Особенности цитокинового профиля у беременных с угрозой самопроизвольного выкидыша на фоне дисбиоза кишечника

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Во время беременности кишечная микробиота у женщин претерпевает ряд структурных и функциональных изменений, обусловленных перестройкой эндокринной и иммунной систем, а также некоторыми анатомическими особенностями из-за увеличения объема матки. В результате замедления перистальтики кишечника, снижения тонуса гладкой мускулатуры кишечной стенки, желчного пузыря и желчевыводящих путей увеличивается экспозиция кишечного содержимого в терминальных отделах толстой кишки, что приводит к размножению и активации условно-патогенной микрофлоры (УПМ) [1–3]. Складываются условия для поступления в системный кровоток эндотоксина, являющегося липополисахаридом наружной клеточной мембраны грамотрицательных бактерий, что может вызывать сложный иммунный и воспалительный ответ как за счет непосредственного деструктивного воздействия на клеточные мембраны, так и опосредованно — через индукцию цитокинового каскада.

Известно, что во время беременности в иммунной системе происходит переключение иммунного ответа, опосредованного Т-хелперами 1-го типа (Th1), на иммунный ответ, опосредованный Т-хелперами 2-го типа (Th2) [4, 5]. Активация Th1 приводит к продукции провоспалительных цитокинов — фактора некроза опухоли альфа (ФНО-α) и интерлейкинов (ИЛ): ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, которые стимулируют пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов и активируют макрофаги, участвуя в воспалительных и иммунных реакциях [6]. Th2 вырабатывают противовоспалительные цитокины — ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-13, которые подавляют процессы отторжения эмбриона и обеспечивают нормальную инвазию трофобласта, предотвращая воспалительные и тромботические вторичные реакции на трофобласт [7, 8].

При системной эндотоксинемии у беременной путем последовательных патобиохимических реакций (рис. 1) избыточно вырабатываются провоспалительные цитокины, которые активируют апоптоз клеток трофобласта и разрушение эндотелия сосудов посредством ингибирующего влияния на продукты ростовых факторов, чрезмерной цитотоксической активации натуральных киллеров и фагоцитарной активности макрофагов в эндометрии и децидуальной ткани [9, 10].

 

Рис. 1. Механизм влияния бактериального эндотоксина на матку

 

Они также усиливают выработку протромбиназы, активацию коагуляционных механизмов и снижают антикоагулянтную и фибринолитическую активность крови, в результате чего в сосудах трофобласта образуются тромбы. Поражение трофобласта и эндотелия сосудов вызывает выработку антифосфолипидных антител и анти-ДНК-антител, формирование специфического цитотоксического иммунного ответа против антигенов плода [4, 7, 11, 12].

Повышенное количество провоспалительных цитокинов способствует усилению выработки простагландинов в амнионе и децидуальной оболочке, что приводит к стимуляции сокращений матки, десквамации децидуальной оболочки и прерыванию беременности.

Таким образом, наряду с известными причинами невынашивания беременности, источником системной эндотоксинемии и, как следствие, одной из причин осложненного течения беременности может служить дисбактериоз кишечника [13]. Исследование данного вопроса является актуальным научным направлением, результаты которого могут найти широкое применение в клинической практике.

Цель — изучить особенности цитокинового профиля у женщин с угрозой прерывания беременности и его зависимость от состояния микробиоценоза кишечника и уровня эндотоксинемии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 87 женщин в возрасте от 18 до 43 лет (средний возраст — 28 ± 0,5 года) в сроке беременности от 6 до 22 нед. Основную группу составили 50 женщин, госпитализированных в гинекологическое отделение клиники акушерства и гинекологии Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова с угрозой прерывания беременности. В контрольную группу вошли 37 женщин с нормально протекающей беременностью, состоявшие на учете по беременности в женской консультации клиники акушерства и гинекологии. Проведение научной работы одобрено независимым этическим комитетом при Военно-медицинской академии.

Критериями исключения при отборе пациенток являлись: беременность, наступившая в результате применения вспомогательных репродуктивных технологий; беременность, протекающая на фоне подтвержденных генетических, анатомических, эндокринных, иммунологических и тромбофилических факторов риска невынашивания беременности; наличие у беременных инфекций, в том числе передаваемых половым путем; многоплодная беременность; острые воспалительные заболевания; обострение экстрагенитальной патологии.

