

Email: irendf@mail.ru
к. б. н., с. н. с., старший эмбриолог, отделение вспомогательных репродуктивных технологий

Александр Мкртичевич Гзгзян

ФГБУ «НИИАГ им. Д. О. Отта» СЗО РАМН

Email: iagmail@ott.ru
доктор наук, руководитель отделения вспомогательных репродуктивных технологий

Список литературы

Дополнительные файлы