Analysis of sperm DNA fragmentationin infertility patients

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Среди супружеских пар детородного возраста частота бесплодия во многих странах, в том числе и в России, достигает 15 %, то есть каждый 5–6 брак является бесплодным [1, 8]. Этиологическим фактором отсутствия беременности более чем в 50 % случаев являются нарушения мужской репродуктивной функции, при этом на долю изолированного мужского фактора приходится 25–30 %, в 20–30 % случаев заболевания выявлены у обоих супругов (сочетанный фактор) [24]. В настоящее время одними из основных критериев оценки мужской репродуктивной функции являются показатели параметров спермиологического анализа (концентрация, подвижность и доля морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте). Однако в 10–15 % случаев этиология супружеского бесплодия неизвестна (идиопатическое бесплодие) [24], что делает необходимым дальнейшее развитие лабораторных методов диагностики мужского бесплодия и оценки качества эякулята. Так, дискутируется введение в практику как одного из способов, оценивающих мужской репродуктивный потенциал, различных методов оценки целостности ДНК сперматозоида. Фрагментация ДНК сперматозоида связана с появлением одно- и двунитевых разрывов молекулы ДНК, некоторое количество которых необходимо для нормального сперматогенеза [32]. Однако при различных нарушениях сперматогенеза степень повреждения ДНК увеличивается. Описано 6 основных причин, приводящих к возникновению разрывов в ДНК: 1. Апоптоз в процессе сперматогенеза, 2. Разрывы нитей ДНК в процессе компактизации хроматина в спермиогенезе, 3. Фрагментация ДНК в процессе транспорта сперматозоидов по семенным канальцам и придатку яичка, 4. Фрагментация ДНК, вызванная активностью каспаз и эндонуклеаз, 5. Действие химио- и радиотерапии, 6. Действие факторов окружающей среды [5, 21]. Исследования показывают, что нарушение целостности ДНК сперматозоида не сказывается на его оплодотворяющей способности, однако является одной из основных причин, приводящих к остановке развития и элиминации эмбриона на ранних этапах эмбриогенеза [19, 18]. Также нарушение целостности ДНК сперматозоида оказывает влияние на первые деления дробления эмбриона, имплантацию и течение беременности [22]. Анализ современных данных позволяет связывать до 20 % случаев идиопатического бесплодия с нарушением целостности ДНК сперматозоидов [25]. Одним из методов оценки целостности ДНК сперматозоида является TUNEL (Terminal deoxynucleotidil transferase (TdT)-mediated dUTP Nick and Labelling) [22]. Данный метод позволяет детектировать одно- и двунитевые разрывы ДНК с сохранением морфологии сперматозоида, исключая, таким образом, из анализа клетки сперматогенного ряда и соматические клетки. Целью данной работы являлась оценка доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК у доноров спермы и пациентов с нарушением фертильности. Исследована взаимосвязь между долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК и параметрами спермограммы (концентрацией, подвижностью, долей морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте), а также морфологическими особенностями головки сперматозоида. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Материалом для исследования служили образцы периферической крови и эякуляты от 40 пациентов с нарушением фертильности, а также образцы эякулята 7 доноров спермы. Для всех пациентов и доноров спермы проводили стандартный цитогенетический анализ кариотипа на метафазных пластинках из ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови с последующим дифференциальным окрашиванием (QFH) [2]. По результатам кариотипирования выделены две группы: пациенты с нормальным мужским кариотипом (46, XY) и полиморфными вариантами хромосом 1, 3, 22 (n = 36) и носители структурных перестроек кариотипа (n = 4): 46, XY, t (6;19) (р22; q12), 46, XY, t (1;5) (p22; q32), t (6;12) (q15; q21), 46, XY, t (2;3) (q33; q29), 46, XY, der (13;14) (q10; q10). Для всех пациентов был проведен стандартный спермиологический анализ [33]. Снижение показателей концентрации, подвижности и доли морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте — олигоастенотератозооспермия — наблюдалось у 6 из 40 пациентов (15 %): 4 (66,7 %) пациентов с нормальным кариотипом и 2 — с аномалиями кариотипа (33,3 %). У 14 (35 %) пациентов отмечалось снижение