Evaluation of the content and the pathogenetic role of cytokines in the peritoneal fluid in patients with deep infiltrative endometriosis

Full Text

Введение

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) — это прогрессирующее заболевание, которое характеризуется разрастанием эктопического эндометрия за пределами его нормальной локализации на фоне гиперэстрогенемии. Для глубокого инфильтративного эндометриоза (ГИЭ) характерна инвазия эндометриоидного очага (инфильтрата) в различные, чаще подлежащие, ткани и органы на глубину более 5 мм. В последние годы отмечена тенденция к увеличению доли инфильтративных форм генитального эндометриоза. Основными клиническими проявлениями заболевания являются: синдром хронических тазовых болей, а также перименструальные кровянистые выделения, наблюдающиеся более чем у 82 % больных. У пациенток с ГИЭ в 10–30 % случаев отмечается также самопроизвольное прерывание беременности, чаще в I триместре [1]. Все вышеперечисленное приводит к социальной и психологической дезадаптации, уменьшению сексуальной активности пациенток, что отражается в достоверном снижении качества жизни. Значимой проблемой ГИЭ также является рецидивирующий характер заболевания и резистентность к известным схемам гормономодулирующей терапии [1].

Одно из ключевых звеньев патогенеза ГИЭ — неэффективность различных компонентов иммунной системы как на системном, так и на локальном уровне, проявляющаяся в снижении цитотоксической активности NK-клеток [2], нарушении процессов пролиферации и апоптоза, неоангиогенеза [3] и росте соединительной ткани. За развитие воспалительной реакции при ГИЭ могут отвечать провоспалительные цитокины ИЛ-2, ИЛ-6, за контроль над ней — регуляторные цитокины ИЛ-10, ИЛ-33 [4]. Важную роль в патогенезе ГИЭ могут играть также хемокины, ответственные за привлечение иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления — MCP-1 (моноцитарный хемотаксический протеин-1) и IP-10 (интерферон-гамма-индуцированный белок) [5]. За усиленный синтез и пролиферацию соединительной ткани отвечают ростовые факторы FGF (фактор роста фибробластов) и TGF-β (трансформирующий фактор роста — субъединица β). Последний также играет роль регуляторного цитокина, ограничивающего интенсивность иммунных реакций.

Таким образом, актуальной задачей является оценка содержания и роли вышеуказанных цитокинов в патогенезе ГИЭ с целью поиска способов преодоления иммунологических нарушений для эффективного купирования клинических проявлений и увеличения длительности безрецидивного периода.

Материалы и методы

В рамках проведенной работы было обследовано 120 женщин с НГЭ III и IV стадий (по классификации R-AFS), находившихся на обследовании и лечении в отделениях оперативной гинекологии и гинекологической эндокринологии НИИ АГиР имени Д.О. Отта в период 2013–2016 гг.

Критерии включения:

1)     возраст 18–45 лет;

2)     верифицированный интраоперационно диагноз глубокого инфильтративного эндометриоза, подтвержденный гистологическим исследованием.

Критерии исключения:

1)       пациентки с декомпенсацией хронических соматических заболеваний;

2)       пациентки с острыми или обострением хронических инфекционных заболеваний;

3)       пациентки с миомой матки.

Для оценки тяжести НГЭ и распространенности спаечного процесса была использована пересмотренная классификация Американского общества фертильности RAFS и классификация F. Tuttlies et al. [2].

Контрольную группу составили 20 пациенток, у которых перед проведением процедуры ЭКО на основании интраоперационного обследования не было обнаружено гинекологических заболеваний. Причиной проведения ЭКО в данном случае был мужской фактор бесплодия.

Во время проведения хирургического вмешательства и до начала оперативного пособия у пациенток забиралась перитонеальная жидкость для определения ее цитокинового состава.

