Интегральная оценка маркеров локального инфекционно-воспалительного процесса у женщин с преждевременными родами при многоплодной беременности

Полный текст

Введение

Проблема преждевременных родов (ПР) при многоплодной беременности приобрела статус одного из наиболее важных направлений в современном акушерстве. Приоритетность вопроса в первую очередь обусловлена мировой тенденцией роста частоты многоплодия. Преждевременные роды в силу преобладания в категории осложнений и значимости последствий считают ведущим фактором неблагоприятных исходов [1, 2]. На долю недоношенных детей приходится 60–70 % случаев ранней неонатальной смертности, 50 % всех установленных неврологических заболеваний. При этом треть ПР связана с индукцией родов, вызванной осложнениями со стороны матери и/или плодов, тогда как остальные происходят спонтанно [3].

Спонтанные ПР — «большой акушерский синдром», характеризующийся многофакторной природой. Известно, что основной вклад в его развитие вносят такие этиологические факторы, как уменьшение рецепции прогестерона, шеечный фактор, сосудистые расстройства, нарушение материнско-плодовой толерантности, плацентарная недостаточность. При многоплодии к наиболее значимым причинам ПР можно отнести перерастяжение матки, специфические осложнения многоплодной беременности, такие как фето-фетальный синдром, селективная задержка развития одного плода и др. [4–7].

Достаточно сложной, а в ряде случаев и невыполнимой, является задача по определению ведущей причины ПР. В большинстве исследований было показано, что при одноплодной беременности в качестве таковой могут выступать инфекционно-воспалительные процессы нижних органов генитального тракта (40 %) [7–9]. В то же время при многоплодной беременности нет достаточных данных о доли вклада воспаления в полиэтиологический процесс реализации ПР. Недостаточно изучены также пути распространения инфекции (преобладание восходящего или гематогенного пути), возбудители, инициирующие каскад реакций иммунного ответа (патогенные, условно-патогенные микроорганизмы), механизмы, приводящие к ПР.

На сегодняшний день хорошо известно, что воспалительные процессы играют важную роль в развитии родовой деятельности: ремоделировании шейки матки в процессе ее созревания, разрыве плодных оболочек и возникновении регулярных маточных сокращений. Представлено большое число данных, что к началу родовой деятельности в амнионе, хорионе, децидуальной оболочке нарастает число провоспалительных цитокинов, простагландинов. В шейке матки возрастают субпопуляции лейкоцитов, макрофагов, нейтрофилов. Полагают, что изменение соотношения про- и противовоспалительных цитокинов в сторону снижения последних вырабатывалось эволюционно с целью активации воспалительного процесса, необходимого для физиологического родового акта [7, 9].

Общепризнано, что в течении беременности воспалительный ответ на внедрение инфекционных агентов может воспроизводить данную модель реакций, приводящих к досрочному началу родовой деятельности. Микробная инвазия, инициируя воспалительную реакцию со стороны амниотического эпителия плодных оболочек и пуповины, может способствовать выработке провоспалительных цитокинов, хемокинов, простагландинов, которые в свою очередь становятся триггером маточной сократительной активности, укорочения шейки матки, разрыва плодных оболочек и, как следствие, ПР [5–7].

При многоплодной беременности, которая в большинстве случаев наступает в результате применения ВРТ (70 %) и часто сопровождается осложненным течением, в процессе прегравидарной подготовки и антенатального наблюдения особо тщательно контролируют и корректируют локальные инфекционно-воспалительные процессы. Несмотря на это, сохраняющийся высокий показатель ПР при многоплодной беременности (около 54 %) свидетельствует о неоднозначности представления о подавляющей роли инфекционного фактора в индукции ПР при многоплодии. Изучение степени вклада воспалительных процессов в многофакторные механизмы реализации — важный аспект не только с позиции возможности их идентификации в качестве предикторов и мишеней для воздействия, но и общего понимания генеза ПР при многоплодной беременности.

Материалы и методы

В данное проспективное когортное исследование было включено 30 многоплодных беременных, которые поступили в ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» с диагнозом «угрожающие преждевременные роды». Критериями включение в исследования послужили: беременность дихориальной диамниотической двойней, наличие клинических проявлений угрожающих ПР при сроке гестации 22–36 нед. (29,4 ± 2,1).

