Email this article Activity of catalase in surgically induced endometrial-like lesions in rats
- Authors: Razygraev A.V.1,2, Petrosyan M.A.2, Baziyan E.V.2, Polyanskikh L.S.2
-
Affiliations:
- Saint Petersburg State University of Chemistry and Pharmacy
- The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott
- Issue: Vol 68, No 6 (2019)
- Pages: 57-63
- Section: Original Research
- URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/15920
- DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD68657-63
- ID: 15920
Cite item
Full Text
Abstract
Hypothesis/aims of study. There is a link between the activities (and polymorphisms of genes) of antioxidant enzymes and endometriosis. It is also known that progesterone induces some antioxidant enzymes in the endometrium and that progesterone analogs are effective for reduction of endometrial lesions. In addition to morphometric and histological estimations of endometriosis regression, it could be useful to assess the activity of antioxidant enzymes within endometriotic foci. The present study is aimed at estimating the activity of catalase, a hydrogen peroxide-detoxifying enzyme, in surgically induced endometrial-like lesions with a variable degree of reduction.
Study design, materials and methods. The study was carried out on 12 mature female rats of Wistar strain. Endometrial-like lesions were induced by autotransplantation of uterine tissue fragments on the abdominal wall. After 35-37 days, the endometrial foci were extracted. Catalase activity in the ectopic endometrium was determined by the Beers & Sizer method modified as follows: recording hydrogen peroxide concentration decrease at 250 nm and using 3-amino-1,2,4-triazole (AT) to assess specificity. The correlation between the specific catalase activity and protein amount in the ectopic endometrium was estimated.
Results. At the wavelength of 250 nm, a relatively weak interference of AT with other components of the reaction mixture was observed, which allows using the specific catalase inhibitor to indicate the enzyme activity. The activity is measured in a short period of incubation (less than 1 minute) and is proportional to amount of the endometrial tissue extract in the reaction mixture. As a rule, the most reduced endometriotic foci (with the lowest weight) possessed a higher catalase activity (the Spearman’s rho was –0.66 with p < 0.025).
Conclusion. The method for determining catalase activity was adapted to work with endometriotic foci. With p < 0.025, we can accept that a low weight of endometriotic foci is linked with a relatively high catalase activity within their tissue. The results allow suggesting the involvement of catalase in reduction of endometrial lesions.
Full Text
Актуальность
Развитие эндометриоза сопряжено с изменением активности антиоксидантных ферментов (и состояния кодирующих их генов) в ткани эндометрия. Ранее показано, что эндометриоз сопровождается нарушениями циклических изменений экспрессии GPx1 (классической формы глутатионпероксидазы) в эндометрии [1]. Существуют данные, указывающие на активацию GРx3 (секретируемой формы глутатионпероксидазы) под действием прогестерона [2, 3] и эффективность аналогов прогестерона при терапии эндометриоза [4]. Каталаза — фермент, выполняющий сходную с глутатионпероксидазами функцию (детоксикация пероксида водорода в организме). Уровень активности данного фермента при эндометриозе изменяется [5, 6], а полиморфизм промотора его гена ассоциирован с риском развития этого заболевания [7]. Ранее мы упоминали о целесообразности анализа активности GPx3 при оценке эффективности воздействия аналогов прогестерона на клетки эндометриоидной ткани [8], однако, судя по имеющимся данным, анализ на каталазную активность может оказаться не менее важным и информативным показателем реактивности ткани эндометрия, в том числе в эндометриоидных гетеротопиях при эндометриозе. Важно изучить возможность оценки регресса гетеротопий по активности каталазы в их ткани. Данное исследование перспективно для разработки новых подходов к диагностике эндометриоза, а также его терапии.
Цель — провести анализ активности каталазы в ткани эндометриоидных имплантов в экспериментальной модели эндометриоза на лабораторных крысах.
