Expansion of trinucleotide CTG repeats in the TCF4 gene as a marker of fuchs’ endothelial corneal dystrophy

Cover Page

Abstract


Fuchs’ endothelial corneal dystrophy (FECD) is an inherited severe and progressive disease, characte­rized by endothelial cell density decrease and increasing corneal edema. FECD development may be linked to expanded trinucleotide repeat, CTG, in the third intron of the TCF4 gene. The study focuses on estimating the prevalence of expanded CTG repeat in TCF4 gene in the Russian population, in patients with normal cornea and in patients with FECD (by applying triplet repeat PCR technique and capillary electrophoresis). 51 patients with FECD and 38 patients with normal cornea were examined. The estimation of the number of CTG triplet repeats in TCF4 gene determination is the veracious laboratory marker of FECD.


ВВЕДЕНИЕ

За последние десятилетия учёными были достигнуты значительные успехи в понимании этиологии эндотелиальных дистрофий роговицы (ЭДР). Наиболее распространённой формой ЭДР является дистрофия Фукса, встречающаяся в среднем у 4–4,5 % пациентов старше 50 лет [1]. Несмотря на некоторые нерешённые вопросы в патогенезе ЭДР Фукса, доказаны различные генетические аберрации, которые лежат в основе развития этого заболевания. В 2001 г. было установлено, что мутации L450W и Q455K гена COL8A2 вызывают раннюю форму ЭДР Фукса. В 2005 г. исследователи подтвердили, что мутации в гене TCF8 служат причиной задней полиморфной дистрофии роговицы [2, 3]. Кроме этого, различные аберрации в генах ZEB1, AGBL1, LOXHD1 и SLC4A11 также обусловливают врождённую наследственную эндотелиальную дистрофию [4, 5]. Однако, несмотря на значительный прогресс в идентификации генов, точной генетической причины мутаций, ответственных за развитие ЭДР, в более 90 % случаев установить не удаётся.

K.H. Baratz et al. в 2010 г. доказали, что вероятность развития ЭДР Фукса значительно выше у носителей нуклеотидных полиморфизмов rs17595731, rs613872, rs9954153, rs2286812 гена TCF4. С использованием этих маркеров были дифференцированы случаи ЭДР Фукса с точностью до 78 %, при этом было установлено, что полиморфизм rs613872 является диагностически наиболее значимым маркером развития ЭДР Фукса [6]. Учёные обнаружили, что схожие полиморфизмы, такие как rs17089887, тоже связаны с развитием ЭДР Фукса в азиатско-китайской [7] и индийской [8] популяциях, что также подтверждает гипотезу, что патогенная генетическая аномалия находится в гене TCF4. TCF4 (transcription factor 4) — ген, вовлечённый в механизмы регулирования межклеточной адгезии, клеточной подвижности и пролиферации. Ген расположен в локусе 18q21.2 [9].

Основываясь на сообщении T.S. Breschel et al. [10], в котором описана экспансия (увеличение количества) CTG-тринуклеотидных повторов в третьем интроне гена TCF4 нестабильного участка CTG18.1, обнаруживаемая у 3 % населения, Wieben et al. [11] в 2012 г. изучили связь между экспансией в локусе CTG 18.1 и ЭДР Фукса. В этом исследовании было показано, что увеличение количества CTG-повторов более 50 сильнее коррелирует с развитием ЭДР Фукса, чем любые из ранее идентифицированных генных локусов. Экспансия последовательности CTG приводит к формированию токсических внутриядерных очагов РНК, секвестрации регуляторных факторов транскрипции, таких как MBNL1, и нарушению сплайсинга (процесс вырезания определённых нуклеотидных последовательностей) РНК [12]. В 2014 г. после обширной идентификации всей последовательности гена TCF4 у пациентов с ЭДР Фукса не удалось выявить других значимых генетических мутаций (кроме rs613872 и CTG18.1-тринуклеотидного повтора) внутри гена TCF4, которые были бы связаны с развитием ЭДР Фукса [13]. Это ещё раз подтвердило, что экспансия последовательности CTG-тринуклеотида напрямую влияет на патогенез ЭДР Фукса.

Таким образом на сегодняшний день экспансия тринуклеотидных повторов CTG в третьем интроне гена TCF4 является самым перспективным маркером ЭДР Фукса.

Цель — оценка распространённости экспансии CTG-повторов в гене TCF4 в российской популяции у пациентов со здоровой роговицей и у пациентов с дистрофией роговицы Фукса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 89 пациентов, находившихся на лечении в клинике офтальмологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, в возрасте от 50 лет. Всем участникам исследования было проведено стандартное офтальмологическое обследование. Были сформированы две группы пациентов. В первую группу вошли больные с признаками ЭДР Фукса (n = 51) (9 мужчин, 42 женщины), средний возраст которых составил 69,55 ± 8,54 года (от 50 до 86): с 1-й стадией (26 пациентов), со 2-й стадией (16 пациентов) и с 3-й стадией (9 пациентов) (классификация Волкова – Дронова) [14]. Во вторую группу (группа контроля) были включены пациенты со здоровыми роговицами (n = 38) (8 мужчин, 30 женщин), средний возраст которых составил 71,11 ± 8,17 года (от 58 до 88) (табл. 1).

 

Таблица 1 / Table 1

Характеристики пациентов

Patient characteristics

Показатели

Пациенты с дистрофией Фукса

Группа контроля

Количество (мужчин/женщин)

9/42

8/30

Возраст (лет) ± SD

69,55 ± 8,54

71,11 ± 8,17

Вариация возраста

От 50 до 86

От 58 до 88

 

У всех пациентов с целью выявления экспансии CTG-тринуклеотида в гене TCF4 из лейкоцитов периферической крови была выделена геномная ДНК с помощью стандартного протокола [15]. Очищенная ДНК была разведена в элюирующем TE-буфере. При анализе концентрации ДНК индекс абсорбции 260/280 во всех образцах варьировал в пределах 1,8–1,9. После измерения концентрации ДНК была разведена до 100 нг/мкл и хранилась при –20 °C.

Количество CTG-повторов в гене TCF4 определяли в два этапа: скрининговое исследование классическим методом ПЦР и подтверждение экспансии ПЦР с праймингом тройных повторов.

Для проведения скринингового исследования количества CTG-повторов в гене TCF4 были синтезированы фланкирующие праймеры, связывающиеся с участками вне зоны экспансии. Один из праймеров был мечен FAM-6. Прямой праймер граничил с 5’-концом участка CTG-повторов. Обратный праймер представлял собой химерный олигонуклеотид, способный гибридизоваться с любым участком области CTG-повторов.

Нуклеотидные последовательности праймеров, концентрации компонентов ПЦР-смеси, а также условия проведения скрининговой ПЦР и ПЦР с праймингом тройных повторов представлены в ранее опубликованных работах [16, 17].

Для разделения продуктов реакции после скрининговой ПЦР и ПЦР с праймингом тройных повторов осуществляли фрагментный анализ с использованием генетического анализатора ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems).

Первично проводили скрининговое исследование для точного определения количества CTG-повторов. Для расчёта количества CTG-повторов из размера полученного ПЦР-продукта вычитали 230 нуклеотидов, которые составляют размер праймеров, и нуклеотиды до начала локуса с экспансией. Количество CTG-повторов рассчитывали с помощью формулы

CTGn =Размер фрагмента  2303

При определении двух аллелей наличие экспансии CTG-повторов в гене TCF4 исключали (рис. 1).

 

Рис. 1. Электрофореграмма скринингового исследования количества CTG-повторов в гене TCF4. Пациенты не имеют экспансии CTG-повторов в гене TCF4

Fig. 1. Electrophoregram of the screening study of the number of CTG repeats in the TCF4 gene. Patients have no expansion of CTG repeats in the TCF4 gene

 

Если количество CTG-повторов на одной из аллелей превышало 50, то пациента считали носителем гетерозиготной экспансии. При детекции одной аллели (рис. 2) требовалась дифференцировка между одинаковым количеством повторов на обеих аллелях и экспансией. Для этого подтверждали экспансию с помощью ПЦР с праймингом тройных повторов. Если у пациента количество повторов на двух аллелях было одинаковым, то при проведении ПЦР с праймингом тройных повторов экспансию не выявляли.

При экспансии CTG-повторов в гене TCF4 на одной из аллелей наблюдалась характерная картина электрофореграммы, изображённая на рис. 3.

 

Рис. 2. Электрофореграмма скринингового исследования количества CTG-повторов в гене TCF4. Требуется исключение экспансии

Fig. 2. Electrophoregram screening study of the number of CTG repeats in the TCF4 gene. Expansion required

 

Рис. 3. Электрофореграмма ПЦР с праймингом тройных повторов у пациента с экспансией CTG-повторов в гене TCF4

Fig. 3. PCR electrophoregram with triple repeat priming in a patient with an expansion of CTG repeats in the TCF4 gene

 

При отсутствии пиков на электрофореграмме после скрининга и наличии положительного паттерна по результатам подтверждающей ПЦР-реакции у пациентов определялась гомозиготная экспансия.

Статистический анализ полученных данных выполняли с использованием программы Graph Pad 6.0. Для сравнения групп качественных признаков применяли тест χ2. Числовые данные в результатах представлены как медиана и меж­квартильный диапазон. Результаты считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспансия в группе пациентов с ЭДР Фукса составила 55 %. Кроме этого, у одного пациента было выявлено гомозиготное патологическое увеличение количества повторов. В группе контроля увеличения количества CTG-повторов более 50 не наблюдалось. Полученные данные представлены на рис. 4, 5. Характеристику пациентов из группы контроля и группы ЭДР Фукса см. в табл. 1.

 

Рис. 4. Распространённость экспансии CTG-повторов в гене TCF4 в группе пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса

Fig. 4. The prevalence of expansion of CTG repeats in the TCF4 gene in the group of patients with FECD

 

Рис. 5. Количество CTG-повторов в группе пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса и в группе сравнения

Fig. 5. The number of repetitions in the group of patients FECD and the comparison group

 

ОБСУЖДЕНИЕ

ЭДР Фукса занимает одно из первых мест в качестве показания для выполнения пересадки роговицы в США [18]. На данный момент считается, что одной из главных причин развития ЭДР Фукса является увеличение количества CTG-повторов в третьем интроне гена TCF4 [19]. Однако пенетрантность и экспрессивность мутации могут значительно варьировать у разных больных. Носительство гетерозиготной или гомозиготной экспансии без объективных признаков ЭДР Фукса повышает риск развития заболевания в 76 раз [20].

В основе патогенеза TCF4-ассоциированной ЭДР Фукса лежит образование токсичной мРНК с экспансионными CTG-повторами внутриядерных образований, которые нарушают нормальный гомеостаз РНК клетки путём адсорбции факторов сплайсинга, в основном MBNL1 [12]. В нескольких экспериментах на клеточных линиях эндотелия роговицы пациентов с ЭДР Фукса было показано, что белки MBNL1 и MBNL2 колокализуются с очагами мРНК гена TCF4. У пациентов с мутацией в гене TCF4 эндотелиальные клетки роговицы характеризовались изменённым паттерном сплайсинга мРНК по сравнению с пациентами с ЭДР Фукса без экспансии. Эта находка подтвердила, что сплайсинг нарушается вследствие появления CTG-экспансии, а не прогрессирования болезни [12].

Кроме этого, токсичность экспансионной мРНК гена TCF4 была доказана при помощи трансфекции гена TCF4 с увеличенным количеством CTG-повторов в клеточные линии эндотелия роговицы человека. Данная модификация не только вызывала образование мРНК-очагов, но и приводила к изменениям в клетках, характерным для ЭДР Фукса. Важность участия CTG-экспансии в патогенезе ЭДР Фукса подчёркивается также возможностью блокировать развитие ЭДР Фукса в клеточных моделях путём добавления ингибирующей антисенс (CAG)7 мРНК [21].

Данная работа, посвящённая исследованию распространённости экспансии в гене TCF4 у пациентов с ЭДР Фукса и пациентов без признаков дистрофии роговицы, является одной из первых, проведённых в Российской Федерации. Встречаемость гетерозиготной экспансии в исследуемой группе ЭДР Фукса составила 53 %, что сопоставимо с рядом исследований, проведённых в США и Европе. Так, было показано, что распространённость экспансии CTG-тринуклеотидов у больных ЭДР Фукса в разных этнических группах [8, 17, 22–25] составляет от 34 до 73 %. В российской популяции единственные данные о частоте встречаемости экспансии CTG-тринуклеотида у больных ЭДР Фукса [26] совпадают с общемировыми данными (66,7 %). Однако распространённость данной аберрации в российской популяции без признаков ЭДР Фукса не была продемонстрирована ни в одной работе. Распространённость гомозиготной экспансии в данном исследовании составила 2 %, что также сопоставимо с результатами ранее опубликованных работ [25, 26]. Кроме этого, нами не было обнаружено мутаций в группе контроля, в которую были включены пациенты без патологии роговицы. Это соответствует ряду опубликованных работ [7, 8, 24], однако исследования, включающие более объёмные выборки пациентов в группе сравнения, показывали наличие экспансии в гене TCF4 в 2–7 % случаев. Наличие аберраций в группе контроля может быть объяснено низким уровнем пенетрантности и экспрессивности исследуемой мутации.

ВЫВОДЫ

ЭДР Фукса представляет собой распространённое офтальмологическое заболевание у лиц старше 40 лет, патогенез которого до недавнего времени во многих случаях был неясен, а диагноз основывался сугубо на клинических и инструментальных данных. Однако описание у большинства пациентов новой патогенной аберрации в виде экспансии в гене TCF4 дало возможность не только для лабораторного подтверждения диагноза, но и для создания новых этиологических подходов к лечению болезни.

Прозрачность финансовой деятельности: никто из авторов не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах.

Конфликт интересов отсутствует.

Sanasar S. Papanyan

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Author for correspondence.
Email: Dr.papanyan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3766-2211
SPIN-code: 9794-4692

Russian Federation, Saint Petersburg

MD, Aspirant, Ophthalmology Department

Sergey Yu. Astakhov

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: astakhov73@mail.ru
SPIN-code: 7732-1150

Russian Federation, Saint Petersburg

MD, PhD, DMedSc, Professor, Head of the Department

Vladimir D. Nazarov

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: nazarov19932@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9354-8790

Russian Federation, Saint Petersburg

Research Fellow, Laboratory of Autoimmune Diagnostics, Center for Molecular Medicine

Sergey V. Lapin

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: svlapin@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4998-3699

Russian Federation, Saint Petersburg

MD, PhD, Head, Laboratory of Autoimmune Diagnostics, Center for Molecular Medicine

Sergey A. Novikov

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: serg2705@yandex.ru

Russian Federation, Saint Petersburg

MD, PhD, DMedSc, Professor, Ophthalmology Department

Inna A. Riks

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: riks0503@yandex.ru

Russian Federation, Saint Petersburg

MD, PhD, Assistant. Ophthalmo­logy department

Liliya K. Anikina

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: lily-sai@yandex.ru

Russian Federation, Saint Petersburg

Student of 6th year

Kseniya S. Dovydenko

Pavlov First Saint Petersburg State Medical University

Email: ksenisens@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8190-7223

Russian Federation, Saint Petersburg

Student of 6th year

  1. Afshari NA, Pittard AB, Siddiqui A, Klintworth GK. Clinical study of Fuchs corneal endothelial dystrophy leading to penetrating keratoplasty: a 30-year experience. Arch Ophthalmol. 2006;124(6): 777-780. https://doi.org/10.1001/archopht.124.6.777.
  2. Biswas S. Missense mutations in COL8A2, the gene encoding the alpha2 chain of type VIII collagen, cause two forms of corneal endothelial dystrophy. Hum Mol Genet. 2001;10(21):2415-2423. https://doi.org/10.1093/hmg/10.21.2415.
  3. Krafchak CM, Pawar H, Moroi SE, et al. Mutations in TCF8 cause posterior polymorphous corneal dystrophy and ectopic expression of COL4A3 by corneal endothelial cells. Am J Hum Genet. 2005;77(5):694-708. https://doi.org/10.1086/497348.
  4. Vithana EN, Morgan PE, Ramprasad V, et al. SLC 4A11 mutations in Fuchs endothelial corneal dystrophy. Hum Mol Genet. 2008;17(5):656-666. https://doi.org/10.1093/hmg/ddm337.
  5. Vithana EN, Morgan P, Sundaresan P, et al. Mutations in sodium-borate cotransporter SLC 4A11 cause recessive congenital hereditary endothelial dystrophy (CHED 2). Nat Genet. 2006;38(7): 755-757. https://doi.org/10.1038/ng1824.
  6. Thalamuthu A, Khor CC, Venkataraman D, et al. Association of TCF4 gene polymorphisms with Fuchs’ corneal dystrophy in the Chinese. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011;52(8):5573-5578. https://doi.org/10.1167/iovs.11-7568.
  7. Baratz KH, Tosakulwong N, Ryu E, et al. E 2-2 protein and Fuchs’s corneal dystrophy. N Engl J Med. 2010;363(11):1016-1024. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1007064.
  8. Nanda GG, Padhy B, Samal S, et al. Genetic association of TCF4 intronic polymorphisms, CTG18.1 and rs17089887, with Fuchs’ endothelial corneal dystrophy in an Indian population. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55(11):7674-7680. https://doi.org/10.1167/iovs.14-15297.
  9. Forrest MP, Hill MJ, Quantock AJ, et al. The emerging roles of TCF4 in disease and development. Trends Mol Med. 2014;20(6): 322-331. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2014.01.010.
  10. Breschel TS, McInnis MG, Margolis RL, et al. A novel, heritable, expanding CTG repeat in an intron of the SEF2-1 gene on chromosome 18q21.1. Hum Mol Genet. 1997;6(11):1855-1863.
  11. Wieben ED, Aleff RA, Tosakulwong N, et al. A common trinucleotide repeat expansion within the transcription factor 4 (TCF4, E2-2) gene predicts Fuchs corneal dystrophy. PLoS One. 2012;7(11):e49083. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0049083.
  12. Wieben ED, Aleff RA, Tang X, et al. Trinucleotide repeat expansion in the transcription factor 4 (TCF4) gene leads to widespread mRNA splicing changes in Fuchs’ endothelial corneal dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017;58(1):343-352. https://doi.org/10.1167/iovs.16-20900.
  13. Wieben ED, Aleff RA, Eckloff BW, et al. Comprehensive assessment of genetic variants within TCF4 in Fuchs’ endothelial corneal dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55(9):6101-6107. https://doi.org/10.1167/iovs.14-14958.
  14. Дронов М.М. Глубокая дистрофия роговой оболочки и методы её лечения: Автореф. дис. … канд. мед. наук. – Л., 1978. – 16 с. [Dronov MM. Glubokaya distrofiya rogovoy obolochki i metody ee lecheniya. [dissertation] Leningrad; 1978. 16 p. (In Russ.)]
  15. Назаров В.Д., Лапин С.В., Гавриченко А.В., и др. Выявление экспансии тринуклеотидных повторов при болезни Гентингтона // Медицинская генетика. – 2017. – Т. 16. – № 3. – С. 24–29. [Nazarov VD, Lapin SV, Gavrichenko AV, et al. Investigation of trinucleotides expansion level in Huntington disease with triplet repeats PCR. Medical Genetics. 2017;16(3):24-29. (In Russ.)]
  16. Soliman AZ, Xing C, Radwan SH, et al. Correlation of severity of Fuchs endothelial corneal dystrophy with triplet repeat expansion in TCF4. JAMA Ophthalmol. 2015;133(12):1386-1391. https://doi.org/10.1001/jamaophthalmol.2015.3430.
  17. Vasanth S, Eghrari AO, Gapsis BC, et al. Expansion of CTG18.1 trinucleotide repeat in TCF4 is a potent driver of Fuchs’ corneal dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015;56(8):4531-4536. https://doi.org/10.1167/iovs.14-16122.
  18. Eye Bank Association of America. 2015 Eye Banking Statistical Report. EBAA; 2016.
  19. Eghrari AO, Vasanth S, Wang J, et al. CTG18.1 Expansion in TCF4 Increases likelihood of transplantation in Fuchs corneal dystrophy. Cornea. 2017;36(1):40-43. https://doi.org/10.1097/ICO.0000000000001049.
  20. Zarouchlioti C, Sanchez-Pintado B, Hafford Tear NJ, et al. Antisense therapy for a common corneal dystrophy ameliorates TCF4 repeat expansion-mediated toxicity. Am J Hum Genet. 2018;102(4): 528-539. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2018.02.010.
  21. Hu J, Rong Z, Gong X, et al. Oligonucleotides targeting TCF4 triplet repeat expansion inhibit RNA foci and mis-splicing in Fuchs’ dystrophy. Hum Mol Genet. 2018;27(6):1015-1026. https://doi.org/10.1093/hmg/ddy018.
  22. Luther M, Grunauer-Kloevekorn C, Weidle E, et al. TGC repeats in intron 2 of the TCF4 gene have a good predictive power regarding to Fuchs endothelial corneal dystrophy. Klin Monbl Augenheilkd. 2016;233(2):187-194. https://doi.org/10.1055/s-0035-1546138.
  23. Mootha VV, Gong X, Ku HC, Xing C. Association and familial segregation of CTG18.1 trinucleotide repeat expansion of TCF4 gene in Fuchs’ endothelial corneal dystrophy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55(1):33-42. https://doi.org/10.1167/iovs.13-12611.
  24. Nakano M, Okumura N, Nakagawa H, et al. Trinucleotide repeat expansion in the TCF4 gene in Fuchs’ endothelial corneal dystrophy in Japanese. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2015;56(8):4865-4869. https://doi.org/10.1167/iovs.15-17082.
  25. Xing C, Gong X, Hussain I, et al. Transethnic replication of association of CTG18.1 repeat expansion of TCF4 gene with Fuchs’ corneal dystrophy in Chinese implies common causal variant. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014;55(11):7073-7078. https://doi.org/10.1167/iovs.14-15390.
  26. Антонова О.П. Современные аспекты диагностики и лечения первичной эндотелиальной дистрофии роговицы (Фукса): Дис. … канд. мед. наук. – М., 2016. – 127 с. [Antonova OP. Sovremennye aspekty diagnostiki i lecheniya pervichnoy endotelial’noy distrofii rogovitsy (Fuksa). [dissertation] Moscow; 2016. 127 p. (In Russ.)]

Supplementary files

Supplementary Files Action
1. Fig. 1. Electrophoregram of the screening study of the number of CTG repeats in the TCF4 gene. Patients have no expansion of CTG repeats in the TCF4 gene View (44KB) Indexing metadata
2. Fig. 2. Electrophoregram screening study of the number of CTG repeats in the TCF4 gene. Expansion required View (38KB) Indexing metadata
3. Fig. 3. PCR electrophoregram with triple repeat priming in a patient with an expansion of CTG repeats in the TCF4 gene View (119KB) Indexing metadata
4. Fig. 4. The prevalence of expansion of CTG repeats in the TCF4 gene in the group of patients with FECD View (27KB) Indexing metadata
5. Fig. 5. The number of repetitions in the group of patients FECD and the comparison group View (50KB) Indexing metadata

Views

Abstract - 107

PDF (Russian) - 121

Cited-By


PlumX

Comments on this article

View all comments

Copyright (c) 2019 Papanyan S.S., Astakhov S.Y., Nazarov V.D., Lapin S.V., Novikov S.A., Riks I.A., Anikina L.K., Dovydenko K.S.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.