Всем беременным была выполнена комплексная оценка качественного и количественного состава микроорганизмов отделяемого нижних отделов генитального тракта посредством микроскопического, бактериологического, молекулярно-биологического исследований (тест «Фемофлор-16») и идентифицирован показатель локального воспалительного статуса по соотношению профилей экспрессии генов иммунного ответа при помощи тест-системы «ИммуноКвантэкс».

Микроскопическое исследование. Проводили микроскопическое исследование отделяемого урогенитального тракта с оценкой микробиоценоза при окраске препаратов метиленовым синим и по Граму. В вагинальном отделяемом оценивали соотношение полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) к клеткам плоского эпителия (ЭК), лактобациллы в соотношении с другими микроорганизмами, ключевые клетки, дрожжеподобные грибы, трихомонады, в цервикальном отделяемом — клетки цилиндрического эпителия, клетки плоского эпителия, ПМЯЛ, слизь, внутриклеточные и внеклеточные грамотрицательные диплококки.

Бактериологическое исследование. Микроорганизмы выделяли с помощью стандартных питательных сред для грамположительных и грамотрицательных бактерий. Выделенные микроорганизмы идентифицировали методом масс-спектрометрии на бактериологическом анализаторе MALDI ToF MS (Bruker, Германия).

Молекулярно-биологическое исследование. С помощью тест-системы «Фемофлор-16» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) исследовали отделяемое нижних отделов генитального тракта методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с количественной оценкой условно-патогенных микроорганизмов, Lactobacillus spp. и определением общей бактериальной массы. При интерпретации результатов рассчитывали количественное соотношение Lactobacillus spp. и общей бактериальной массы, на основании чего делали заключение о состоянии микробиоценоза: 1) Lactobacillus spp. >80 % — состояние нормоценоза, характеризующееся доминированием нормофлоры; 2) Lactobacillus spp. от 80 до 20 % — умеренный дисбиоз; 3) Lactobacillus spp. <20 % — выраженный дисбиоз.

Посредством тест-системы «ИммуноКвантэкс» согласно инструкции производителя (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) определяли показатели локального воспалительного статуса по соотношению профилей экспрессии генов иммунного ответа. Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК» (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). После выделения суммарного пула ДНК и РНК проводили реакцию обратной транскрипции для получения с матрицы мРНК, комплементарной ДНК, которую в дальнейшем амплифицировали методом полимеразной цепной реакции. После этапа амплификации по показателю индикаторного цикла рассчитывали уровень экспрессии мРНК 8 генов врожденного иммунитета (IL-1B, IL-10, IL-18, TNFα, TLR4, GATA3, CD68, B2М). На основе интегральной оценки полученных уровней экспрессии генов делали вывод о наличии или отсутствии локальной воспалительной реакции по величине индекса воспаления. Значение индекса воспаления больше 60 % считали как воспаление, менее 50 % — как отсутствие воспалительной реакции, диапазон 50–60 % означал, что воспалительную реакцию исключить нельзя (серая зона).

Лабораторные исследования были проведены после получения биоматериала от всех беременных (коррекцию на основании полученных результатов не проводили). После получения данных об исходах беременностей результаты исследования были оценены и проанализированы. В зависимости от срока гестации на момент родов и типа родоразрешения были сформированы группы сравнения. Женщины со спонтанными ПР (13) составили основную группу, со срочными родами (16) — контрольную. Женщины с индуцированными по медицинским показаниям ПР (2) не были включены в сравнительный анализ. Результаты их тестирования описаны только при характеристике данных.

Статистический анализ

Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи программы STATISTICA ver.10. Для анализа качественных признаков применяли критерий хи-квадрат Пирсона (χ²). Если число ожидаемого признака было меньше 10 при анализе четырехпольных таблиц, использовали критерий хи-квадрат (χ²) с поправкой Йейтса; при частотах меньше 5 — двусторонний точный критерий Фишера (p). При нормальном распределении количественных данных результаты представляли в виде средней арифметической и среднеквадратичного отклонения (M ± σ), достоверность рассчитывали при помощи критерия Стьюдента (t). При отсутствии нормального распределения вычисляли медиану с указанием межквартильного интервала Мe (L – H) и критерий Манна – Уитни (U).

Разработана математическая модель вероятности реализации ПР, основанная на интегральной оценке маркеров локального воспалительного процесса по уровню мРНК генов врожденного иммунитета в эпителиальных клетках нижних отделов репродуктивного тракта. Для выявления прогностической ценности исследованных параметров, вывода формулы расчета вероятности и проверки работы алгоритма выполнен линейный дискриминантный анализ. Для всех видов анализа за статистически достоверные были приняты значения p < 0,05.

Результаты исследования

При микроскопическом исследовании отделяемого влагалища и цервикального канала определен ряд особенностей состояния микробиоценоза органов генитального тракта у женщин при преждевременных и срочных родах.

При исследовании вагинальных выделений примерно в половине случаев как при спонтанных, так и при преждевременных родах по отношению ПМЯЛ к ЭК было отмечено воспаление (ПМЯЛ > ЭК). Однако статистически значимых отличий по данному показателю в группах установлено не было (p > 0,05).

По количеству лактобацилл (Lactobacillius spp.) и их соотношению с другими микроорганизмами существенные различия между группами также отсутствовали (p > 0,05). Только лактобациллы или превалирование лактобацилл было обнаружено у 84,4 % беременных. У остальных 15,6 % женщин лактобациллы или отсутствовали, или присутствовали в меньшинстве. В обеих группах псевдомицелий был определен в единичных пробах (4,65 %), «ключевые» клетки, трихомонады, не были выявлены.

При исследовании отделяемого цервикального канала в группе женщин с преждевременными родами достоверно чаще в сравнении с группой контроля была определена воспалительная реакция, характеризующаяся количеством лейкоцитов более 10 в поле зрения светового микроскопа при увеличении ×1000 (53,9 и 31,3 % соответственно, р = 0,033) и содержанием слизи (73,9 и 26,1 %, р = 0,026).

При бактериологическом исследовании отделяемого цервикального канала было выявлено наличие таких микроорганизмов, как Lactobacillius spp., Gardnerella vaginalis, Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Enterococcus faecalis, Corynebacterium spp., Klebsiella spp., Candida spp.

В группе женщин с ПР реже выделялись лактобациллы, но чаще условно-патогенные микроорганизмы. В основной группе Lactobacillius spp. были выявлены у 15,4 %. В группе женщин, беременность которых закончилась срочными родами, лактобациллы были выделены у 32,5 %, но различия не были достоверны (p > 0,05).

В основной группе частота выделения Enterococcus faecalis была в 2 раза выше по сравнению с группой контроля, но различия не были статистически значимыми (23,1 и 12,5 %) (p > 0,05).

По частоте выделенных Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Candida spp. группы были сопоставимы и достоверно не отличались между собой (p > 0,05). Corynebacterium spp. не были идентифицированы при микробиологическом исследовании, но были обнаружены посредством молекулярно-биологического исследования (полимеразная цепная реакция в режиме реального времени), что определяет необходимость применять методы идентификации генитальных инфекций в совокупности.

При молекулярно-биологическом исследовании с использованием тест-системы «Фемофлор-16» (оценка особенностей состояния микробиоценоза влагалища в исследуемых группах посредством множественного анализа) установлено, что в группе ПР частота дисбиотических нарушений и степень их выраженности по сравнению с группой контроля были выше (p = 0,029).

У женщин, беременность которых закончилась ПР, частота физиологического микробиоценоза влагалища была несколько ниже (76,9 %), чем у беременных, у которых произошли срочные роды (87,5 %). При оценке дисбиоза влагалища отмечено, что для пациенток контрольной группы характерна более легкая форма нарушений микробиоценоза — умеренный анаэробный дисбиоз (12,5 %), у пациенток, беременность которых закончилась спонтанными преждевременными родами, умеренный дисбиоз не встречался. В группе ПР наблюдались более выраженные нарушения микробиоценоза влагалища: выраженный анаэробный дисбиоз в 15,38 % случаев и выраженный аэробный дисбиоз в 7,69 %. При срочных родах выраженные дисбиотические нарушения отсутствовали (см. рисунок).