Оценку качественного и количественного состава кишечной микрофлоры всем беременным проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. Из числа комменсальных микроорганизмов в исследовании определяли Bacteroides spp., Prevotella spp. (тип Bacteroidetes), Parabacteroides spp., Clostridium leptum group (включает Faecalibacterium prausnitzi и некоторые виды Eubacterium и Ruminococcus, тип Firmicutes), Blautia spp., Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Akkermansia spp. и Methanobrevibacter spp. Из условно-патогенных видов микроорганизмов были исследованы Campylobacter spp., Clostridium dif., Enterobacter spp., Streptococcus spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp.

Степень нарушения кишечной микрофлоры оценивали по классификации, основанной на бактериологическом методе исследования и утвержденной приказом МЗ РФ от 9 июня 2003 г. № 231, с учетом актуальной информации о видовом составе кишечного микробиоценоза, а также рабочей инструкции по исследованию микробиоты толстой кишки методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени «Колонофлор» (РФ, РУ № РЗН 2019/9479).

I (легкая) степень — дефицит представителей нормобиоты (снижение количества микроорганизмов на один порядок), количество УПМ < 104/л;

II (умеренная) степень — наличие УПМ (>104 но <106/л) при дефиците нормобиоты (при снижении менее чем на два порядка);

III (тяжелая) степень — избыточный рост УПМ (>106/л) при выраженном дефиците нормобиоты (при снижении более чем на два порядка).

С целью оценки возможного системного влияния дисбактериоза кишечника на организм беременной у 62 женщин (32 женщины из основной группы и 30 из контрольной) был изучен уровень эндотоксинемии. Кровь исследовали с использованием метода газовой хроматографии — масс-спектрометрии [14]. Результаты эндотоксинемии оценивали в соответствии с классификацией J. Marshall (2004). Показатель эндотоксина от 0 до 0,39 нмоль/мл считали низким, от 0,4 до 0,59 нмоль/мл — повышенным, от 0,6 до 1,0 нмоль/мл — высоким.

У 50 из обследованных женщин (30 из основной и 20 из контрольной группы) определяли цитокиновый статус: содержание ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-10 в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (Вектор-Бест-Балтика, Россия) на иммунохимическом анализаторе LisaScan EM (Erba Mannheim, Германия). Для исследования проводили взятие венозной крови натощак в утренние часы.

Статистический анализ данных выполняли с помощью программного пакета IBM SPSS Statistics 22 (Armonk, NY, США). В работе использовали методы вариационной статистики с дифференцированной оценкой и методы статистического анализа в зависимости от типа распределения признаков в выборках. Различия считали статистически значимыми при определении вероятности 95 % (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка кишечной микрофлоры методом ПЦР в режиме реального времени подтвердила диагноз дисбактериоза кишечника у 100 % обследованных беременных.

У пациентов основной группы в 30 % (n = 15) наблюдений был выявлен дисбактериоз кишечника I степени, у 46 % (n = 23) — II степени, у 24 % (n = 12) — III степени. В то же время у пациентов контрольной группы были обнаружены нарушения в составе кишечной микрофлоры, соответствовавшие преимущественно I степени дисбактериоза — 67,6 % (n = 25) и, в меньшем количестве, II степени — 32,4 % (n = 12), случаев тяжелого дисбиоза выявлено не было. Различия между относительными величинами в обеих группах были статистически значимыми при сравнении групп по количеству случаев дисбактериоза I степени: χ2 = 12; df = 1; p < 0,001 и III степени: χ2 = 10,3; df = 1; p = 0,01.

При изучении качественного и количественного состава кишечной микрофлоры у пациентов основной группы установлено статистически значимое снижение числа представителей нормофлоры кишечника (Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp.) по сравнению с контрольной группой, а также отмечена статистически значимая высокая концентрация УПМ. Микробиологические нарушения кишечной флоры в контрольной группе характеризовались преимущественно снижением интенсивности колонизации толстой кишки нормофлорой относительно референсных значений.

Анализ результатов исследования крови методом газовой хроматографии — масс-спектрометрии показал, что средний уровень эндотоксина в сыворотке крови у беременных основной группы составил 0,57 ± 0,02 нмоль/мл и классифицировался как «повышенный». Уровень липополисахаридов в сыворотке крови у беременных контрольной группы составил 0,34 ± 0,02 нмоль/мл, характеризуясь как «низкий» (рис. 2). Межгрупповые различия были статистически значимы (U = 51,5; Z = –4,7; p < 0,001).

 

Рис. 2. Средний уровень эндотоксинемии у беременных в сравниваемых группах

 

Наблюдалась прямая сильная корреляционная связь (r = 0,8; p < 0,001) между степенью дисбактериоза кишечника и уровнем эндотоксинемии, что связано с выраженными нарушениями кишечного микробиоценоза за счет значимо большего количества микроорганизмов с высоким патогенным потенциалом.

В результате анализа уровня цитокинов в сыворотке крови (табл. 1) установлено, что в основной группе существовали изменения цитокинового баланса, характеризовавшиеся статистически значимым повышением концентрации провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β — 4,9 ± 1,6 пг/мл, ИЛ-6 — 4,8 ± 1,5 пг/мл) на фоне более низких показателей противовоспалительного ИЛ-10 (18,04 ± 4,5 пг/мл) по сравнению с группой контроля (1,8 ± 0,2; 2,1 ± 0,2; 30,3 ± 4,4 пг/мл соответственно).

 

Таблица 1. Показатели цитокинового профиля у беременных основной и контрольной групп

Показатель	Основная группа(n = 30)	Контрольная группа(n = 20)	Уровень статистической значимости(критерий Манна – Уитни)
ИЛ-1β, пг/мл	4,9 ± 1,6	1,8 ± 0,2	U = 86; Z = –3,6; p < 0,001*
ИЛ-6, пг/мл	4,8 ± 1,5	2,1 ± 0,2	U = 148; Z = –2,5; p = 0,012*
ИЛ-10, пг/мл	18,04 ± 4,5	30,3 ± 4,4	U = 180; Z = –1,7; p = 0,08

 

На основании сравнительного анализа соотношений про- и противовоспалительных цитокинов отмечено смещение баланса в сторону продукции противовоспалительных цитокинов у пациенток обеих групп, что имеет благоприятное прогностическое значения для исхода беременности. Соотношение ИЛ-10/ИЛ-1β у пациенток основной группы в среднем составило 7,7 ± 2,0, ИЛ-10/ИЛ-6 — 5,9 ± 1,7, у пациенток контрольной группы — 10,75 ± 2,7 и 9,9 ± 2,5 соответственно.

При оценке корреляционных взаимосвязей между показателями эндотоксина и цитокинов в сыворотке крови у обследованных женщин выявлена статистически значимая средняя по силе положительная связь с провоспалительными цитокинами и слабая отрицательная связь с противовоспалительным ИЛ-10 (см. табл. 2).

 

Таблица 2. Корреляционные взаимосвязи между показателями эндотоксина и интерлейкинов у женщин исследованных групп

Пары признаков		Коэффициент ранговой корреляцииСпирмена	Уровень статистической значимости, p
Эндотоксин	ИЛ-1	0,51	0,025*
Эндотоксин	ИЛ-6	0,55	0,017*
Эндотоксин	ИЛ-10	–0,3	0,17
ИЛ-1	ИЛ-6	0,92	<0,001*
ИЛ-6	ИЛ-10	0,2	0,2
ИЛ-1	ИЛ-10	0,05	0,8

 

Обращает на себя внимание положительная корреляционная взаимосвязь между про- и противовоспалительными интерлейкинами. Согласно данным М.А. Левкович, при патологическом течении гестационного периода увеличивается содержание иммуносупрессорных интерлейкинов в ответ на повышение уровня провоспалительного медиатора с целью подавления его синтеза [15]. Наоборот, снижение уровня интерлейкинов, продуцируемых Th2, на фоне избыточной продукции провоспалительных цитокинов является неблагоприятным прогностическим признаком для дальнейшего развития беременности, что свидетельствует о глубоких нарушениях процессов имплантации и плацентации [16].

ОБСУЖДЕНИЕ

Большое количество научных исследований посвящено поиску возможных причин осложнений гестационного периода. После того как была изучена и доказана связь между течением беременности и изменениями в иммунной системе, многие работы были направлены на рассмотрение именно этого аспекта.

Г.Н. Чистякова и соавт. установили, что критерием угрозы прерывания беременности в раннем сроке может являться повышение уровня провоспалительных цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-8) на фоне снижения уровня цитокинов противовоспалительного действия (ИЛ-4 и ИЛ-10) [17].

Такие же данные получили Е.Н. Кравченко, А.В. Мишутина: при угрозе прерывания беременности содержание ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-2, интерферонов ИНФ-α и ИНФ-γ в сыворотке крови увеличивалось в различной степени по сравнению с аналогичными величинами при физиологической беременности [12].

Наше исследование подтверждает вышеизложенные данные: отмечено статистически значимое повышение концентрации провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β и ИЛ-6) на фоне более низких значений противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10) у беременных с угрожающим самопроизвольным выкидышем по сравнению с женщинами с нормально протекающей беременностью.

Во многих научных работах отражено, что индуктором системного воспалительного ответа и, соответственно, активатором провоспалительных цитокинов у беременных может быть эндотоксин.

К.Р. Бондаренко и соавт. доказали, что патологическое течение гестационного процесса может быть в определенной мере обусловлено эндотоксин-индуцированной активацией клеток моноцитарно-макрофагальной системы, а изменение цитокинового статуса характеризовалось нарушением соотношения оппозиционных пулов в сторону повышения провоспалительных цитокинов. При этом было выявлено, что уровень эндотоксина положительно коррелировал как с провоспалительными цитокинами, так и с противовоспалительными [18].

По данным А.Н. Еникеева, увеличение концентрации липополисахаридов в системном кровотоке является определяющим фактором при патологическом течении беременности. Причину системной эндотоксинемии автор объясняет увеличением внутрибрюшного давления, которое приводит к венозному стазу и усилению отека желудочно-кишечного тракта, что может привести к ишемическим повреждениям слизистой оболочки кишечника. Выявленные в результате работы корреляционные взаимосвязи между показателями эндотоксинемии и цитокинов свидетельствуют в пользу участия липополисахаридов в патогенезе осложнений гестационного периода с вовлечением медиаторов воспаления [19].

С.Ф. Субханкулова оценивала уровень эндотоксина у беременных, страдающих запорами: его повышенный уровень — 1,53 ± 0,1 EU/мл (более чем в два раза по сравнению со здоровыми беременными — 0,65 ± 0,005 EU/мл, р < 0,05) был обусловлен дисбиозом кишечника и ассоциировался с осложненным течением гестационного периода [20].

По результатам нашего исследования, средний уровень эндотоксинемии у беременных с угрожающим самопроизвольным выкидышем был значимо выше (0,57 ± 0,02 нмоль/мл) по сравнению с таковым у женщин с нормально протекающей беременностью (0,34 ± 0,02 нмоль/мл, р < 0,001). При этом наблюдалась прямая сильная корреляционная связь между уровнем эндотоксинемии и степенью дисбактериоза кишечника (r = 0,8; p < 0,001), а также с уровнем провоспалительных интерлейкинов (r = 0,5; p < 0,05). Учитывая полученные данные, можно сделать вывод, что эндотоксинемия, возникающая в результате нарушения микрофлоры кишечника у беременных и активирующая иммунную систему по провоспалительному типу, действительно может служить пусковым фактором в патогенезе невынашивания беременности.

ВЫВОДЫ

1. Дисбактериоз кишечника был диагностирован у 100 % обследованных беременных, при этом у женщин с осложненным течением гестационного периода отмечались наиболее выраженные дисбиотические изменения кишечной микрофлоры. У 30 % пациенток с угрожающим самопроизвольным выкидышем был диагностирован дисбактериоз кишечника I степени, у 46 % — II степени, у 24 % — III степени, в то время как в контрольной группе дисбиотические изменения соответствовали преимущественно I (67,6 %) и II (32,4 %) степеням, а случаев тяжелого дисбактериоза выявлено не было. Различия между относительными величинами в обеих группах явились статистически значимыми (р < 0,05).
2. Средний уровень эндотоксинемии у беременных основной группы был статистически значимо (p < 0,001) выше (0,54 ± 0,02 нмоль/мл) по сравнению с контрольной группой (0,35 ± 0,02 нмоль/мл). Выявлена прямая сильная корреляционная связь (r = 0,8; p < 0,001) между степенью дисбактериоза кишечника и уровнем эндотоксинемии, что вызвано выраженными нарушениями в составе кишечного микробиоценоза за счет значимо большего количества микроорганизмов с высоким патогенным потенциалом.
3. Обнаружено статистически значимое повышение концентрации провоспалительных цитокинов (ИЛ-1â и ИЛ-6) на фоне более низких значений противовоспалительных цитокинов (ИЛ-10) у беременных с угрожающим самопроизвольным выкидышем по сравнению с женщинами с нормально протекающей беременностью. Установлена прямая корреляционная связь средней силы (r = 0,5; p < 0,05) между уровнем эндотоксина и концентрацией провоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови.

Об авторах

Александр Александрович Безменко

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: bezmenko@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2837-1260

канд. мед. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Наталья Дмитриевна Садовая

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Автор, ответственный за переписку.
Email: nataliacrimea@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3362-4402
SPIN-код: 7063-7367

врач

Россия, Санкт-Петербург

Марина Евгеньевна Мешкова

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: meshkova.63@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0694-8586
SPIN-код: 6465-3776

канд. биол. наук, старший преподаватель кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики

Россия, Санкт-Петербург

Елена Анатольевна Малахова

Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова

Email: elena196419@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-9825-0408
SPIN-код: 7136-7795

преподаватель кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы