Morphological study of idiopathic epiretinal membranes and their cytokine profile

Cover Page

Abstract


The article presents comparative morphological analysis and assessment of response to antigens of fibronectin, laminin, glial fibrillary acidic protein (GFAP) in idiopathic epiretinal membranes (iERM). Authors found a comparable positive iERM reaction to fibronectin and GFAP, which indicates the involvement of these cytokines in the development and progression of the posterior segment neurodegenerative process. Cellular elements in the vitreous gel responsible for iERM formation were fibroblasts, myofibroblasts, hyalocytes, and retinal radial glial cells. Retinal radial glial cells play the main role in the recurrent iERM formation.

Conclusion. Due to its hemodynamic, nootropic, neurotrophic action, the investigated bioregulatory complex increases the optic nerve tolerance to the stress effect of IOP, SBP, and DBP asynchronous fluctuations, and improves the ocular blood perfusion.


Full Text

Введение

Частота развития идиопатических эпиретинальных мембран (иЭРМ) варьирует от 1,5 до 4,5 %, при этом в 28,6 % случаев отмечается их прогрессирующее течение [3]. Патогенетические механизмы формирования иЭРМ до сих пор остаются противоречивыми. Известно, что развитие иЭРМ происходит в результате миграции и пролиферации глиальных клеток из дефектов во внутренней пограничной мембране сетчатки (ВПМ), которые образуются при патологической задней отслойке стекловидного тела (СТ) [5, 9, 10]. По данным литературы, морфологическая взаимосвязь СТ и сетчатки осуществляется при участии гликопротеинов фибронектина и ламинина [4]. В единичных исследованиях указывается на обнаружение фибронектина в эпиретинальных и субретинальных мембранах, установлено изменение показателей фибронектина и ламинина в СТ у пациентов с иЭРМ и макулярным отверстием [1, 13]. Исходы хирургического лечения иЭРМ во многом зависят от давности и тяжести процесса, степени адгезии иЭРМ с подлежащей сетчаткой, поэтому углублённое изучение морфологических аспектов развития иЭРМ является актуальной проблемой.

Цель работы: определить морфологические особенности иЭРМ, выявить антигены фибронектина, ламинина и глиального фибриллярного кислого белка.

Материалы и методы исследования

Для проведения исследования были использованы 15 фрагментов иЭРМ, удалённых во время витрэктомии. В трёх случаях иЭРМ были повторные и удалялись в течение 10–15 месяцев после первичной операции. Фрагменты мембран фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заливали в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы готовили на микротоме LEICA RM 2145 (Германия), которые окрашивали гематоксилином и эозином по Маллори. Для выявления эластических волокон проводили окраску резорцин фуксином по Вейгерту с докраской литиевым кармином Орта.

Для иммуногистохимических исследований парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали с помощью иммуногистостейнера Leica Microsystems Bond™ (Германия). В качестве первых антител применяли: фибронектин в разведении 1 : 100 (номер по каталогу sc 8422), ламинин в разведении 1 : 100 (номер по каталогу sc 6018), глиальный фибриллярный кислый белок (ГФКБ) в разведении 1 : 300 (номер по каталогу sc 33673) (Santa Cruz Biotechnology, США). Для окрашивания использовали непрямую стрептавидин-биотиновую систему детекции Leica BOND (Novocastra™, Германия). Оценку специфичности реакции проводили при окрашивании срезов без первичных антител. Исследование и визуализацию препаратов проводили с использованием светового микроскопа AxioImager Z1, оснащённого фотонасадкой ProgRes C3 и программой анализа изображений Axiovision (Carl Zeiss, Германия). Морфометрию объектов проводили при увеличении ×1000 с иммерсией. Для обработки числовых данных использовали параметрический анализ по Стьюденту.