Определение цитокинов перитонеальной жидкости проводилось в отделе иммунологии и межклеточных взаимодействий ФГБНУ «НИИ АГиР имени Д.О. Отта» (руководитель лаборатории засл. деятель науки РФ, д-р мед. наук проф. С.А. Сельков). Определение содержания ИЛ-33 проводилось при помощи иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью тест-систем Becton Dickinson (USA). Методом проточной цитофлуометрии в формате СВА с использованием проточного цитофлюориметра Fax Canto II (Becton Dickinson, USA) и тест-систем (Human IL-2, IL-6, IL-10, IP-10, MCP-1, FGF, TGF-β Flex Set, BD Bioscience, USA) определяли ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10, IP-10, MCP-1 и факторы роста — FGF, TGF-β в перитонеальной жидкости.

Результаты

У больных с ГИЭ было обнаружено снижение в перитонеальной жидкости уровня ИЛ-2 в 2 раза по сравнению с группой контроля и составившее в единицах СИФ (средняя интенсивность флуоресценции) 37,4 ± 0,5 и 77,1 ± 0,9 соответственно. Уровень ИЛ-6 был повышен у пациенток с ГИЭ в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой и составил 49,5 ± 8,9 и 33,1 ± 4,9 пкг/мл соответственно.

У пациенток с ГИЭ уровень ИЛ-10 в перитонеальной жидкости был снижен в 6,7 раза по сравнению с женщинами без НГЭ и составил в единицах СИФ 11,5 ± 4,8 и 76,8 ± 2,2 соответственно.

Был отмечен повышенный уровень ИЛ-33 у пациенток с ГИЭ, особенно у больных с болевым синдромом средней интенсивности, — его уровень составил 87,6 ± 35,6 пкг/мл, а в группе контроля уровень данного цитокина составил 16,5 ± 2,7 пкг/мл.

У больных с ГИЭ уровень IP-10 в перитонеальной жидкости был снижен в 1,3 раза по сравнению с группой контроля, составив 642,2 ± 74,1 и 853,6 ± 218,4 пк/мл соответственно. В то же время уровень другого хемоаттрактанта — MCP-1 — у больных с ГИЭ был повышен почти в 2 раза по сравнению с контрольной группой и составил 275,8 ± 63,6 и 142,2 ± 12,1 пкг/мл соответственно. Уровень FGF, ассоциирующегося с ростом соединительной ткани, был почти в 1,5 раза выше у пациенток с ГИЭ в сравнении с аналогичным показателем у женщин из группы контроля и составил в единицах СИФ 56,3 ± 0,1 и 39,3 ± 0,9 соответственно. При этом уровень TGF-β у больных с ГИЭ был снижен в 1,9 раза по сравнению с контрольной группой и составил в единицах СИФ 903,9 ± 150,4 и 1739,5 ± 400,4 соответственно. Сводные данные о цитокинах представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. Уровень цитокинов и ростовых факторов в перитонеальной жидкости у больных с глубоким инфильтративным эндометриозом и в группе контроля

Table 1. The level of cytokines and growth factors in the peritoneal fluid of patients with deep infiltrative endometriosis and control group

Группы	ИЛ-2, СИФ	ИЛ-33, пк/мл	TGF-β, СИФ		FGF, СИФ	ИЛ-10, СИФ	ИЛ-6, пк/мл	IP-10, пк/мл	МСР-1, пк/мл
Пациентки с глубоким инфильтративным эндометриозом, n = 60	37,4 ± 0,5	87,6 ± 35,6*	903,9 ± 150,4**		56,3 ± 0,1	11,5 ± 4,8**	49,5 ± 8,9	642,2 ± 74,1	275,8 ± 63,6
Контрольная группа, n = 20	77,1 ± 0,9	16,5 ± 2,7*	1739,5 ± 4,1**		39,3 ± 0,9	76,8 ± 2,2**	33,1 ± 4,9	853,6 ± 218,4	142,2 ± 12,1
Примечание. * р < 0,1 между пациентками с глубоким инфильтративным эндометриозом и группой контроля; ** р < 0,05 между пациентками с глубоким инфильтративным эндометриозом и группой контроля
Дмитрий Зурабович Цицкарава — аспирант, отделение оперативной гинекологии. ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург. E-mail: tsitsskarava@yandex.ru.				Dmitry Z. Tsitskarava — postgraduate student. Department of operative gynecology. FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”, Saint Petersburg, Russia. E-mail: tsitsskarava@yandex.ru.
Мария Игоревна Ярмолинская — д-р мед. наук, профессор РАН, ведущий научный сотрудник отдела эндокринологии репродукции. ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта»; руководитель центра «Диагностики и лечения эндометриоза», профессор кафедры акушерства и гинекологии ГБОУ ВПО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава РФ, Санкт-Петербург. E-mail: m.yarmolinskaya@gmail.com.				Mariya I. Yarmolinskaya — professor of Russian Academy of Sciences, leading research assistant of department of endocrinology of reproduction, Doctor of medical sciences, head of center “Diagnostics and treatment of endometriosis”. FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”; prof. Department of obstetrics and gynecology North-Western state medical University named after I.I. Mechnikov, Saint Petersburg, Russia. E-mail: m.yarmolinskaya@gmail.com.
Александр Васильевич Селютин — канд. биол. наук, старший научный сотрудник, лаборатория иммунологии с группой по диагностике СПИД. ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург. E-mail: a_selutin@yahoo.com.				Alexandr V. Selutin — PhD, laboratory of immunology. FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”, Saint Petersburg, Russia. E-mail: a_selutin@yahoo.com.
Сергей Алексеевич Сельков — засл. деятель науки РФ, проф., заведующий лабораторией иммунологии. ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург. E-mail: selkovsa@mail.ru.				Sergey A. Selkov — Doctor of medical sciences, professor, Head of laboratory of immunology. FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”, Saint Petersburg, Russia. E-mail: selkovsa@mail.ru.

 

Обсуждение полученных результатов

Глубокий инфильтративный эндометриоз является мультифакториальным заболеванием, что отражается в многообразии механизмов патогенеза и необходимости применения комплексной терапии. Одним из ключевых этапов является ретроградная менструация, когда по маточным трубам эндометрий попадает в полость малого таза и уже эктопическая его форма имплантируется на брюшину или близлежащие органы. После имплантации эктопического эндометрия запускается каскад патологических реакций, ведущей из которых является воспалительная реакция, которая носит неэффективный характер вследствие недостатка ИЛ-2 [6] и способности эндометриоидной гетеротопии к аутокриннной регуляции, проявляющейся в персистенции воспаления за счет выработки ИЛ-6 [7], уровень которого у пациенток с ГИЭ повышен. Следующим важнейшим этапом является неоангиогенез, который начинается одновременно с запуском воспалительной реакции и не только поддерживает персистенцию гетеротопии, но и ответственен за рост очага и превращение его в инфильтрат, что может объяснять рецидивирующий характер заболевания и устойчивость как к терапии, так и к реализации врожденного противоопухолевого иммунитета [8].

Еще одним ключевым патогенетическим механизмом является рост соединительной ткани с формированием выраженного фиброза в месте инфильтрата, что, в свою очередь, приводит к нарушению нормальной анатомии органов малого таза, вовлечению в патологический процесс нервных стволов и окончаний, в связи с чем у пациенток с ГИЭ ведущими жалобами являются хронические тазовые боли.

Механизм формирования болевого синдрома при ГИЭ состоит из трех взаимосвязанных патологических процессов. Первый — это нарушения нормальной анатомии в области малого таза, которые формируются на фоне развития инфильтрата, состоящего из плотной соединительной ткани, и смещение пораженного органа, за счет чего нарушается иннервация пораженного органа. Второй— это компрессия нервных стволов и окончаний, иннервирующих органы малого таза, которые могут быть расположены по ходу роста инфильтрата и вовлекаться в него. Третий механизм обусловлен персистирующей воспалительной реакцией в полости малого таза с повышенным уровнем провоспалительных цитокинов, в особенности ИЛ-6, который, по данным литературы, самостоятельно способен потенцировать болевой импульс [9, 10]. При этом повышенный уровень в перитонеальной жидкости факторов роста соединительной ткани приводит к прогрессивному росту инфильтрата.

При анализе цитокинового состава перитонеальной жидкости у пациенток с ГИЭ было показано достоверное снижение в перитонеальной жидкости у больных с глубоким инфильтративным эндометриозом уровня ИЛ-2, обладающего разнообразными регуляторными функциями, обусловленными представленностью рецепторов для ИЛ-2 на различных типах иммунокомпетентных клеток. Действуя на Т-лимфоциты, он стимулирует их пролиферацию, через влияние на В-лимфоциты увеличивается синтез антител. Следующим эффекторным звеном являются NK-клетки, содержание и цитотоксическая активность которых также увеличивается под действием ИЛ-2 [5]. NK-клетки отвечают за противоопухолевый иммунитет и локально в полости малого таза отвечают за элиминацию эктопического эндометриоидного очага. Однако в связи с низким содержанием ИЛ-2 активация как клеточного, так и гуморального иммунитета в полости малого таза неэффективна. В свою очередь низкий уровень ИЛ-2 может быть обусловлен несколькими особенностями: генетическими поломками, которые в данной когорте пациенток приводят к нарушению специфического взаимодействия антиген — рецептор — клетки, причем на любом из этих уровней. Длительная персистенция антигена также может приводить к истощению пула клеток — продуцентов ИЛ-2, выработке самой эндометриоидной гетеротопией провоспалительных цитокинов, например, ИЛ-6 (или его предикторов), которые в свою очередь могут приводить к хронизации воспаления, блокируя апоптоз активированных лимфоцитов [7].

ИЛ-6 — один из важнейших цитокинов, участвующих в патогенезе глубокого инфильтративного эндометриоза, он оказывает провоспалительное действие и вместе с тем, являясь хемоаттрактантом для ряда активированных лимфоцитов, участвует в регуляции иммунного ответа. ИЛ-6 избирательно блокирует апоптоз лимфоцитов, что может приводить к персистенции воспалительной реакции [7]. Данные свойства ИЛ-6 сопровождаются хронизацией воспаления в области эндометриоидной гетеротопии, что характеризуется повышенным в 1,5 раза уровнем этого цитокина в перитонеальной жидкости пациенток с ГИЭ по сравнению с группой контроля. Кроме того, известно, что ИЛ-6 может усиливать активность фибробластов, таким образом усиливая фиброз [11]. Показано, что у больных с рецидивами ГИЭ, характеризующегося в том числе и более выраженным спаечным процессом в полости малого таза, уровень ИЛ-6 в перитонеальной жидкости был повышен в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой. Известно также, что ИЛ-6 является одним из медиаторов передачи болевого импульса, что наряду с персистенцией воспаления в полости малого таза ведет к потенцированию болевого синдрома у больных с ГИЭ.

Одну из основных ролей в патогенезе ГИЭ играет ИЛ-10. Ключевыми клетками, за счет которых ИЛ-10 оказывает свое иммуносупрессивное действие, являются антигенпредставляющие клетки и лимфоциты. Стоит отметить, что в присутствии ИЛ-10 также формируется пул Т-регуляторных лимфоцитов, а через воздействие на антигенпредставляющие клетки может изменяться соотношение Т-хелперов 1-го и 2-го порядков [12]. Снижение уровня данного цитокина у больных с глубоким инфильтративным эндометриозом также ведет к хронизации воспаления за счет неэффективной работы Т-хелперов и Т-регуляторных лимфоцитов и повышенному уровню циклооксигеназы-2 и простагландинов в области первичного поражения, что, наряду со сниженным уровнем ИЛ-2, приводит к уменьшению цитотоксической функции NK-клеток и развитию болевого синдрома. В целом можно говорить о том, что недостаточный уровень ИЛ-10 при ГИЭ может способствовать развитию воспалительной реакции в полости малого таза.

Интересна роль в патогенезе ГИЭ ИЛ-33, который также выполняет разнообразные функции. Будучи представителем суперсемейства ИЛ-1, он интересен еще и тем, что одновременно является и транскрипционным фактором, напрямую передающим сигнал к ядерной ДНК, параллельно с лиганд-рецепторным механизмом. Его повышенный уровень при ГИЭ характеризует зачатки хронической воспалительной реакции, носящей патологический характер. Кроме того, ИЛ-33 способствует переключению иммунного ответа с ThI в направлении ThII, что делает неэффективными цитотоксические реакции, направленные на удаление эктопического эндометрия. Одновременно относительно ГИЭ значимыми являются следующие функции ИЛ-33: способность в присутствии других биологически активных веществ, например, IDO-1 (индоламин оксидаза-1), в эндометриоидной гетеротопии усиливать собственный синтез, в связи с чем макрофагам не удается осуществить свою функцию, направленную на элиминацию очага эндометриоза [13]. При этом повышенный уровень IDO-1 ведет к снижению активности и NK-клеток за счет депривации триптофана, что, в свою очередь, приводит к неэффективной работе противоопухолевого иммунитета. У пациенток, обследованных в рамках нашей работы, показан повышенный уровень данного цитокина у больных с выраженным и умеренным болевым синдромом, а также у женщин с рецидивом заболевания.

Важными цитокинами, играющими роль в патогенезе ГИЭ, являются хемокины IP-10 и MCP-1.

Уровень IP-10 в перитонеальной жидкости у пациенток с глубоким инфильтративным эндометриозом был снижен по сравнению с группой контроля в 1,3 раза, что отражает снижение антипролиферативного и антиангиогенного потенциала. Известно, что IP-10 является хемоаттрактантом для активированных Т-лимфоцитов и NK-клеток, которые призваны элиминировать эктопический эндометрий, попавший в полость малого таза [14]. При этом, несмотря на повышенный уровень в периферической крови уровня NK-клеток и их активированных форм, у пациенток с ГИЭ не происходит их эффективного воздействия на очаг эндометриоза, в том числе и за счет сниженного количества хемоаттрактантов в зоне первичного аффекта, что, в свою очередь, ведет к росту инфильтрата. Важна также роль IP-10 в неоангиогенезе, так как все хемокины, которые осуществляют свои эффекторные функции через рецептор, не содержащий в себе последовательности CXC R2 (в случае IP-10 данный рецептор состоит из последовательности CXC R3), обладают выраженным ангиостатическим действием [14]. Таким образом, сниженный уровень IP-10 у пациенток с ГИЭ не только блокирует поступление в необходимую анатомическую зону NK-клеток, но и способствует прогрессированию патологического процесса за счет неоангиогенеза, который также является одним из ключевых звеньев в развитии инфильтрата.

Другим хемокином, который, как и предыдущий, служит для привлечения иммунокомпетентных клеток в сторону повышенного градиента концентрации, является MCP-1. Воздействуя на активированные Т-лимфоциты и NK-клетки, он обладает провоспалительной активностью, привлекая их в зону эндометриоидного инфильтрата. С другой стороны, за счет влияния на Т-регуляторные лимфоциты МСР-1 может оказывать противовоспалительное действие. В связи с его повышенным в 2 раза уровнем у пациенток с ГИЭ ведущим оказывается провоспалительная функция, которая потенцирует эффект прочих проинфламаторных цитокинов, находящихся в избыточном количестве в области инфильтрата, и создает условия для прогрессирования патологического процесса. Высокий уровень MCP-1 ведет к превалированию макрофагов в очаге ГИЭ в ущерб лимфоидным клеткам [15].

Факторы роста соединительной ткани применительно к глубокому инфильтративному эндометриозу также играют важную роль. В данной группе пациенток отмечено повышение уровня FGF по сравнению с группой контроля в 1,5 раза, при этом известно, что данный цитокин является мощным стимулятором неоангиогенеза даже по сравнению с сосудистым фактором роста за счет воздействия на эндотелиальные клетки и их организации в трубчатые структуры [14]. Другой важной функцией FGF является активация фибробластов, причем это происходит локально на месте воспалительной реакции. В связи с тем, что в области формирования эндометриоидного инфильтрата повышена концентрация провоспалительных цитокинов, а содержание противовоспалительных цитокинов, наоборот, снижено и отсутствует механизм их таргетного привлечения, данная функция FGF реализуется в образовании соединительной ткани в области непосредственно инфильтрата и одновременно стимулирует развитие спаечной болезни в зоне эндометриоидного поражения.

TGF-β также является важным показателем в развитии инфильтративных форм эндометриоза. Основными функциями данного цитокина являются снижение пролиферации клеток, иммуносупрессивное влияние и иммунорегуляторное действие, реализующееся посредством воздействия на Т-регуляторные лимфоциты. Также описан механизм иммуносупрессивного действия в очаге воспаления путем ограничения функций активированных Т-лимфоцитов и одновременно активации метаболизма соединительной ткани с целью профилактики развития фиброза [16]. Сниженный почти в 2 раза уровень TGF-β у пациенток с инфильтративными формами эндометриоза (по сравнению со здоровыми женщинами) способствует персистенции воспаления за счет отсутствия ограничения иммуносупрессии и бесконтрольному синтезу соединительной ткани, что, как и в случае с FGF, приводит к развитию спаечного процесса в полости малого таза.

Таким образом, в патогенезе глубокого инфильтративного эндометриоза можно отметить основные этапы патогенеза: воспалительную реакцию, носящую неэффективный характер, неконтролируемый рост соединительной ткани и неоангиогенез. Все это приводит к прогрессированию заболевания и находит отражение в его клинических проявлениях. Болевой синдром при ГИЭ является ведущим клиническим симптомом и наблюдается у наших больных в 80 % случаев. В формировании стойкого болевого синдрома принимает участие несколько механизмов, одним из важных является воспалительная реакция в области эндометриоидного инфильтрата. Повышенный уровень простагландинов, неэффективность действия макрофагов, сниженное количество противовоспалительных цитокинов — все это приводит к персистенции воспалительной реакции, что является благоприятным фоном для прогрессирования эндометриоза.

Выводы

Представления о патогенезе НГЭ диктуют необходимость последовательного выполнения всех этапов лечения, основным из которых является проведение своевременного и максимально эффективного оперативного вмешательства. Интраоперационно необходимо восстановить нормальную анатомию в полости малого таза, произвести декомпрессию крупных нервных стволов с последующим иссечением инфильтрата в пределах здоровых тканей с применением органо- и нервосберегающих методик, используя при этом биполярную энергию и современные противоспаечные технологии для профилактики ятрогенных поражений органов брюшной полости и малого таза, а также улучшения регенерации поврежденных тканей в послеоперационном периоде. Одновременно в связи с многообразием иммунологических нарушений при ГИЭ целесообразно дополнить стандартный протокол обследования данной группы больных анализом цитокинового профиля перитонеальной жидкости не только с целью лучшего понимания патогенеза данного процесса, но и для возможного прогнозировании сроков рецидивов [17], корректного подбора терапии в послеоперационном периоде с использованием иммуномодулирующих препаратов, в частности человеческого рекомбинантного ИЛ-2, для коррекции воспалительной реакции, в том числе и на системном уровне, благодаря влиянию на NK-клетки и Т-лимфоциты.

About the authors

Dmitry Z Tsitskarava

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Author for correspondence.
Email: tsitsskarava@yandex.ru
postgraduate student. Department of operative gynecology Russian Federation

Mariya I Yarmolinskaya

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: m.yarmolinskaya@gmail.com
professor of Russian Academy of Sciences, leading research assistant of department of endocrinology of reproduction, Doctor of medical sciences, head of center “Diagnostics and treatment of endometriosis” Russian Federation

Alexandr V Selutin

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: a_selutin@yahoo.com
PhD, laboratory of immunology Russian Federation

Sergey A Selkov

FSBSI “The Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott”

Email: selkovsa@mail.ru
Doctor of medical sciences, professor, Head of laboratory of immunology Russian Federation

References

Supplementary files