 

Характеристика состояния микробиоценоза влагалища у беременных в исследуемых группах (* p < 0,05)

Characteristics of vaginal microbiocenosis in the study groups (* p < 0.05)

 

В контрольной группе количество Lactobacillius spp., входящих в состав микрофлоры влагалища при беременности, соответствовало физиологическому показателю в 100 % (16) случаев, в то же время в основной группе физиологический микробиоценоз зарегистрирован в 69 % (9) случаев. Медиана количества лактобацилл в основной группе была достоверно ниже и составила 5,0 ГЭ/образец, в то время как при срочных родах — 6,8 ГЭ/образец (p = 0,0019). По частоте факультативно-анаэробных микроорганизмов (бактерии семейства Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp.) межгрупповые различия отсутствовали (p > 0,05). В основной группе определялись облигатно-анаэробные микроорганизмы (Lachnobacterium spp./Clostridium spp. и Peptostreptococcus spp.) с частотой — 7,69 % (1), в контрольной группе эти микроорганизмы не идентифицированы. Группа микроорганизмов Snethia spp./Leptotrichia spp./Fusobacterium spp. не выявлена ни в одной из исследуемых групп. Частота обнаружения Ureaplasma (urealyticum + parvum) достоверно не отличалась в основной и контрольной группах (46,15 и 31,3 %, р > 0,05) (табл. 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Состав микробиоты влагалища у женщин в основной и контрольной группах

Vaginal microbiota composition in the study groups

Состав микробиоты	Преждевременные роды, % (абс.) (n = 13)	Срочные роды, % (абс.) (n = 16)	p-value
Нормофлора
Lactobacillius spp.	69,2 (9)	100 (16)	0,0019
Факультативно-анаэробные микроорганизмы
Enterobacteriaceae	30,8(4)	18,8 (3)	0,68
Streptococcus spp.	30,8 (4)	18,8 (3)	0,46
Staphylococcus spp.	53,9 (7)	43,8 (7)	0,96
Облигатно-анаэробные микроорганизмы
Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia /Porphyromonas spp.	38,5 (5)	37,5 (6)	0,84
Eubacterium spp.	30,8 (4)	50,0 (8)	0,54
Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp.	15,4 (2)	18,8 (3)	0,84
Lachnobacterium spp./Clostridium spp.	7,7 (1)	0	0,29
Mobillincus spp./Corynebacterium spp.	7,7 (1)	18,8 (3)	0,49
Peptostreptococcus spp.	7,69 (1)	0	0,29
Atopobium vaginae	15,38 (2)	25,0 (4)	0,55
Дрожжеподобные грибы
Candida spp.	0	12,5 (2)	0,21
Микоплазмы
Mycoplasma hominis	38,5 (5)	0	0,0085
Ureaplasma (urealyticum + parvum)	46,2 (6)	31,3 (5)	0,84

Примечание. Полужирным шрифтом выделены достоверные значения при p < 0,05.

 

Существовали достоверные различия в группах женщин по выявлению Mycoplasma hominis: в основной группе M. hominis обнаружены в 38,5 % случаев (5), медиана количества этого микроорганизма составила 0,92 ГЭ/образец, в контрольной группе эти микроорганизмы не были обнаружены ни в одном случае (p = 0,0085).

Оценка состояния локального иммунного статуса у женщин с дихориальной двойней. С целью оценки наличия и степени выраженности локального воспаления у беременных дихориальной двойней проведен тест «ИммуноКвантэкс», основанный на определении профиля экспрессии мРНК 8 генов врожденного иммунитета в эпителиальных клетках нижних отделов репродуктивного тракта и 4 показателя их соотношений (табл. 2).

 

Таблица 2 / Table 2

Средние значения показателей локального иммунного статуса у женщин в исследуемой когорте

Mean values of local immune status parameters in the study cohort

Показатель, lg ГЭ/мл	M ± σ	Min	Max
IL-1B	5,0 ± 1,2	2,1	7,0
IL-10	2,3 ± 1,3	0	5,1
IL-18	4,6 ± 1,3	1,4	6,3
TNFα	3,1 ± 1,3	0	5,1
TLR4	2,5 ± 1,5	0	4,6
GATA3	3,7 ± 1,5	0	5,7
CD68	4,3 ± 1,6	0	6,1
B2M	4,9 ± 1,5	1,3	6,9
TLR4/GATA3	0,9 ± 2,1	0	9,2
TNFα/IL-18	0,6 ± 2,3	0	13
IL-10/IL-18	238,9 ± 1162,8	0	6498
IL-1B/CD68	13,5 ± 24,7	0	90,5
Индекс воспаления, %	33,5 ± 44,0	0	100

 

Среди всех обследованных медиана уровня экспрессии гена, который кодирует IL-1b, являющегося важным посредником воспалительного ответа, составил 5,2 lg ГЭ/мл. Одним из ингибиторов клеточного иммунитета служит IL-10, значение экспрессии гена данного интерлейкина было равно 2,4 lg ГЭ/мл. Уровень IL-18, обладающего плейотропными эффектами в иммунном ответе, составил 4,9 lg ГЭ/мл.

Уровень экспрессии гена, кодирующего TNFα — белок острой фазы воспаления, составил 3,2 lg ГЭ/мл. Уровень экспрессии TL-R4, определяющего первую линию местной антибактериальной защиты, соответствовал 2,7 lg ГЭ/мл, транскрипционного фактора GATA3 — 4,1 lg ГЭ/мл. Величина экспрессии гена, кодирующего CD68, играющего важную роль в фагоцитарной активности клеточных макрофагов, была равна 4,7 lg ГЭ/мл. Уровень экспрессии гена, кодирующего B2M, связанного с увеличением активности иммунной системы, составил 5,5 lg ГЭ/мл.

Соотношение параметров: TLR4/GATA3 — 0,04 lg ГЭ/мл, TNFα/IL-18 — 0,02 lg ГЭ/мл, IL-10/IL-18 — 2,1 lg ГЭ/мл, IL-1B/CD68 — 2,8 lg ГЭ/мл. По соотношению уровней экспрессии мРНК генов про- и противовоспалительных цитокинов рассчитывали индекс воспаления, медиана составила 3,3 %. При индексе воспаления менее 50 % тест расценен как отрицательный: сделано заключение об отсутствии воспаления в 58 % случаев. При индексе 50–60 % («серая зона») достоверная оценка локального иммунного статуса была невозможна в 3 % случаев, а при индексе больше 60 % тест определен как положительный — констатировано наличие локальных воспалительных процессов в 26 %.

Оценить значение индекса воспаления в 13 % случаев не представилось возможным ввиду уровня экспрессии B2M ниже критического значения (не менее 4 lg ГЭ/мл), определяющего валидность теста. Было отмечено, что все пациентки с «сомнительными» тестами родили преждевременно. Дальнейший анализ показал, что у 28,57 % (8) пациенток, у которых в пробе уровень экспрессии B2M составил менее 4 lg ГЭ/мл, произошли спонтанные ПР. Уровень экспрессии гена, кодирующего B2M, достоверно отличался в группе ПР, медиана была значимо ниже (4,5 lg ГЭ/мл) в сравнении со срочными родами (6,0 lg ГЭ/мл, p = 0,035).

В группе ПР по сравнению со срочными родами также выявлено достоверное снижение экспрессии большинства генов, в том числе IL-1B, TNFα, TLR4, GATA3 (табл. 3).

 

Таблица 3 / Table 3

Показатели теста «ИммуноКвантэкс» у пациенток в сравниваемых группах

ImmunoQuantex test values in the study groups

Показатель, lg ГЭ/мл	Преждевременные роды (n = 13)		Срочные роды (n = 16)		p-value
	M ± σ	min–max	M ± σ	min–max
IL-1B	4,4 ± 1,3	2,1–6,2	5,5 ± 1,0	3,9–7,0	0,034
IL-10	2,2 ± 1,5	0–5,1	2,2 ± 1,2	0–3,7	>0,05
IL-18	4,4 ± 1,5	1,4–6,3	4,9 ± 0,6	2,3 ± 6,1	>0,05
TNFα	2,5 ± 1,5	0–4,3	3,8 ± 0,9	2,1–5,1	0,024
TLR4	1,7 ± 1,6	0–4,1	3,2 ± 1,0	1,9–4,6	0,048
GATA3	3,1 ± 1,7	0–5,2	4,5 ± 1,0	1,9–5,7	0,023
CD68	3,6 ± 1,9	0–5,9	5,0 ± 0,84	3,2–6,1	0,077
B2M	4,3 ± 1,7	1,3–6,7	5,7 ± 0,79	4,2–6,9	0,035
TLR4/GATA3	0,9 ± 2,0	0–7,5	1,0 ± 2,6	0,001–9,2	>0,05
TNFα/IL-18	1,0 ± 3,3	0–13,0	0,2 ± 0,26	0,009–0,81	>0,05
IL-10/IL-18	84,2 ± 169,1	0–649,8	14,2 ± 35,8	0–125	>0,05
IL-1B/CD68	10,5 ± 19,3	0–64	13,5 ± 24,5	0,25–78,8	>0,05
Индекс воспаления, %	31,6 ± 44,3	0–100	37,7 ± 45,8	0–100	>0,05

Примечание. Полужирным шрифтом выделены достоверные значения при p < 0,05.

 

При ПР медиана экспрессии гена IL-1B — провоспалительного цитокина, являющегося важным медиатором воспалительного ответа, индуцирующего синтез простагландинов, активацию нейтрофилов, выработку антител, составила 4,6 lg ГЭ/мл, а при срочных родах — 5,8 lg ГЭ/мл (p = 0,064).

Отмечено относительное снижение экспрессии гена TNFα, являющегося многофункциональным провоспалительным цитокином, синтезируемым в основном моноцитами и макрофагами, оказывающим значительное влияние на функционирование эндотелия, стимуляцию продукции IL-1, IL-6, IL-8, интерферона-гамма, активацию лейкоцитов. Медианный уровень экспрессии TNFα у пациенток с ПР составил 2,8 lg ГЭ/мл, в то время как у женщин со срочными родами — 4,35 lg ГЭ/мл (р = 0,024).

Сходные данные получены при анализе экспрессии генов рецепторов, определяющих первую линию естественной локальной защиты, при внедрении патогенных микроорганизмов — TLR4: медиана была достоверно ниже при ПР и составила 1,7 lg ГЭ/мл, при срочных родах — 3,7 lg ГЭ/мл (р = 0,048).

Экспрессия гена фактора транскрипции GATA3, регулирующего экспрессию спектра генов, участвующих в развитии воспалительных и аллергических реакций, была также достоверно ниже при ПР в сравнении со срочными родами (3,8 и 4,9 lg ГЭ/мл; р = 0,023).

При ПР также наблюдалась тенденция к снижению уровня CD68 — гликопротеина, играющего важную роль в фагоцитарной активности тканевых макрофагов, как во внутриклеточном лизосомальном метаболизме, так и во внеклеточных взаимодействиях клетка – клетка и клетка – патоген. У пациенток, родивших досрочно, уровень экспрессии CD68 составил 4,2 lg ГЭ/мл, у родивших при доношенном сроке — 5,4 lg ГЭ/мл (р = 0,077), что не согласовывается с данными литературы о преобладании провоспалительных факторов при ПР.

Не были получены статистически значимые различия в уровнях экспрессии генов таких регуляторных про- и противовоспалительных цитокинов, как IL-18 и IL-10, выполняющих множественные плейотропные функции в иммунорегуляции и воспалении. При ПР уровни экспрессии генов IL-18 и IL-10 составили 4,9 и 2,3 lg ГЭ/мл, при срочных родах — 5,5 и 3,1 lg ГЭ/мл (p > 0,05). При помощи различных статистических методов также не было выявлено достоверных различий в группах по параметрам соотношения TLR4/GATA3, TNFα/IL-18, IL-10/IL-18, IL-1B/CD68 (p > 0,05).

Сравниваемые группы не отличались и по индексу воспаления, рассчитанному по разнице данных соотношений (p > 0,05). При интерпретации теста как «воспалительного» пробы достоверно отличались от «невоспалительных» по относительному снижению уровня экспрессии генов IL-18 — 4,0 и 5,2 lg ГЭ/мл (р = 0,015), тенденции к снижению уровня экспрессии GATA3 — 3,3 и 4,4 lg ГЭ/мл (р = 0,055) и повышению TLR4 — 3,5 и 2,5 lg ГЭ/мл (р = 0,055).

По соотношению факторов положительные тесты, определившие наличие воспаления, достоверно отличались от отрицательных относительно более высокими показателями TLR4/GATA3 — 3,11 и 0,04 (р = 0,0001), TNFα/IL-18 — 2,13 и 0,05 (р = 0,0002), IL-1B/CD68 — 39,8 и 4,9 (р = 0,0004).

Прогностическая модель вероятности реализации преждевременных родов при многоплодии

На основании полученных данных выстроена прогностическая модель вероятности реализации ПР при многоплодной беременности по уровню мРНК генов врожденного иммунитета в эпителиальных клетках нижних отделов репродуктивного тракта.

Для выявления прогностической ценности исследованных параметров, вывода формулы для расчета вероятности ПР и проверки работы алгоритма его прогнозирования использован линейный дискриминантный анализ.

Значения дискриминантных функций рассчитывали по следующим формулам:

F = –151,299 + 45,199 ∙ X – 11,166 ∙ Y – – 45,49 ∙ Z – 64,028 ∙ M + 10,267 ∙ K – – 71,962 ∙ L + 129,403 ∙ S + 5,985 ∙ R;

F₁ = –153,151 + 45,155 ∙ X – 11,123 ∙ Y – – 45,375 ∙ Z – 63,212 ∙ M + 11,983 ∙ K – – 72,564 ∙ L + 129,102 ∙ S + 5,209 ∙ R,

где F — вероятность преждевременных родов; F₁ — вероятность срочных родов; Х — уровень экспрессии гена IL-1B; Y — уровень экспрессии гена IL-10; Z — уровень экспрессии гена TNFα; M — уровень экспрессии гена TLR4; K — уровень экспрессии гена GATA3; L — уровень экспрессии гена CD68; S — уровень экспрессии гена B2M; R — уровень экспрессии гена IL-18; при F < F₁ прогнозируют ПР, при F < F₁ — срочные роды (табл. 4).

 

Таблица 4 / Table 4

Параметры функции в модели вероятности реализации преждевременных родов при многоплодии

Function parameters in the probability model of preterm birth in multiple pregnancies

Показатели	Обозначение показателя	Коэффициенты
		преждевременные роды	срочные роды
IL-1B	Х	45,199	45,155
IL-10	Y	–11,166	–11,123
TNFα	Z	–45,49	–45,375
TLR4	M	–64,028	–63,212
GATA3	K	10,267	11,983
CD68	L	–71,962	–72,564
B2M	S	129,403	129,102
IL-18	R	5,985	5,209
	Constant	–151,299	–153,151

 

При проверке данной формулы программа относила пациенток в группу с вероятным развитием ПР в 100 % случаев. Вероятность срочных родов программа определила верно в 86,7 % случаев. В 13,3 % получен ложноположительный результат по ПР.

При расчете по указанной формуле, если вероятность по контролю (срочным родам) меньше, чем вероятность по ПР, то с вероятностью 100 % можно предположить, что у данной пациентки произойдут спонтанные ПР. Если вероятность по контролю больше, чем по ПР, то с вероятностью 86,7 % можно предположить, что у данной пациентки произойдут срочные роды.

Обсуждение

В исследовании впервые были оценены характеристики состояния микробиоценоза влагалища и локального иммунного статуса у женщин с многоплодной беременностью и ПР. Обращало внимание, что в целом у беременных исследуемой когорты выявлен низкий инфекционно-воспалительный статус, но нарушения биотопа влагалища с относительно большей частотой встречались в группе ПР.

Микроскопическая картина микробиоценоза влагалища и цервикального канала у женщин с ПР характеризовалась достоверно большим содержанием лейкоцитов и слизи по сравнению с пациентками, родившими на доношенном сроке. Более выраженная степень лейкоцитарной реакции в основной группе может отражать как активизацию мукозального иммунитета, так и процессы ремоделирования шейки матки (отхождение «слизистой пробки») [8].

При определении спектра микроорганизмов в составе микробиоты влагалища при бактериологическом исследовании Enterococcus faecalis в группе ПР выделяли в 2 раза чаще, чем в группе контроля, но различия не были достоверны. Известно, что колонизация E. faecalis урогенитального тракта беременных, как правило, не имеет значимых последствий, но избыточное количество этих микроорганизмов может быть ассоциировано с такими осложнениями беременности, как ПР, хроническая плацентарная недостаточность, гипотрофия плодов [9].

При молекулярно-биологическом исследовании в группе ПР был достоверно чаще в сравнении с контрольной группой обнаружен дисбиоз влагалища, выражающийся в незначительном количестве или полном отсутствии лактобацилл в составе микробиоценоза влагалища [6, 10, 11]. Общепризнано, что лактобациллы имеют большое значение для поддержания нормального микробиоценоза влагалища за счет высокой конкуренции и антагонизма по отношению к большинству патогенных и условно-патогенных бактерий [11]. При отсутствии лактобацилл создаются благоприятные условия для активации микроорганизмов, проявляющих патогенные свойства. Возникающее в ответ воспаление становится триггером преждевременной сократительной маточной активности, повышение уровня протеолитических ферментов может приводить к укорочению шейки матки, досрочному разрыву плодных оболочек [12, 13].