Результаты исследования и обсуждение

Идиопатические иЭРМ представляли собой различной толщины непрерывные фибриллярные мембраны, с волокнистым строением, инфильтрированные различными фибробластическими клетками: фибробластами, ламиноцитами, миофибробластами (рис. 1). Также на поверхности мембраны встречались гиалоциты округлой формы, относящиеся к клеткам макрофагального ряда. Клетки воспалительного ряда, такие как лимфоциты, нейтрофилы, лаброциты, отсутствовали. Толщина мембран варьировала от 6,03 ± 1,6 до 7,56 ± 2,9 мкм.

В некоторых мембранах присутствовали утолщения с отложениями фибриллярных компонентов. При окраске по Маллори все идиопатические иЭРМ окрашивались в интенсивный синий цвет, что свидетельствовало о наличии в них коллагеновых волокон, которые имели вид разнокалиберных образований от тонких фибрилл до утолщённых плотных пучков, направленных вдоль мембраны (см. рис. 1).

 

 

Рис. 1. Идиопатическая эпиретинальная мембрана. Отложения коллагеновых волокон в эпиретинальной мембране (окрашивание в синий цвет). Окраска по Маллори

Fig. 1. Idiopathic epiretinal membranes. Collagen fibers deposition in the epiretinal membrane (blue staining). Mallory staining

 

Реакция всех исследуемых препаратов на присутствие белка эластина во всех случаях была отрицательной. Выявленные плотные коллагеновые волокна в иЭРМ, не содержащие белка эластина, свидетельствуют о низкой степени их растяжимости и определённых тракционных свойствах.

В эпиретинальных мембранах, которые клинически сочетались с ламеллярным разрывом сетчатки, в макулярной области среди фибробластических клеток выявлялись очаги скоплений миофибробластов (рис. 2).

 

 

Рис. 2. Гистологическая картина эпиретинальной мембраны пациента с псевдоразрывом сетчатки. Определяются коллагеновые волокна (синий цвет) и скопления миофибробластов. Окраска по Маллори

Fig. 2. Epiretinal membrane histology in the patient with retinal pseudotear. Collagen fibers (blue staining) and myofibroblasts accumulation are seen. Mallory staining

 

Ядра этих клеток были вытянутой удлинённой формы. В широком ободке цитоплазмы содержались тонкие параллельные филаменты, имеющие оранжевый цвет при окраске по Маллори (см. рис. 2), что является признаком миофибриллярной дифференцировки. Миофибробласты располагались пристеночно возле мембраны и образовывали массивные пролиферирующие инфильтраты, состоящие из нескольких рядов. Линейная ориентация клеток вдоль тяжей пролиферации может играть роль в феномене сокращения мембран. Известно, что миофибробласты являются основным типом клеток в мембранах со значительным тракционным компонентом [12]. По данным C. Guidry (1996), радиальные глиоциты могут трансформироваться в миофибробласты. При изменении фенотипа нейроглиальных клеток на фибробластический экспрессия ГФКБ редуцировалась, а α-актин гладкомышечных клеток в цитоплазме накапливался [7].

В 66,7 % (n = 8) у иЭРМ отмечалась положительная реакция на фибронектин различной степени интенсивности. Более интенсивное окрашивание определялось возле ламиноцитов и фибробластических клеток (рис. 3).

 

 

Рис. 3. Положительная реакция эпиретинальной мембраны на фибронектин (коричневое окрашивание). Непрямой иммунопероксидазный метод выявления фибронектина с докраской гематоксилином

Fig. 3. Epiretinal membrane positive reaction to fibronectin (brown staining). Indirect immunoperoxidase method for detecting fibronectin with additional hematoxylin staining was used

 

Фибронектин является гликопротеином внеклеточного матрикса и может играть роль хемоаттрактанта клеток, образовывать каркас для их миграции, обладает высоким сродством к основным компонентам СТ, к коллагену II типа и гиалуроновой кислоте [1, 13]. Фибронектин продуцируется в основном фибробластоподобными клетками, а также другими клетками: клетками пигментного эпителия, радиальными глиоцитами, гиалоцитами [6].

Реакция иЭРМ на ламинин была не выражена, он выявлялся фрагментарно в виде следов на поверхности мембраны в непосредственной близости от фибробластических клеток (рис. 4).

 

Рис. 4. Положительная реакция на ламинин (↑). Непрямой иммунопероксидазный метод выявления ламинина с докраской гематоксилином

Fig. 4. Positive reaction to laminin (↑). Indirect immunoperoxidase method for detecting laminin with additional hematoxylin staining was used

 

ГФКБ обнаруживался как в умеренном, так и в большом количестве на поверхности мембраны с ретинальной стороны. Он локализовался независимо от расположения фибробластических клеток (рис. 5), видимо, он секретировался радиальными глиоцитами сетчатки, цитоплазма которых интенсивно окрашивалась, что согласуется со многими исследованиями [11]. Известно, что ГФКБ является биомаркером глиальных клеток сетчатки (астроцитов и активированных мюллеровских глиоцитов), которые играют основную роль в формировании глиального рубца [2, 5, 10, 13]. Также ГФКБ выявлялся при иммуногистохимическом окрашивании в цитоплазме гиалоцитов СТ [8].

 

Рис. 5. Эпиретинальная мембрана. Положительная реакция на глиальный фибриллярный кислый белок (коричневое окрашивание) на ретинальной стороне мембраны (↑). Непрямой иммунопероксидазный метод выявления глиального фибриллярного кислого белка с докраской гематоксилином

Fig. 5. Epiretinal membrane. Positive reaction to glial fibrillary acidic protein (brown staining) on the retinal side of the membrane is seen (↑). Indirect immunoperoxidase method for detecting glial fibrillary acidic protein with additional hematoxylin staining was used

 

Реакция иЭРМ на ГФКБ коррелировала с интенсивностью окраски мембран на фибронектин, что указывает на значимость данного гликопротеина в развитии нейродегенеративного процесса.

Рецидивирующие иЭРМ имели определённое гистохимическое отличие. В целом плотность клеток витреальной полости в них была значительно меньше по сравнению с первичными мембранами (p < 0,05). Встречались только ламиноциты непосредственно в толще мембраны, а также радиальные глиоциты. Фибронектин и ламинин не определялись вовсе, а ГФКБ выявлялся очень интенсивно непосредственно в самой мембране, а не откладывался на её поверхности (рис. 6). Следовательно, иммунопозитивные клетки по ГФКБ образовывали саму рецидивирующую мембрану.

 

Рис. 6. Рецидивирующая эпиретинальная мембрана: a) низкая клеточная плотность. Окраска гематоксилином и эозином; b) ГФКБ-позитивная мембрана. Непрямой иммунопероксидазный метод выявления ГФКБ с докраской гематоксилином

Fig. 6. Recurrent epiretinal membrane: a) low cell density. H & E staining; b) GFAP-positive membrane. Indirect immunoperoxidase method for detecting GFAP with additional hematoxylin staining was used

 

Выраженная клеточная активность и высокая плотность фибробластических клеток в иЭРМ способствуют фиброзированию, утолщению мембраны и усилению тракционного воздействия на сетчатку, поэтому удаление СТ и пилинг внутренней пограничной мембраны вполне оправданы. Данные манипуляции способствуют предупреждению тракционного синдрома, прогрессированию дегенеративного процесса в этих глазах. В результате элиминации коллагенпродуцирующих клеток реакция мембран на фибронектин, эластин и ламинин была отрицательной или незначительной. Напротив, реакция на ГФКБ в рецидивирующих иЭРМ была наиболее выражена, что указывает на основную роль глиальных клеток при формировании данного типа эпиретинальных мембран.

Таким образом, сопоставимая положительная реакция иЭРМ на фибронектин и ГФКБ может означать участие данных цитокинов в развитии и прогрессировании нейродегенеративного процесса в заднем отрезке глаз. В первичных иЭРМ ответственными за её формирование клеточными элементами являлись клетки СТ — фибробласты, миофибробласты, гиалоциты и клетки сетчатки — радиальные глиоциты. В формировании рецидивирующей иЭРМ основная роль отводится только радиальным глиоцитам сетчатки.

