ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ СКАНИРУЮЩЕЙ (АТОМНО-СИЛОВОЙ И ЭЛЕКТРОННОЙ) МИКРОСКОПИИ В НАНОГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ (на примере преэклампсии)

Полный текст

Антенатальная охрана плода - одна из наиболее актуальных задач перинатологии, тесно связанная с проблемами снижения перинатальной заболеваемости и смертности, частота которых в значительной степени зависит от экстрагенитальных заболеваний матери, функции плаценты, характера течения беременности, осложнений родов [1. 2]. Несмотря на многолетнее изучение, пре-эклампсия по-прежнему остается серьезной проблемой, обусловленной тяжелыми последствиями этого заболевания [3-6]. Инновационные методы в патоморфологии делают возможным получение новых данных для решения клинических вопросов профилактики и коррекции преэклампсии [7-9]. В связи с этим, целью настоящего исследования явилось изучение эритроцитов женщин, беременность которых осложнена преэклампсией с помощью атомно-силовой и электронной сканирующей микроскопии.

Материалы и методы

В работе использован клинический материал обследования пациенток, беременность у которых осложнялась преэк-лампсией с умерено выраженным (50 женщин) и тяжелым (30 женщин) течением (основная группа). Контрольную группу составили 20 беременных. Проводилось изучение акушерского анамнеза, сопутствующей экстрагенитальной патологии, течения беременности и родов. Исследование морфологических свойств эритроцитов выполнено при помощи гемосканирования, эритроцитометрии и элементного анализа форменных элементов крови и проводились в растровом микроскопе «FE1 Quanta 200 3D». Кровь на исследование брали из вены в количестве 2,5±0,5 мл.

Нами была проведена зондовая и электронная сканирующая микроскопия эритроцитов с использованием больших полей сканирования с выполнением топографии поверхности и их морфометрии. При исследовании в электронном микроскопе были изучены различные формы эритроцитов в зависимости от их поверхностной архитектоники и размеров.

Элементный анализ кислорода, осуществляли с использованием детектора для регистрации спектров характеристического рентгеновского излучения фирмы EPAX, которые были интегрированы с растровым электронным микроскопом «Quanta 600 FEG». Помимо этого, проведено изучение тканей с применением атомно-силового микроскопа «Ntegra-Aura». Обработку и построение АСМ-изображений проводили при помощи программного обеспечения «NOVA» (НТ-МДТ, Россия) и «Image Analysis» (НТ-МДТ, Россия).

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с помощью Microsoft Excel и Statistica 6.0. В целях определения репрезентативности исследования высчитывался коэффициент вариации (V<33%), далее применялся t-критерий Стьюдента для оценки значимости расхождения между средними выборочных совокупностей, была оценена однородность исследуемых совокупностей на основе коэффициента вариации.

Результаты и их обсуждение

Результаты гемосканирования показали, что у женщин с преэклампсией эритроциты имели склонность к стазу, сладж-феномену и тромбозу. Основная часть клеток была представлена дискоцитами (89.71 ± 2,35 в контрольной группе, 75,50±1,25 при преэклампсии умерено выраженной и 72,50±2,31 - тяжелой). При этом, данный показатель был достоверно выше (р<0,05) в сравнении с группами пациенток без патологии беременности (табл. 1).

Большая часть эритроцитов имела округлую форму. Однако наблюдались клетки вытянутой формы, что может свидетельствовать как о нарушении эластичности мембран, так и затруднении прохождения через микроциркуляторное русло в связи с изменением его строения. Увеличивалось содержание цитоплазматических мостиков между клетками, что способствовало в дальнейшем тромбозу сосудов. Происход и-ло нарушение строения плазматических мембран клеток. Изменялась архитектоника плазматических отростков.

 

Таблица 1 Изменения формы эритроцитов у беременных женщин с преэклампсией

Морфологические формы эритроцитов	Контрольная группа (20)	Преэклампсия умерено выраженная (50)	Преэклампсия тяжелая (30)
Дискоциты (%)	89,71±2,35	70,61±2,44*	62.67±2,01**
Обратимо измененные (переходные) (%)	10,00±1,46	19,06±2,35*	21,00±2,31**
Необратимо измененные: (предгемолитические) (%)	0,15±0,16	6,19±1,10*	10,11±1,67**
Дегенеративные формы (%)	0,15±0,15	4,15±0,56*	7,23±0,82**

* р<0,05 в сравнении с контрольной группой

** р<0,05 в сравнении между группами с преэклампсией различной степени тяжести

 

Нами показано, что содержание мик-роцитов при преэклампсии средней степени тяжести (18,20±1,41%) было достоверно выше в сравнении с контрольной группой (14,30±1,52%) (р<0,05) (табл. 2). Наблюдалась тенденция к уменьшению их содержания при тяжелом течении заболевания. Содержание макроцитов прогрессивно возрастало (р<0,05) по мере увеличения тяжести заболевания (1,40±0,14%, 6,30±0,14% и 15,30±1,15%). Диаметр нормоцитов, макроцитов и микроцитов достоверно не отличался от контрольной группы.

 

Таблица 2. Соотношение видов эритроцитов у беременных без патологии и с преэклампсией

Соотношение размеров эритроцитов	Контрольная группа (20)	Преэклампсия умерено выраженная (50)	Преэклампсия тяжелая (30)
Микроциты (%)	14,30±1,52	18,20±1,41*	12,20±1,50*
Нормоциты (%)	84,30±1,41	75,50±1,25*	72,50±2,31*
Макроциты (%)	1,40±0,14	6,30±0,14*	15,3 0± 1,15 *

* р<0,05 в сравнении с контрольной группой

 

Содержание переходных форм эритроцитов достоверно увеличивалось по мере возрастания тяжести заболевания (19.06 ± 2,35% и 21,00±2,31%) по сравнению с группой практически здоровых беременных (10,00±1,46%) (р<0,05) (табл. 1). Так, число элепсовидных клеток было 3,06±1,05% при преэклампсии средней тяжести и 4,00 ± 0.09% - тяжелой. Последний показатель достоверно выше (р<0,05), чем в контрольной группе (2,50±0,08%). Дискоциты с гребнем составляли при осложненной беременности: 2,40±0,30% и 2,80±0,30% (1,00 ± 0,09%) (р<0,05), клетки в виде плоских дисков -3,60±0,85% и 4,00±0,09% (1,00 ± 0,30%) (р<0,05), дискоциты с выростом -2,50±0,35% и 2,40±0,30% (1,40±0,04%) (р<0,05), дискоциты с множественными выростами - 4,50±1,05% и 4,60±0,08 % (2,60±0,31 %) (р<0,05), эритроциты в виде «тутовой ягоды» - 3,00±0,45% и 3,2±2,39% (0,50±2,39%) (р<0,05).

Еще в большей степени, прогрессировало содержание необратимо измененных (предгемолитических) клеток (0,15±0,16%, 6,19±1,10% и 10,11±1,67%) (р<0,05). Так, если в контрольной группе куполообразные клетки практически не встречались, то при преэклампсии в зависимости от тяжести состояния они составляли соответственно 1,40±0,04% и 3,50±0,50% (р<0,05). Аналогичная тенденция выявлена при исследовании сферических форм эритроцитов (1,60 ±

0,28% и 4,50±1,30%) (р<0,05). Если в контрольной группе наблюдались единичные клетки в виде «спущенного мяча», то при патологии беременности их величина возрастала до 2,19±0,15% и 4,11±1,20% (р<0,05). При преэклампсии резко возрастало содержание дегенеративных форм эритроцитов (0,15±0,15%, 4.15±0,56% и 7,23±0,82%) (р<0,05). Все эти виды измененных эритроцитов не подлежат восстановлению. Они относятся к группе необратимо деформированных или предгемолити-ческих. Возрастал уровень разрушенных эритроцитов (рис. 1. 2. 3).

 

Рис. 1. Эритроциты крови у беременных женщин с умерено выраженной преэклампсией РЭМ. рис. а (х5000), рис. б (х10000), рис. в (10000), рис. г (х20000)

 

Клетки в состоянии стаза, сладжа и начала тромбоза. Дискоциты в виде неправильного овала или с нарушенной формой. Наблюдаются нормоциты, макроциты, микроциты. Содержание клеток с выростами уменьшено. Кривизна центрального углубления различна, как и его глубина. Выявлены необратимо измененные (предгемо-литические) эритроциты в виде сферы и «спущенного мяча». Содержание цитоплазматических мостиков между клетками увеличено.

При изучении поверхности эритроцитов с помощью атомно-силовой микроскопии было показано, что глубина впадины дискоцитов подсчитанная с помощью изучения профиля клетки в среднем составляла 0.30±0,07 цм, 0,40±0,05 цм, что значительно отличалось от контрольной группы (0.25±0,06 цм) (р<0,05). При изучении соотношения диаметра эритроцита к диамет- 16±2 и 14±1 единиц (21±2 в контрольной ру впадины данная величина составляла группе) (р<0,05) (табл. 3).

 

Таблица 3. Поверхность неизмененных эритроцитов (зондовая микроскопия) (100% — все эритроциты)

Размеры эритроцитов	Контрольная группа (20)	Преэклампсия умерено выраженная (50)	Преэклампсия тяжелая (30)
Глубина впадины дискоцитов (цм)	0,25±0,06	0,30±0,07	0,40±0,05
	21±2	16±2	14±1

* р<0,05 в сравнении между группами с преэклампсией различной степени тяжести

** р<0,05 в сравнении с контрольной группой

 

При изменении нормальной дискои дальной формы на поверхности эритроцитов, наряду с такими структурами, формировались более крупные выступы. Строение пор было нарушено во всех группах - (рис. 2).

 

Рис. 2. Эритроциты крови у беременных женщин с тяжелой формой преэклампсии. Дискоциты в форме неправильного овала (а, б). Кривизна и глубина центрального углубления изменена. Наблюдаются клетки куполооблазные, в виде сферы и «спущенного мяча». Начало гемолиза клеток (а, б). Строение пор на поверхности эритроцитов нарушено (в, г). Атомно-силовая микроскопия. (рис. а, б - трехмерная гистограмма; рис. в, г - двухмерная гистограмма)

 

 

Рис. 3. Эритроциты крови у беременных женщин с тяжелой формой преэклампсии. Дискоциты в форме неправильного овала (а, б, в). Кривизна и глубина центрального углубления изменена. Атомно-силовая микроскопия. (рис. а, б - трехмерная гистограмма; рис. в - двухмерная гистограмма, г - графическое изображение размеров эритроцита)

 

Таблица 4. Содержание кислорода в эритроцитах внутри сосудов ворсин (пропорциональное содержание атомов микроэлемента в % от общего числа содержания атомов в эритроците)

 

Элемент	Контроль	Преэклампсия умерено выраженная	Преэклампсия тяжелая
O	24, 25±2,31	17,51±2,03*	15,42±2,65**
Всего	100	100	100

* р<0,05 по сравнению с практически здоровыми беременными женщинами

** р<0,05 по сравнению с пациентами с преэклампсией

 

При изучении содержания кислорода в эритроцитах было выявлено, что содержание кислорода внутри эритроцитов в основной группе было статистически достоверно ниже, чем в контрольной группе, а в процентном соотношении эта разница составила 18%.

Выводы

1. С помощью сканирующей электронной и атомно-силовой микроскопии проведен обзор и анализ результатов исследования трехмерных форм эритроцитов при преэклампсии различной тяжести. Показано, что форма эритроцита является диагностическим индикатором заболевания.
2. Содержание переходных форм эритроцитов достоверно увеличивалось по мере возрастания тяжести преэклампсии. Еще в большей степени, прогрессировало содержание необратимо измененных (предгемолитических) клеток. Возрастал уровень разрушенных эритроцитов.
3. Структура плазмолеммы клеток была нарушена. Изменялась архитектоника плазматических отростков. Нарушалось строение пор плазмолеммы клеток. Увеличивалось содержание цитоплазматических мостиков между клетками, что способствовало стазу, сладжированию и тромбозу.
4. Отмечено изменение степени двоя-ковогнутости нормальных эритроцитов. Глубина впадины дискоцитов, подсчитанная с помощью изучения профиля клетки значительно отличалось от контрольной группы, как и соотношения диаметра эритроцита к диаметру впадины.
5. Содержание кислорода внутри эритроцитов в группе преэклампсии было статистически достоверно ниже на 18%, чем в контрольной группе.

Конфликт интересов отсутствует.

Об авторах

Т. В. Павлова

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский
университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: pavlova@bsu.edu.ru
д.м.н., проф., зав. кафедрой патологии Россия

Л. А. Павлова

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский
университет»

Email: lpavlova@bsu.edu.ru
д.м.н., проф. кафедры патологии Россия

В. А. Петрухин

Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

Email: 1akmoniiag@mail.ru
д.м.н., проф., руководитель I акушерской клиники Россия

Н. Б. Пилькевич

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего образования «Белгородский государственный национальный исследовательский
университет»

Email: pilkevich@bsu.edu.ru
д.м.н., проф. кафедры патологии Россия

А. В. Селиванова

Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа

Email: okb@bel.ru
врач акушер-гинеколог перинатального центра Россия

И. С. Сырцева

Белгородская областная клиническая больница Святителя Иоасафа

Email: innessita25@mail.ru

врач анестезиолог-реаниматолог

Россия

А. Н. Каплин

Курский государственный медицинский университет

Email: drkaplin@rambler.ru
ассистент кафедры патологической анатомии Россия

Список литературы

Дополнительные файлы