У беременных с ПР в составе микробиоты влагалища была выявлена Mycoplasma hominis, которая у женщин, родивших на доношенном сроке, не была идентифицирована ни в одном случае. Mycoplasma hominis, как известно, играет значимую роль в генезе невынашивания беременности на всех сроках гестации [14, 15]. Микоплазменные мембранные структуры способны активировать макрофаги и моноциты, повышая секрецию основных провоспалительных цитокинов, особенно фактора некроза опухолей α, интерлейкинов (IL-1, IL-1b, IL-6, IL-8, IL-12, IL-16), интерферона-гамма, вызывая локальные воспалительные процессы, вносящие значимый вклад в инициацию ПР [16–18].

В настоящем исследовании впервые проанализировано состояние локального иммунного статуса у женщин с дихориальной двойней по профилю экспрессии мРНК генов IL-1B, IL-10, IL-18, TNFα, TLR4, GATA3, CD68, B2M. В ходе исследования было установлено значимое снижение экспрессии генов IL-1B, TNFα, TLR4, GATA3 у женщин, родивших преждевременно, по сравнению с женщинами контрольной группы. Многомерный факторный анализ позволил охарактеризовать взаимосвязь данных параметров со сроком родов как прямо пропорциональную: чем ниже был уровень экспрессии данных маркеров, тем срок родов был меньше.

Исследователи, получившие в своих работах аналогичные данные при одноплодной беременности, сходятся во мнении, что наиболее большое значение имеет не повышение экспрессии этих генов, а дисбаланс в сторону уменьшения содержания провоспалительных цитокинов, который и приводит к ПР [19–22]. Такие данные объясняются гипореактивным состоянием локального иммунитета, определяющим благоприятные условия для восходящей инфекции и развития хориоамнионита, являющегося важным патогенетическим звеном в механизмах реализации ПР.

В то же время стоит отметить, что особенность более ранних исследований заключалась в изолированном определении содержания воспалительных маркеров без комплексной оценки локального иммунитета. В настоящем исследовании впервые была сформирована математическая модель, основанная на интегральной оценке параметров локального иммунного статуса. Полученные результаты показали как важность комплексной оценки локальных воспалительных процессов для понимания многофакторных механизмов реализации ПР при многоплодной беременности, так и возможность прогнозирования ПР посредством данной модели с высокой эффективностью (86,7 %).

Заключение

Оценка маркеров инфекционно-воспалительных процессов ПР является важным аспектом не только с целью идентификации этих маркеров в качестве предикторов и мишеней воздействия, но и с целью понимания патогенеза ПР при многоплодии.

В соответствии с полученными результатами маркерами ПР при многоплодной беременности могут служить повышение уровня лейкоцитов в цервикальном канале более 10 в поле зрения при микроскопическом исследовании шеечного отделяемого, дисбиоз влагалища (снижение числа лактобацилл), наличие в составе микробиоценоза влагалища генитальных микоплазм, выявленных с помощью метода полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Изученные показатели экспрессии мРНК генов врожденного иммунитета (IL-1B, IL-10, IL-18, TNFα, TLR4, GATA3, CD68, B2M) во влагалище (метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) и разработанная на основании интегральной оценки полученных данных математическая модель (вероятность — 87,6 %) продемонстрировали перспективность их оценки с целью прогнозирования ПР при многоплодной беременности.

В свою очередь общий низкий воспалительный профиль в исследуемой когорте, в том числе снижение экспрессии мРНК генов IL-1B, TNFα, TLR4, GATA3 в отделяемом влагалища, обусловливает необходимость дальнейших исследований для изучения степени вклада инфекционно-воспалительных факторов в механизмы развития ПР при многоплодии и поиска маркеров других путей их реализации.

Об авторах

Ольга Владимировна Косякова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Автор, ответственный за переписку.
Email: for.olga.kosyakova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-4116-0222
SPIN-код: 1204-3160

аспирант отделения патологии беременности № 1

Россия, Санкт-Петербург

Олеся Николаевна Беспалова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»

Email: shiggerra@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6542-5953
SPIN-код: 4732-8089

д-р мед. наук, заместитель директора по научной работе

Россия, Санкт-Петербург

Ольга Викторовна Будиловская

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»; ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Email: o.budilovskaya@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7673-6274
SPIN-код: 7603-6982

научный сотрудник лаборатории микробиологии

Россия, Санкт-Петербург

Алевтина Михайловна Савичева

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта»; ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России

Email: savitcheva@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3870-5930
SPIN-код: 8007-2630

д-р мед. наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заведующая лабораторией микробиологии; заведующая кафедрой клинической лабораторной диагностики факультета послевузовского и дополнительного профессионального образования

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы