The method of stem cells obtaining from menstrual blood

Abstract

The article describes a technique of stem cells isolation from menstrual blood. The characteristics of the obtained stem cells line also present

Full Text

Введение В последние годы в терапии многих заболеваний, в том числе неизлечимых прежде, открываются новые перспективы благодаря технологиям клеточной терапии [8, 13, 21, 24, 28, 32]. Стволовые клетки — это недифференцированные клетки-предшественницы, способные развиваться при определенных условиях в клетки практически любых тканей взрослого организма. Именно это фундаментальное свойство стволовых клеток успешно используется в клинической практике уже около 40 лет [18, 19, 27]. Важным для практического применения является деление стволовых клеток по происхождению на эмбриональные и соматические. Эмбриональные стволовые клетки плюрипотентны, т. е. способны развиваться в клетки-производные любого зародышевого листка. По своим пролиферативным характеристикам эмбриональные стволовые клетки превосходят любые другие [3]. Главными недостатками эмбриональных стволовых клеток является их генетическая нестабильность в культуре и доказанная онкогенность [10, 16]. Соматические стволовые клетки обнаруживаются во многих тканях взрослого организма и по способности к дифференцировке являются уни- или мультипотентными (однонаправленными или способными развиваться в клетки разных типов в пределах одного зародышевого листка). Преимуществами соматических стволовых клеток являются более доступные источники их получения, меньший онкогенный потенциал, возможность аутодонорства клеток. В настоящее время существуют отработанные схемы по выделению субпопуляций стволовых клеток из разных тканей, их культивированию in vitro в целях экспансии клеточного материала, а также коррекции их дифференцировки в заданном направлении. Эндометриальные стволовые клетки исследуются с 2004 года [9, 15]. В 2007 году стволовые клетки эндометрия были выделены из менструальной крови, что дало новый толчок к их изучению [11, 22, 23]. По своим характеристикам эндометриальные стволовые клетки относятся к клеткам с преобладанием свойств мезенхимальных стволовых клеток [6, 15]. В настоящее время исследования стволовых клеток, выделенных из менструальной крови, направлены на поиск новых факторов, определяющих специфическую дифференцировку, и точек приложения терапевтического потенциала этих клеток. Методика Для получения клеточного продукта на основе стволовых клеток, выделенных из менструальной крови, нами использована методика, разработанная в Институте цитологии РАН [2, 4]. Забор менструальной крови производился у женщин репродуктивного возраста (n = 5) на 2–3 день менструального цикла. Перед процедурой забора менструальной крови проводилось комплексное обследование женщин с целью оценки состояния микробиоценоза половых путей и исключения персистенции инфекций, передающихся половым путем. Менструальную кровь собирали в асептических условиях с помощью урогенитального зонда типа С (внутриматочный Пайпель). Вакуум-аспирация содержимого полости матки проводилась при положении канюли зонда в области внутреннего зева шейки матки. Полученный материал (1–2 мл от каждого донора) транспортировался при температуре 4 °С в фосфатно-солевом буфере PBS (Phosphate buffered saline; pH 7,4) c добавлением цитрата натрия и смеси антибиотик-антимикотик. После центрифугирования клеточный осадок ресуспензировался в PBS с добавлением смеси антибиотика и антимикотика и инкубировался в течение часа при температуре 37 °С. Далее клетки переносились в 6-см чашки Петри и культивировались в среде DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12; Gibco, США), содержащей 10 % бычьей эмбриональной сыворотки, 1 % смеси антибиотика и антимикотика, 1 % глутамакса. В ростовой среде часть клеток проявили повышенную способностью к адгезии к поверхности культуральных сосудов; другие клетки удалялись при смене среды. Культуры с наибольшим количеством адгезивных клеток использовались для получения клеточных линий. С целью криоконсервации стволовые клетки отделяли от поверхности культуральных емкостей с помощью 0,05 % раствора трипсина c EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid; Gibco, Invitrogen, USA), помещали в культуральную среду и центрифугировали со скоростью 1 750 об/ мин в течение 5 мин. Далее клетки ресуспензировали в бычьей эмбриональной сыворотке, содержащей 10 % раствор DMSO (dimethylsulfoxide; Fluka, Buchs, Switzerland), переносили в криовиалы и замораживали в жидком азоте со скоростью 1 °С/ мин с последующим хранением в жидком азоте. При размораживании ампулу с клетками быстро нагревали в водяной бане при 37 °С, по каплям добавляли теплую ростовую среду, переносили в пробирку и центрифугировали при 1 750 об/ мин в течение 5 мин. Отмытые от DMSO клетки сеяли во флаконы и культивировали на описанной среде DMEM/F12. Дальнейшие пересевы с целью изучения свойств клеток после криоконсервации также проводили с помощью смеси трипсин-EDTA 2 раза в неделю. Для подтверждения принадлежности выделенных клеток к стволовым были определены их способности к пролиферации in vitro и экспрессии специфических клеточных маркеров, а также возможность к дифференцировке в различные клеточные типы. Результаты исследования Общепринято, что стволовые клетки эндометриального происхождения представляют собой неоднородный пул клеток, включающий в себя как эпителиальный, так и стромальный компоненты [14, 15]. В нашем исследовании клетки с повышенными адгезивными свойствами, выделенные из менструальной крови, на ранних этапах культивирования морфологически были представлены гетерогенной популяцией клеток, состоящей из фибробластоподобных клеток и эпителиальных клеток (рис. 1). При последующих пассажах селективным преимуществом обладали фибробластоподобные (стромальные) клетки (рис. 2). Основной характеристикой стволовых клеток и, соответственно, критерием, определяющим принадлежность к стволовым клеткам, является пролиферативный потенциал [5]. Выделенные нами клетки характеризуются высокой скоростью пролиферации: время удвоения в экспоненциальной фазе роста составило 22−23 ч. Старение культуры соматических стволовых клеток происходит по истечению определенного, специфичного для каждого вида стволовых клеток количества удвоений. Процесс старения проявляется в виде замедления пролиферации и нередко спонтанной трансформации ряда клеточных клонов [2, 14, 29]. Культуры клеток, выделенные нами из менструальной крови, прошли более 45 циклов удвоений от момента ввода их в культуру до старения. При этом кариотип исследуемых клеток на разных пассажах, в том числе и при длительном культивировании, сохранял свой нормальный количественный состав. Другой основной характеристикой стволовых клеток является экспрессия специфических маркеров, как правило, поверхностных. Проточная цитофотометрия использовалась в качестве метода верификации стволовых клеток по их маркерам. Данный метод показал, что выделенные из менструальной крови стволовые клетки экспрессируют следующие поверхностные молекулы: CD13, CD29, CD44, CD73, CD90, CD105. При этом маркеры гемопоэтических стволовых клеток СD 34 и CD45, CD19, CD130 и HLA-DR (класса II) на поверхности исследуемых клеток обнаружены не были (табл. 1). Полученная характеристика стволовых клеток, выделенных из менструальной крови, соответствует критериям Международного общества клеточной терапии для фенотипирования мезенхимальных стволовых клеток человека по экспрессии поверхностных маркеров [17]. Обязательным свойством стволовых клеток является их мультипотентность, т. е. способность спонтанно или под действием определенных внешних стимулов дифференцироваться в несколько клеточных типов в пределах одного зародышевого листка. Полученные культуры стволовых клеток эндометриального происхождения дифференцировались в адипоциты и остеобласты. Эффективность адипогенной и остеогенной дифференцировки составила соответственно 70−80 % и 30%. Применение стволовых клеток в клинической практике предполагает их значительный клеточный объем. Но процессы старения и возможный феномен спонтанной трансформации ограничивают использование клеток, находящихся на поздних этапах культивирования. Таким образом, возникает необходимость сохранения стволовых клеток после первых пассажей и их идентификации. Криоконсервация стволовых клеток на ранних пассажах позволяет накопить требующуюся биомассу без потери их свойств. Длительное культивирование эндометриальных стволовых клеток, прошедших процедуры криоконсервации и последующего размораживания, показало их высокую жизнеспособность, пролиферативную активностью и неизменную морфологию. Размороженные эндометриальные стволовые клетки также сохраняли характерную фенотипическую экспрессию поверхностных маркеров. Обсуждение результатов К стволовым клеткам, как фундаментальной основе клеточных технологий, предъявляют многочисленные требования. Получение соматических стволовых клеток должно быть безопасным для донора, технически не сложным и экономически доступным. Ткань взрослого человека, используемая в качестве источника стволовых клеток, должна содержать большое количество искомых стволовых клеток. Возобновляемость источника соматических стволовых клеток и, соответственно, возможность повторного донорства и аутодонорства могут быть дополнительными достоинствами. Менструальная кровь в рамках описанных требований является уникальным источником стволовых клеток. Выделенные нами из менструальной крови стволовые клетки по своей характеристике близки к мезенхимальным стволовым клеткам взрослых. При этом легкодоступность и безопасность получения являются не единственными их преимуществами. Менструальная кровь содержит относительно большое количество стволовых клеток в объеме ткани. Так, доля колониеобразующих единиц среди мононуклеаров костного мозга составляет 0,0005 %; 0,25 % клеток липоаспирата обладают клоногенным потенциалом; в пуповинной крови доля стволовых клеток составляет около 0,000059 % [1]. В ткани же эндометрия до 0,22 % эпителиальных клеток и до 1,25 % стромальных клеток обладают стволовыми свойствами [9]. Эндометриальные стволовые клетки обладают высоким пролиферативным потенциалом. Стандартное число удвоений эндометриальных стволовых клеток в культуре составляет 25−30, в отдельных случаях — до 68 [11, 23]. Результаты нашего исследования подтверждают эти данные. Наиболее хорошо изученные мезенхимальные стволовые клетки пуповинной крови и костного мозга обладают меньшими пролиферативными возможностями [11, 22]. Самым строгим требованием, которое предъявляется к стволовым клеткам, претендующим на использование в клинической практике, является доказанное отсутствие феномена трансформации клеток. Отдельные описания случаев генетической нестабильности мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и жировой ткани [20, 30] являются основанием для осторожного использования продуктов на основе этих клеток в терапевтических целях. Изменения кариотипа эндометриальных стволовых клеток в процессе культивирования не описано [26]. В исследованиях на животных, посвященных безопасности использования стволовых клеток эндометриального происхождения, туморогенной активности выявлено не было [7, 13, 26]. В настоящее время стволовые клетки, выделенные из менструальной крови, активно используются лабораториями всего мира для изучения биологических свойств и терапевтических возможностей стволовых клеток [6, 12, 25]. Преимущества эндометриальных стволовых клеток перед соматическими стволовыми клетками другого происхождения способствуют их внедрению в клиническую практику [13, 31].