доли подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов — астенотератозооспермия. Тератозооспермия (снижение доли морфологически нормальных форм сперматозоидов в эякуляте) была обнаружена у 20 пациентов (50 %): 18 (90 %) пациентов с нормальным кариотипом и 2 (10 %) — с аномалиями кариотипа. В качестве материала при проведении оценки целостности ДНК для доноров спермы использовали криоконсервированный эякулят, центрифугированный в градиенте плотности силиконовых частиц. Здоровье, возраст и параметры спермограммы доноров удовлетворяют требованиям, предъявляемых донорам согласно ВОЗ [33]. Цитологические препараты сперматозоидов из эякулята готовили по стандартной методике [2]. Для определения доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК в исследуемых образцах эякулята применяли метод TUNEL с использованием dUTP, конъюгированных с флуоресцентным красителем — флуоресцеином. Флуоресцентное мечение одно- и двунитевых разрывов ДНК проводили с использование готовых наборов фирмы Roche согласно методике, рекомендуемой фирмой производителем (Roche, Germany). Для каждого анализируемого образца было посчитано 2000 сперматозоидов. Анализ распределения флуоресцентного сигнала в головках сперматозоидов проводили на микроскопах DNLS (Leica, Германия), Axioskop (Opton, Германия), оснащенных блоками светофильтров для ФИТЦ, ТРИТЦ, ДАПИ и йодистого пропидия, Axiostar plus (Zeiss, Германия). Статистический анализ данных проводили на ПК с помощью программ StatGraphics, GraphPad Software. РЕЗУЛЬТАТЫ По результатам исследования в контрольную группу вошли 5 образцов эякулята, в которых доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК варьировала от 0,15 % до 0,35 %, составляя в среднем 0,26±0,09 %, статистически достоверно не отличавшихся друг от друга (р = 0,3422). В эякуляте двух доноров спермы доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК составила 0,85 % и 1,05 % и была выше соответствующих показателей других доноров спермы (р = 0,0004), вследствие чего данные доноры в контрольную группу включены не были (табл. 1). Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в группе пациентов, в конституциональном кариотипе которых были выявлены перестройки с участием аутосом (n=4), варьировала от 0,45 % до 1,4 %, составляя в среднем 0,91 ± 0,53 % и была выше, чем в контрольной группе (р = 0,0294) (табл. 1). В эякуляте пациентов с олигоастенотератозооспермией доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК варьировала от 0,1 % до 1,4 %, составляя в среднем 0,9 ± 0,58 % и была выше, чем в контрольной группе (р = 0,0372). Доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов с астенотератозооспермией варьировала от 0,25 % до 2,2 %, составляя в среднем 1,12 ± 0,56 % и была выше, чем в контрольной группе (р = 0,0041). В группе пациентов с тератозооспермией доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК варьировала в пределах от 0,1 % до 2,9 %, составляя в среднем 0,66 ± 0,64 и не отличалась от контрольной группы (р = 0,1809) (табл. 1). Между параметрами спермограммы: концентрацией, долей подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов статистически достоверной корреляции обнаружено не было. Наряду со стандартной морфологической оценкой был проведен учет морфологических особенностей головки сперматозоидов. Согласно строгому критерию Крюгера [16] выделяли следующие морфологические формы головок сперматозоидов: нормальная, с небольшой патологией, большая, сигарообразная, грушевидная, вакуолизированная, аморфная, двойная, точечная, округлая и патологии акросомы. В качестве анализируемых выбраны следующие формы патологии: вакуолизированная головка, грушевидная головка и головка с уменьшением размеров акросомы. Для анализа взаимосвязи между данными патологиями головки и целостностью генетического материала был проведен регрессионный анализ. Между долей вакуолизированных форм головок сперматозоидов в эякуляте и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК была выявлена прямая линейная корреляция средней силы (r = 0,44; p = 0,0049) (рис. 1). При анализе взаимосвязи между долей грушевидных, аморфных форм головок сперматозоидов, а также между долей сперматозоидов с аномалиями акросомы в эякуляте и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК статистически достоверной корреляции обнаружено не было. ОБСУЖДЕНИЕ Исследования последних лет, посвященные анализу частоты фрагментации ДНК в сперматозоидах у мужчин c нормозооспермией, определяют эту величину в достаточно широких пределах от 0 % и до 25 % [30, 11, 10, 15, 28]. Наблюдаемые колебания можно объяснить некоторыми объективными и субъективными причинами: различной национально-этнической принадлежностью доноров спермы, различными требованиями, предъявляемыми к их здоровью и, возможно, различным сроком полового воздержания до проведения анализа, а так же отличиями методов (TUNEL, SCSA, CometAssay) или применением различных критериев анализа. Так, при использовании метода TUNEL и микроскопического анализа особую сложность представляет собой выбор базового уровня флуоресценции головки сперматозоида. Тем не менее, большинство авторов, использующих метод TUNEL и микроскопический анализ, оценивают долю сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте пациентов с нормозооспермией в пределах от 0,1 % и до 4 % [7, 31, 30, 28], что вполне соответствует нашим результатам (0,26 ± 0,09 %). В настоящем исследовании в образцах эякулята двух из семи доноров спермы доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК составила 0,85 % и 1,05 % (доноры 6 и 7) и была достоверно выше соответствующих показателей у других доноров спермы, составляющих контрольную группу (табл. 1). В современной практике положительное решение о возможном донорстве эякулята принимается на основании результатов спермограммы и результатов обследования здоровья мужчины. Однако требования к отцовству предполагаемого донора не являются обязательными. Между тем, показано, что у 20 % мужчин с нормальными показателями спермограммы доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК в эякуляте повышена [4, 26]. Поэтому целесообразным может быть введение дополнительных методов оценки репродуктивного потенциала мужчины, участвующего в программе донорства. По мнению некоторых исследователей высокий уровень сперматозоидов с фрагментированной ДНК связан с наличием хромосомных перестроек в конституциональном кариотипе пациента [6, 29, 14]. Действительно, доля сперматозоидов в эякуляте пациентов с кариотипами 46, XY, der (13;14) (q10; q10) и 46, XY, t (2;3) (q33; q29) составила 1,4 % и 1,35 %, соответственно, и превышала показатели контрольной группы (0,26± 0,09 %) (табл. 1). Однако у двух других пациентов этой группы с кариотипами 46, XY, t (6;19) (р22; q12) и 46, XY, t (1;5) (p22; q32), t (6;12) (q15; q21) повышение частоты сперматозоидов с фрагментацией ДНК было недостоверным (0,45 %). Следует отметить, что значительное снижение стандартных параметров спермограммы (концентрации, доли подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов) наблюдается у пациентов с повышенной долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК. У пациентов с незначительным повышением сперматозоидов с поврежденной ДНК отмечена только легкая степень тератозооспермии. Действительно, некоторые исследователи находят прямую зависимость между долей сперматозоидов с поврежденной ДНК и ухудшением параметров спермиологического анализа [19]. В других работах такой зависимости обнаружено не было [27]. Таким образом, на сегодняшний день не существует единого мнения по данному вопросу. Возможно, перестройки конституционального кариотипа связаны с увеличением доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК лишь опосредованно, нарушая процессы мейоза и спермиогенеза. Однако у пациента с двумя реципрокными транслокациями в кариотипе 46, XY, t (1;5) (p22; q32), t (6;12) (q15; q21) параметры спермограммы и доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК незначительно отличались от контрольной группы. Поэтому для детального анализа данного вопроса требуются дальнейшие исследования. В нашем исследовании у пациентов с нормальным кариотипом корреляции между показателями спермиологического анализа и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК не выявлено. Тем не менее, в группах ОАТ и АТ доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК была выше относительно показателей контрольной группы. Следовательно, увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК свойственно как пациентам с нарушениями кариотипа, так и пациентам с нормальным кариотипом и сниженными показателями параметров спермограммы. У пациентов с тератозооспермией доля сперматозоидов с фрагментированной ДНК статистически достоверно не отличалась от соответствующих показателей контрольной группы, однако, отмечался широкий разброс значений. По мнению ряда авторов, при тератозооспермии наблюдается увеличение доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК [13, 12, 28]. Однако особого внимания заслуживают преобладающие в эякуляте морфологические формы головок сперматозоидов, такие как, например, макроцефалические (увеличение размеров головки сперматозоида), вакуолизированные, грушевидные или другие [5, 13, 12]. Тем более, существуют данные о корреляции между некоторыми формами головок сперматозоидов и частотой гетероплоидии [17, 20, 3]. Можно предполагать, что наличие вакуолей в головке сперматозоида является следствием повреждения ДНК сперматозоида. Действительно, в нашем исследовании мы обнаружили положительную корреляцию между долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК и долей вакуолизированных форм сперматозоидов (r=0,44; P=0,0049), что подтверждается данными других исследователей [16]. По-видимому, увеличение сперматозоидов с вакуолизированной формой головки является маркером нарушения целостности ДНК сперматозоидов. Глобозооспермия, характеризующаяся преобладанием в эякуляте сперматозоидов с отсутствием или значительным уменьшением размеров акросомы, также является часто встречающейся формой патологии головки сперматозоида. Эта форма патологии вызывает особый интерес, в связи с тем, что сперматозоиды с подобными морфологическими отклонениями не способны к оплодотворению и обладают сниженным потенциалом активации ооцита. В нашем исследовании корреляции между долей сперматозоидов с аномалией акросомы и долей сперматозоидов с фрагментированной ДНК выявлено не было. Действительно, по некоторым данным такой зависимости не обнаруживается [9]. Хотя, по мнению ряда авторов, нарушение некоторых процессов, происходящих в сперматогенезе, например, протаминирования ДНК [12], приводит не только к появлению брешей в ДНК, но также влияет на изменение морфологии дозревающего сперматозоида, в частности, нарушает целостность акросомы [30]. Также не было обнаружено взаимосвязи между формированием грушевидной или аморфных головок и повышением доли сперматозоидов с фрагментированной ДНК. В заключение следует подчеркнуть, что существующие в настоящее время в клинической практике методы оценки репродуктивного потенциала мужчины имеют определенные ограничения. С помощью стандартных методов оценки фертильности не всегда точно можно определить причину бесплодия, в особенности у тех пациентов, которые имеют нормальные показатели спермиологического анализа. Развитие и внедрение в практику новых методов оценки качества сперматозоидов позволит не только точно установить причину нарушения фертильности, но и дать корректный репродуктивный прогноз. Это также позволит осветить и ряд фундаментальных вопросов, таких как, например, особенности организации генетического материала в головке сперматозоида, роль отцовского генома в процессе оплодотворения и последующем эмбриональном развитии. На основании данных о нарушении целостности ДНК сперматозоидов и взаимосвязи данного показателя с параметрами спермиологического анализа или индивидуальными морфофункциональными характеристиками сперматозоидов может быть предложен ряд рекомендаций по дополнительному молекулярно-цитогенетическому методу исследования пациентов клиник ЭКО и доноров спермы. Результаты подобных исследований будут представлять несомненную практическую значимость при выборе оптимального метода преодоления бесплодия и оценке риска рождения ребенка с наследственной патологией.

About the authors

Evgeniya Michailovna Shilnikova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology NWD RAMS

Email: iagmail@ott.ru
PhD student, department of genetics and breeding, Saint-Petersburg State University; department of artificial redproductive technologies, D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology NWD RAMS

Irina Dmitrievna Fedorova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology NWD RAMS

Email: irendf@mail.ru
PhD, senior Researcher, embryologist, department of artificial redproductive technologies

Alexander Mkrtichevich Gzgzyan

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology NWD RAMS

Email: iagmail@ott.ru
Full Doctor, the head of the department of of artificial redproductive technologies

References

Supplementary files