Материалы и методы
Исследование проведено на половозрелых самках крыс линии Вистар массой 170–220 г. Все лабораторные животные получены из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» и содержались в регламентированных условиях вивария ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта» при соблюдении всех правил содержания лабораторных животных: время и порядок проведения карантина, маркировка всех особей, постоянный санитарный контроль, стандартный рацион питания, свободный доступ к воде и пище, автоматический режим освещения (день : ночь — 12 : 12 ч).
Подготовку животных к операции и выполнение операции по моделированию эндометриоза с использованием лапаротомии проводили согласно описанию в работе [4]. Все операции выполняли на стадии эструс, стандартизируя условия трансплантации фрагментов матки животных, находящихся в одинаковой стадии эстрального цикла. Перевязывали рог матки в области маточно-трубного перехода и на 1 см выше места бифуркации рогов. Фрагмент рога матки между лигатурами иссекали. Удаленный участок переносили в стерильную чашку Петри в 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, вскрывали вдоль со стороны прикрепления маточной брыжейки и разрезали на фрагменты размером 3 × 3 мм. Затем проводили аутотрансплантацию фрагментов ткани матки на участки в брюшной полости животного. Импланты размещали на передней брюшной стенке в области локализации крупных сосудов, справа и слева от срединного разреза таким образом, чтобы эндометрий был ориентирован в сторону мезотелия. Импланты фиксировали с помощью шовного материала VICRYL*Plus Antibacterial/resorbaarbeer (0–4) (Johnson&Johnson, Бельгия). Всем животным во время операции была проведена двусторонняя овариоэктомия. После моделирования эндометриоза всем животным назначили заместительную гормональную терапию этинилэстрадиолом. Инъекции эстрогена в дозе 50 мкг/кг в масляном растворе проводили внутримышечно, начиная со дня операции дважды в неделю до окончания эксперимента. Спустя две недели после первой операции выполняли повторную (диагностическую) лапаротомию для подтверждения жизнеспособности имплантов. Техника и условия выполнения оперативного вмешательства были аналогичны первой лапаротомии. При условии визуализации одного и более имплантов животных оставляли в эксперименте, при отсутствии всех имплантов (потеря, отторжение и/или резорбция ткани) животных исключали из исследования. Через 3 нед. от диагностической лапаротомии животных выводили из эксперимента, используя глубокий ингаляционный наркоз. Проводили вскрытие, иссекали эндометриоидные очаги из окружающих тканей, после чего замораживали и хранили при –85 °С до приготовления гомогенатов. От каждого животного для анализа активности каталазы брали по одному импланту; остальные импланты использовали для других исследований.
Каждый извлеченный имплант промывали в изотоническом растворе натрия хлорида и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в 40 мкл охлажденного 0,05 М K-Na-фосфатного буфера (рН 7,8) в течение 60 с. Гомогенизатор промывали дополнительной порцией буфера (40 мкл); таким образом, общий объем раствора для приготовления гомогената в каждом случае составил 80 мкл. Гомогенаты центрифугировали 6 мин при 4 °C, 1000 g. Для последующей проверки ингибирования ферментативной активности специфичным ингибитором каталазы, 3-амино-1,2,4-триазолом (АТ), аликвоты супернатанта смешивали с 0,5 М водным раствором АТ вдвое меньшего объема и инкубировали 1 ч при 4 °C.
Каталазную активность в супернатанте определяли по изменению поглощения раствора в ультрафиолетовой части спектра, отражающему изменение концентрации пероксида водорода под действием фермента [9]. В соответствии с законом Бера – Ламберта оптическая плотность раствора пероксида водорода линейно зависит от концентрации пероксида водорода, и при различных длинах волн ультрафиолетового диапазона можно высчитать коэффициент молярного поглощения пероксида водорода при известных концентрациях последнего. Длина волны, широко используемая для измерения концентрации пероксида водорода, составляет 240 нм, соответствующий коэффициент молярного поглощения для водного раствора H2O2 равен 43,6 M–1см–1 (проверен нами ранее при работе с глутатионпероксидазами) [10, 11]. Спектр поглощения пероксида водорода не имеет пика при длине волны 240 нм, поглощение раствора H2O2 постепенно увеличивается при уменьшении длины волны и снижается при ее увеличении (не линейно) [9]. При низких начальных концентрациях белка в супернатанте, содержащем каталазу, и, соответственно, при необходимости внесения в реакционную смесь больших количеств супернатанта, смешанного с раствором АТ, была выявлена сильная интерференция АТ с пероксидом водорода при длине волны 240 нм, что не позволяло точно регистрировать возможные изменения концентрации H2O2 в присутствии ингибитора каталазы. По этой причине был рассчитан коэффициент молярного поглощения H2O2 для другой длины волны, 250 нм, с использованием соотношения между величинами поглощения при 240 и 250 нм (A240/A250) на основании спектров поглощения растворов H2O2 в дистиллированной воде (а также в K-Na-фосфатном буфере с рН 7,8, рис. 1). Спектры регистрировали на четырех UV/VIS-спектрометрах: Lambda 25 (Perkin Elmer, США), CLARIOstar (BMG Labtech, Германия), NanoDrop One (Thermo Scientific, США) и DU-65 (Beckman Coulter, США). Коэффициент молярного поглощения при 250 нм (ε250) был рассчитан для каждой спектрограммы по формуле
ε250 = 43,6/(A240/A250).
Рис. 1. Спектр поглощения пероксида водорода (23,7 мM) в 0,05 M K-Na-фосфатном буфере (pH 7,8) в ультрафиолетовом диапазоне длин волн 240–260 нм
Fig. 1. Absorption spectrum of 23.7 mM hydrogen peroxide in 0.05 M K-Na-phosphate buffer (pH 7.8) in the ultraviolet wavelength range of 240–260 nm
Затем вычисляли среднее значение ε250 (в M–1см–1) для каждого спектрометра. Для четырех спектрометров среднее значение ε250 для пероксида водорода составило 26,444 M–1см–1 (медиана — 26,439, размах min–max — 26,08–26,82). Средние значения для водного и забуференного растворов оказались идентичными, поэтому ε250 = 26,4 M–1см–1 был использован для оценки убыли концентрации пероксида водорода при определении активности каталазы. Коэффициенты молярного поглощения H2O2 для других длин волн также были определены на основе записанных спектрограмм (таблица), что может быть использовано в дальнейшей работе.
Таблица 1 / Table 1
Коэффициенты молярного поглощения пероксида водорода, рассчитанные для длин волн ультрафиолетового диапазона 241–270 нм
Hydrogen peroxide molar absorption coefficients calculated for the ultraviolet wavelength range of 241–270 nm
Длина волны, нм (λ, nm) | Коэффициент молярного поглощения H2O2, M–1см–1 (ε, M–1cm–1) | Длина волны, нм (λ, nm) | Коэффициент молярного поглощения H2O2, M–1см–1 (ε, M–1cm–1) | Длина волны, нм (λ, nm) | Коэффициент молярного поглощения H2O2, M–1см–1 (ε, M–1cm–1) |
241 | 41,3 | 251 | 24,9 | 261 | 14,4 |
242 | 39,3 | 252 | 23,5 | 262 | 13,7 |
243 | 37,6 | 253 | 22,3 | 263 | 13,0 |
244 | 36,0 | 254 | 21,2 | 264 | 12,2 |
245 | 34,2 | 255 | 20,1 | 265 | 11,4 |
246 | 32,2 | 256 | 19,0 | 266 | 10,8 |
247 | 30,3 | 257 | 18,0 | 267 | 10,2 |
248 | 29.0 | 258 | 16,9 | 268 | 9,6 |
249 | 27,8 | 259 | 16,0 | 269 | 9,1 |
250 | 26,4 | 260 | 15,1 | 270 | 8,5 |
Примечание. За основу для расчетов коэффициентов молярного поглощения H2O2 при длинах волн 241–270 нм взяты коэффициент молярного поглощения H2O2 при 240 нм, равный 43,6 M–1см–1, и соотношение между поглощением при 240 нм и при длине волны, указанной в таблице.
Супернатант гомогената инкубировали с пероксидом водорода в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см. В тестовую кювету вносили 1,100 мл 0,05 М K-Na-фосфатного буфера (рН 7,8), 0,030 мл водного раствора H2O2 (0,97 М — пергидроль, предварительно разбавленный в 10 раз дистиллированной водой) и затем дистиллированную воду и супернатант гомогената до общего объема реакционной смеси, равного 1,230 мл. Поскольку инкубацию проводили при температуре внутри спектрометра (25–27 °C), в кювету вносили в охлажденном виде только дистиллированную воду с супернатантом гомогената. В кювету сравнения вместо супернатанта гомогената вносили охлажденный буфер. В полностью сформированной реакционной смеси начальная концентрация пероксида водорода составляла 23,66 мМ, оставалась стабильной в кювете сравнения и быстро снижалась в тестовой кювете. Оптическую плотность при длине волны 250 нм первый раз измеряли через 20 с от момента внесения супернатанта гомогената и после тщательного перемешивания реакционной смеси. Последующие измерения выполняли с повторными перемешиваниями и удалением газовых везикул, растущих на стенках кюветы при образовании O2 в ферментативном разложении H2O2. При внесении в реакционную смесь супернатанта гомогената, содержащего АТ, оптическая плотность оставалась в диапазоне точных измерений спектрометра.
Концентрацию белка в супернатанте гомогенатов определяли путем упрощенной турбидиметрической процедуры, как описано в работе [12], с использованием нескольких различающихся разведений одного и того же биоматериала. Данные по концентрации белка использовали как для расчета удельной активности каталазы, так и для оценки массы гетеротопий (с учетом того, что гетеротопии гомогенизировали идентичным образом независимо от их размера).
В качестве стандартных образцов со стабильной каталазной активностью, по которым контролировали воспроизводимость результатов, применяли ферментные препараты Culex torrentium.
Линейный характер зависимости скорости реакции от содержания биоматериала оценивали с использованием коэффициента детерминации (R2), для оценки корреляции между удельной каталазной активностью и массой биоматериала применяли ранговый коэффициент корреляции Спирмена (rho). Расчеты выполняли в программной среде R (версия 3.4.0) [13].
Результаты и обсуждение
При использовании длины волны 250 нм не наблюдалось сильной интерференции АТ с другими компонентами реакционной смеси, что позволило применить специфический ингибитор каталазы для проверки принадлежности определяемой активности ферменту каталазе. Во всех случаях после преинкубации материала эндометриоидных гетеротопий с АТ разложение пероксида водорода блокировалось полностью и в течение 1–3 мин инкубации оптическая плотность раствора не снижалась. Это позволило идентифицировать H2O2-разрушающую активность материала эндометриоидных гетеротопий как каталазную активность. В пробах без АТ максимальная скорость убыли концентрации пероксида водорода под действием фермента зарегистрирована в первые несколько десятков секунд после внесения биоматериала в реакционную смесь (менее минуты); при этом скорость была пропорциональна концентрации материала гетеротопии в реакционной смеси (R2 составил 0,9934–0,9967 для разных гетеротопий; проверено до концентрации белка в реакционной смеси, равной 0,037 мг/мл). При дальнейшей инкубации скорость ферментативного разложения пероксида водорода снижалась. Таким образом, для дальнейшего расчета каталазной активности целесообразно использовать результаты измерений в течение первых десятков секунд инкубации. Линейная зависимость скорости ферментативной реакции от содержания материала эндометриоидных гетеротопий означает, что в соответствующем диапазоне концентраций биоматериала приемлемо проводить сравнительные исследования удельной ферментативной активности в образцах с отличающимися разведениями (и, соответственно, с разными концентрациями белка).
Рассчитанная удельная активность каталазы в смоделированных эндометриоидных гетеротопиях у 12 самок крыс составила в среднем 88,41 мкмолей H2O2/мин на миллиграмм белка (медиана — 81,43, интерквартильный размах — 78,64–94,41). Между удельной активностью каталазы в гетеротопиях и массой гетеротопий (оцененной по количеству содержащегося в них растворимого белка) выявлена статистически значимая обратная корреляция: rho = –0,66, p = 0,02398 (рис. 2). Поскольку при моделировании гетеротопий размер имплантируемой ткани был приблизительно одинаковым для всех крыс, можно говорить о существовании положительной связи между степенью регресса гетеротопии (который происходит как самопроизвольно, так и под действием обработки половыми стероидами) и активностью каталазы в ткани гетеротопии. Иными словами, гетеротопии, наиболее сильно подвергающиеся регрессу, как правило, обладают более высокой активностью каталазы, и, наоборот, при слабом регрессе, его отсутствии или даже росте эндометриоидной гетеротопии каталазная активность в основном низкая (с р < 0,025).
Рис. 2. Связь (обратная корреляция) между удельной активностью каталазы в гетеротопиях и их массой
Fig. 2. A negative link (reciprocal correlation) between the specific activity of catalase in endometriotic foci and the weight of endometrial biomaterial (estimated by total soluble protein that released into the supernatant during homogenization). Hence, the link between the regression of endometrial lesion and the specific activity of catalase is positive
Полученные данные согласуются с выводом, сделанным ранее другими авторами [5, 6], о вовлеченности окислительного стресса в механизм прогрессирования эндометриоза. На основании настоящего исследования справедливо будет предположить, что усиление активности каталазы в эндометриоидных гетеротопиях может привести к их регрессу. В связи с этим целесообразны поиск нетоксичных избирательных индукторов экспрессии каталазы в эндометриоидной ткани и проверка их эффективности для терапии эндометриоза.
Благодарности
Авторы благодарят А.-П.С. Шурыгину (Научно-исследовательский институт гриппа, Санкт-Петербург) за помощь при работе на спектрометрах при определении коэффициентов молярного поглощения пероксида водорода.
Дополнительная информация
Информация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Информация о финансировании. Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках фундаментального исследования по теме «Разработка стратегий диагностики, терапии генитального эндометриоза и опухолей женского репродуктивного тракта» (регистрационный номер: АААА-А19-119030490009-6).
А.В. Разыграев — биохимическое исследование, статистическая обработка данных, написание статьи.
М.А. Петросян — дизайн экспериментальной модели эндометриоза и ее постановка, написание статьи.
Е.В. Базиян — постановка модели эндометриоза и сбор материала.
Л.С. Полянских — постановка модели эндометриоза и сбор материала.
About the authors
Alexey V. Razygraev
Saint Petersburg State University of Chemistry and Pharmacy; The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott
Author for correspondence.
Email: alexeyrh@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0544-9398
SPIN-code: 8623-7923
the Laboratory of Pharmacological Research; PhD, Researcher. Pharmacology Group, the Department of Pathomorphology
Russian Federation, Saint PetersburgMaria A. Petrosyan
The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott
Email: mariya@labpharm.spb.ru
ORCID iD: 0000-0001-7347-6104
SPIN-code: 5329-5420
PhD, Leading Researcher. Pharmacology Group, the Department of Pathomorphology
Russian Federation, Saint PetersburgElena V. Baziyan
The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott
Email: waz2107gen@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7837-3315
SPIN-code: 2232-9914
Researcher. Pharmacology Group, the Department of Pathomorphology
Russian Federation, Saint PetersburgLyudmila S. Polyanskikh
The Research Institute of Obstetrics, Gynecology, and Reproductology named after D.O. Ott
Email: polyanskikh-83@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9994-8341
SPIN-code: 2501-8880
Researcher. Pharmacology Group, the Department of Pathomorphology
Russian Federation, Saint PetersburgReferences
- Ota H, Igarashi S, Kato N, Tanaka T. Aberrant expression of glutathione peroxidase in eutopic and ectopic endometrium in endometriosis and adenomyosis. Fertil Steril. 2000;74(2):313-318. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(00)00638-5.
- Borthwick JM, Charnock-Jones DS, Tom BD, et al. Determination of the transcript profile of human endometrium. Mol Hum Reprod. 2003;9(1):19-33. https://doi.org/10.1093/molehr/gag004.
- Xu X, Leng JY, Gao F, et al. Differential expression and anti-oxidant function of glutathione peroxidase 3 in mouse uterus during decidualization. FEBS Lett. 2014;588(9):1580-1589. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2014.02.043.
- Петросян М.А., Балашова Н.Н., Полянских Л.С., и др. Влияние аналогов прогестерона на эндометриоидные гетеротопии в экспериментальной модели эндометриоза // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2018. – Т. 81. – № 7. – С. 14–19. [Petrosyan MA, Balashova NN, Polyanskikh LS, et al. Influence of progesterone analogs on endometrioid heterotopia in experimental model of endometriosis. Eksp Klin Farmakol. 2018;81(7):14-19. (In Russ.)] https://doi.org/10.30906/0869-2092-2018-81-7-14-19.
- Ota H, Igarashi S, Sato N, et al. Involvement of catalase in the endometrium of patients with endometriosis and adenomyosis. Fertil Steril. 2002;78(4):804-809. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(02)03344-7.
- Puy LA, Librach CL. A case-controlled analysis of catalase expression in endometriosis. Fertil Steril. 2001;76(3):S149. https://doi.org/10.1016/s0015-0282(01)02436-0.
- Zarafshan SS, Salehi Z, Salahi E, et al. Polymorphism of catalase gene (CAT C-262T) in women with endometriosis. J Obstet Gynaecol. 2015;35(3):269-271. https://doi.org/10.3109/01443615.2014.948402.
- Разыграев А.В., Петросян М.А., Таборская К.И. Перспективы определения ферментативной активности глутатионпероксидазы GPx3 в клеточной культуре эндометрия при оценке гестагенной активности аналогов прогестерона // Журнал акушерства и женских болезней. – 2017. – Т. 66. – № S. – С. 66–67. [Razygraev AV, Petrosyan MA, Taborskaya KI. Perspektivy opredeleniya fermentativnoy aktivnosti glutationperoksidazy GPx3 v kletochnoy kul’ture endometriya pri otsenke gestagennoy aktivnosti analogov progesterona. Journal of Obstetrics and Women’s Diseases. 2017;66(S):66-67. (In Russ.)]
- Beers RF, Jr., Sizer IW. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 1952;195(1):133-140.
- Разыграев А.В. Гомоцистеинпероксидазная активность плазмы крови крыс. Стехиометрия и ферментативный характер реакции // Биомедицинская химия. – 2013. – Т. 59. – № 6. – С. 636–643. [Razygraev AV. Homocysteine peroxidase activity in rat blood plasma: stoichiometry and enzymatic character of the reaction. Biomed Khim. 2013;59(6):636-643. (In Russ.)]. https://doi.org/10.18097/pbmc20135906636.
- Разыграев А.В., Таборская К.И., Петросян М.А., Тумасова Ж.Н. Тиолпероксидазные активности плазмы крови крыс, определяемые с использованием пероксида водорода и 5,5’-дитиобис(2-нитробензойной кислоты) // Биомедицинская химия. – 2016. – Т. 62. – № 4. – С. 431–438. [Razygraev AV, Taborskaya KI, Petrosyan MA, Tumasova ZhN. Thiol peroxidase activities in rat blood plasma determined with hydrogen peroxide and 5,5’-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid). Biomed Khim. 2016;62(4):431-438. (In Russ.)]. https://doi.org/10.18097/PBMC20166204431.
- Чеснокова Л.С., Войнова Н.Е., Комкова А.И., Лянгузов А.Ю. Методы количественного определения белка // Ферменты и нуклеиновые кислоты / под ред. В.Г. Владимирова, С.Н. Лызловой. – СПб., 1997. – С. 5–25. [Chesnokova LS, Voynova NE, Komkova AI, Lyanguzov AY. Metody kolichestvennogo opredeleniya belka. In: Fermenty i nukleinovye kisloty. Ed. by V.G. Vladimirov, S.N. Lyzlova. Saint Petersburg; 1997. P. 5-25. (In Russ.)]
- r-project.org [Internet]. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria; 2017. [cited 25 Oct 2019]. Available from: https://www.r-project.org/.
Supplementary files