About the authors

Ural R Altynbaev

OAO “Tatneft”

Author for correspondence.
Email: uralaltynbaev@rambler.ru

Russian Federation MD, PhD. Ophthalmology Department, Medical Unit

Anna I Lebedeva

Federal State Institution “All-Russian Eye and Plastic Surgery Center”

Email: morpholetter@yandex.ru

Russian Federation PhD, head of histology and immunohistochemistry laboratory. Morphology Department

References

  1. Алтынбаев У.Р. Оценка уровня гликопротеинов в стекловидном теле при различных дегенеративных заболеваниях центральной области сетчатки // Казанский медицинский журнал. – 2015. – Т. 96. – № 3. – С. 358–360. [Altynbaev UR. Ocenka urovnja glikoproteinov v steklovidnom tele pri razlichnyh degenerativnyh zabolevanijah central’noj oblasti setchatki. Kazanskij medicinskij zhurnal. 2015;96(3):358-360. (In Russ.)]
  2. Bravo R, Macdonald-Bravo H. Changes in the nuclear distribution of cyclin (PCNA) but not its synthesis depend on DNA replication. EMBO J. 1985;4(3):655-61.
  3. Fraser-Bell SI, Guzowski M. Five-year cumulative incidence and progression of epiretinal membranes: the Blue Mountains Eye Study. Ophthalmology. 2003;110(1):34-40. doi: 10.1016/S0161-6420(02)01443-4.
  4. Foos RY. Vitreoretinal juncture; topographical variations. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1972;11:801.
  5. Hikichi T, Takahashi M. Relationship between premacular cortical vitreous defects and idiopathic premacular fibrosis. Retina. 1995;15(5):413-416. doi: 10.1097/00006982-199515050-00007.
  6. Grisanti SI, Heimann K, Wiedemann P. Origin of fibronectin in epiretinal membranes of proliferative vitreoretinopathy and proliferative diabetic retinopathy. Br J Ophthalmol. 1993;77(4):238-42.
  7. Guidry C. Isolation and characterization of porcine Müller cells. Myofibroblastic dedifferentiation in culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1996;37(5):740-52. doi: 10.1136/bjo.77.4.238.
  8. Kohno RI, Hata Y. Possible contribution of hyalocytes to idiopathic epiretinal membrane formation and its contraction. Br J of Ophthalmology. 2009;93(8):1020-1026. doi: 10.1136/bjo.2008. 155069.
  9. Kishi S, Demaria C. Vitreous cortex remnants at the fovea after spontaneous vitreous detachment. International Ophthalmology. 1986;9(4):253-260. doi: 10.1007/BF00137539.
  10. Mandal N, Kofod M. Proteomic analysis of human vitreous associated with idiopathic epiretinal membrane. Acta Ophthalmologica. 2013;91(4):333-334. doi: 10.1111/aos.12075.
  11. Schumann RG, Eibl KH, Zhao F, et al. Immunocytochemical and ultrastructural evidence of glial cells and hyalocytes in internal limiting membrane specimens of idiopathic macular holes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2011;52(11):7822-7834. doi: 10.1167/iovs.11-7514.
  12. Snead DR, Cullen N. Hyperconvolution of the inner limiting membrane in vitreomaculopathies. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2004;242(10):853-862. doi: 10.1007/s00417-004-1019-3.
  13. Weller MI, Wiedemann P. The significance of fibronectin in vitreoretinal pathology. A critical evaluation. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 1988;226(3):294-298. doi: 10.1007/BF02181200.

Statistics

Views

Abstract - 579

PDF (Russian) - 277

Cited-By


PlumX


Copyright (c) 2016 Altynbaev U.R., Lebedeva A.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies