IN VITRO EFFECT OF L-CARNITINE ON THE ACTIVITY OF LYSOSOMAL CYSTEINE PROTEASES AND THE STATE OF LYSOSOMAL MEMBRANE

Cover Page

Abstract


The influence of L-carnitine in vitro on the lysosomal cysteine proteinase activity and stability of the lysosomal membrane of the liver homogenates of intact sexually Mature female rats of Wistar line weighing 280-330 g were studied. In the experimental groups isolated lysosomes were incubated in vitro in a solution of L-carnitine during 1, 2 and 4 hours, in the control groups in vitro incubation was carried out in a medium of isolating solution. The activity of ca-thepsins B, L and H was investigated by spectrofluorimetric method of Barrett & Kirschke in two fractions - lysosomal and outside of lysosomes. The activity of acid phosphatase was used as the main marker of a membrane labilization. In vitro incubation of lysosomes showed that carnitine at a concentration of 5 mM increases the total activity of cathepsin B in a one-hour incubation at 73,2% (p=0,008), cathepsin L in a two- and four-hour incubation - at 77,7% (p=0,005) and 42,3% (p=0,013) respectively, and reduces the overall activity of the cathepsin H in a one-hour incubation at 200,0% (p=0,008), in a two-hour - by 67,9% (p=0,05), in a four-hour -27,1% (p=0,02). In addition, incubation in 5 mM L-carnitine solution leads to an increase of unsedimentable activity and fall sedimentaries activity for cathepsin L in a two-hour, and for acid phosphatase - in a two - and four-hour exposure. 5 mM L-carnitine in one - and two-hour incubation stabilizes lysosomal membrane (whereas increase in incubation time up to 4 hours leads to its damage) and increases the selective permeability of the lysosomal membrane for the studied cathepsins, to the greatest extent - for cathepsin H.


Full Text

Лизосомальные цистеиновые протеиназы (ЛЦП) относятся к семейству папаиноподобных протеолитических ферментов, характеризуются уникальной направленностью действия и неравномерной выработкой различными тканями. В живых организмах активность тиоловых катепсинов представляет собой тонкий баланс между их экспрессией, направленностью действия, активацией проферментов, подавлением их выработки ингибиторами и дальнейшим распадом. Локализуются ЛЦП преимущественно в лизосомах и поздних эндосомах клетки, однако, могут локализоваться в ядре, цитоплазме и плазматической мембране. Тиоловые катепсины являются важными регуляторами и сигнальными молекулами в неограниченном числе биологических процессов, таких как иммунный ответ, ремоделирование костной ткани, активация предшественников многих белков, дифференцирование кератиноцитов и др. Известна роль катепсинов в развитии мышечной дистрофии, ревматоидного артрита, болезни Альцгеймера, атеросклероза [1-3]. ЛЦП принимают участие в процессах, связанных с раковой прогрессией, таких как апоптоз, метастазирование, опухолевый рост, инвазия и ангиогенез. В тканях многих опухолей показано увеличение активности и содержания цистеиновых протеиназ. Так, в клеточных культурах опухоли простаты наблюдается высокий уровень катепсинов В, L, H и увеличение отношения катепси-ны/ингибиторы по сравнению с культурой нормальных клеток [4]. Активно изучается участие ЛЦП в процессах опосредуемой клеточной гибели. Так, была обнаружена ранняя утечка катепсинов B, D и L в цитозоль, где они активируют каспазы 3 и 9, запуская апоптоз. Также имеются данные о каспазонезависимом пути клеточной гибели, сигналом которого служит пермеабили-зация лизосомальной мембраны (ПЛМ). Наряду с достижением избирательной проницаемости лизосомальной мембраны одним из факторов выхода катепсинов в цитозоль является лабилизация мембраны [5].

В связи с этим важен поиск соединений, способных стабилизировать лизосо-мальную мембрану. Особый интерес представляет L-карнитин, способный в концентрации 5 мМ повышать стабильность лизосомальной мембраны гепатоцитов крысы при часовой  in vitro-инкубации  [6]. На клетках Jurkat было показано, что 5 мМ L-карнитин оказывает защитное действие при апоптозе, что обусловлено ингибированием синтеза церамидов и активности каспаз 3, 7 и 8 [7]. Однако, в ходе исследований, проведенных на клетках карциномы человека, было обнаружено апоптогенное действие 10 мМ карнитина в сочетании с бутиратом [8]. Также было показано, что на фоне гиперго-моцистеинемии L-карнитин приводит к снижению активности катепсинов L и Н и оказывает стабилизирующее влияние на ли-зосомальные мембраны клеток сердечной мышцы [9]. Таким образом, актуальным является изучение влияния L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз и состояние лизосомальной мембраны.

Целью данного исследования стало изучение прямого влияния L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз  in vitro.

Материалы и методы

Выделение лизосом.  За 12 часов до забоя половозрелых интактных крыс-самок линии Wistar массой 280-330 г лишали пищи для стандартизации условий опытов. Эвтаназия животных осуществлялась методом обескровливания под эфирным рауш-наркозом при сохраненном дыхании и сердцебиении. Печень извлекали немедленно после обескровливания, помещая орган в охлажденный 0,25 М раствор сахарозы (среда выделения). Далее печень промывали от остатков крови средой выделения, после чего готовили точные навески участков печени в пределах 740-760 мг на электронных весах (AJH-220 CE, Япония). Полученный материал измельчали ножницами и помещали в стеклянный стакан гомогенизатора «Potter S» (Sartorius, Германия), добавляя холодный 0,25 М раствор сахарозы в соотношении 1:9 и гомогенизировали в течение 35 с тефлоновым пестиком 900 об./мин и зазоре в пределах 0,16-0,24 мм. Описанные процедуры проводили при температуре не выше 4°С. Полученные гомо-генаты центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин (центрифуга CM-6M ELMI, Латвия) для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой в отдельные гильзы и центрифугировали 15 мин при 13000 об./мин для удаления митохондрий, а затем полученный супернатант - дополнительно при 15500 об./мин в течение 30 мин (центрифуга рефрижераторная К 24 Д, ГДР). Осадок, представляющий собой грубую фракцию лизосом, ресуспендировали в 2 мл 0,25 М сахарозы и использовали для  in vitro  исследования.

Инкубация.  Полученные суспензии лизосом печени в 0,25 М сахарозе разделили на две серии по 6 проб в каждой: серию 1 (серия сравнения, 2 мл 0,25 М сахарозы) и серию 2 (1,9 мл 0,25 М сахарозы с добавлением раствора 0,1 мл карнитина с конечной концентрацией 5 мМ). Каждая серия воспроизводилась трижды; инкубация осуществлялась при температуре 37°С на водяной бане в течение 1-го, 2-х и 4-х часов. После инкубации лизосомы повторно осаждали центрифугированием при 15500 об./мин в течение 30 мин. Затем отбирали надосадоч-ную жидкость (неседиментируемая фракция, НСФ), а осадок (седиментируемая фракция, СФ) ресуспендировали в 0,25 М сахарозе с добавлением Тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1%. Полученные аликвоты замораживали и хранили до момента исследования при температуре -20°С не более 1 месяца.

Определение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ.  Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектроф-луориметрическим методом (System 3 Scanning Spectrofluorometr, Optical technology devices, inc. Elmstord, New York, 10523) по Barrett & Kirschke [10]. Удельную активность катепсинов выражали в нкат/г белка. Содержание белка определяли по методу Лоури коммерческим набором Научно-практического центра «Эко-сервис» (Санкт-Петербург, Россия). Описанное измерение активности ферментов осуществлялось раздельно для СФ и НСФ и обозначалось для каждого катепсина как седимен-тируемая активность (СА) и неседиментируемая активность (НСА) соответственно.

Оценка стабильности лизосомальной мембраны.  Для оценки стабильности лизо-сомальной мембраны традиционно используется коэффициент лабильности (Клаб), рассчитываемый как соотношение активности лизосомального фермента во внелизо-сомальной (неседиментируемой) фракции к общей активности (ОА), представляющей собой сумму НСА и СА для данного фермента [11]. Поскольку для лизосомальных-цистеиновых протеиназ описан механизм секреции [12], в качестве основного маркера лабилизации мембран использовали активность кислой фосфатазы [13]. Активность фермента измеряли унифицированным методом по «конечной точке», используя коммерческий набор «Витал Диагно-стикс СПб» (Санкт-Петербург, Россия).

Для каждой выборки определяли значение медианы ^е), верхнего и нижнего квартилей. Результаты представлены в формате Me [Q1; Q3]. Для проверки статистической значимости отличий в контрольной и опытной группе использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты и их обсуждение

Обнаружено, что прямое воздействие карнитина в конечной концентрации 5 ммоль/л приводит к отчетливым изменениям как активности ЛЦП, так и стабильности ли-зосомальной мембраны. Оценка стабильности лизосомальной мембраны по показателю Клаб кислой фосфатазы продемонстрировала, что одно- и двухчасовая инкубация в среде, содержащей 5 мМ L-карнитин, приводит к падению Клаб на 59,6% (р=0,022) и 33,4% (р=0,005) соответственно относительно серий сравнения, что свидетельствует о стабилизации мембраны. Данный вывод совпадает с результатами других авторов [6, 9]. При этом, увеличение времени инкубации до 4-х часов привело к возрастанию Клаб кислой фосфатазы на 33,2% (р=0,005), что можно трактовать как повреждение лизосомальной мембраны (табл. 1).

 

Таблица 1. Влияние 5 мМ L-карнитина на значение показателя Клаб, %

Фермент

Продолжительность инкубации

1 час

2 часа

4 часа

Сахароза

Карнитин

Сахароза

Карнитин

Сахароза

Карнитин

 

37,26

74,87

64,09

84,12

10,83

62,45*

Катепсин В

[0;

[70,76;

[13,74;

[76,18;

[6,69;

[45,19;

 

75,64]

78,00]

78,81]

91,42]

13,25]

91,46]

 

33,34

37,13

42,85

79,38°

16,85

55,43*

Катепсин L

[32,98;

[30,88;

[14,65;

[75,36;

[11,6;

[53,34;

 

39,09]

40,20]

82,17]

83,19]

20,56]

62,10]

 

37,35

86,24*

59,07

68,44*

50,56

94,75*х

Катепсин H

[22,20;

[79,46;

[55,16;

[65,76;

[38,27;

[92,45;

 

37,38]

97,45]

62,58]

70,42]

54,43]

96,97]

Кислая

фосфатаза

23,54

[16,23;

27,02]

9,52*

[7,18;

12,03]

27,12

[26,35;

28,80]

18,06*°

[16,95;

19,26]

27,62

[24,13;

30,22]

41,35*х°

[38,64;

42,71]

Примечание: * - статистически значимые (р<0,05) отличия от групп контроля с соответствующей продолжительностью инкубации, - статистически значимые (р< 0,05) отличия от 1 часа инкубации, х - статистически значимые (р<0,05) отличия от 2-х часов инкубации.

 

При исследовании воздействия карнитина на активность ЛЦП in vitro обнаружен рост ОА на 73,2% (р=0,008) катепсина B за счет роста активности в НСФ на 76,8% (р=0,008) в течение одного часа инкубации (табл. 2). Аналогичные изменения наблюдались в ОА катепсина L при двух- и четырехчасовой инкубации: на 77,7% (р=0,005) и 42,3% (р=0,013) соответственно. Можно предположить, что L-карнитин способствует активации катепсинов из их предшественников или высвобождению их из комплекса с ингибиторами. В литературе имеются сведения о проапоптогенном действии карнитина [8]. Одним из возможных механизмов развития данного явления может оказаться способность карнитина повышать активность катепсинов В и L, для которых описано участие в запуске опосредованной клеточной гибели [5]. При этом, при одно-и двухчасовой инкубации исследуемые ферменты переходят во внелизосомальную фракцию не за счет повреждения мембраны, а видимо, за счет повышения её избирательной проницаемости.

В отношении катепсина Н наблюдалась другая картина: прямое воздействие 5 мМ карнитина приводило к снижению ОА: при одночасовой инкубации на 200,0% (р=0,008) за счет падения активности фермента в СФ на 87,0% (р=0,008), при двухчасовой инкубации - на 67,9% (р=0,05) за счет падения активности фермента в СФ на 79,0% (р=0,005) и при четырехчасовой инкубации - на 27,1% (р=0,02) за счет падения активности фермента в СФ на 95,1% (р=0,005) относительно соответствующих серий сравнения. Аналогичные изменения в отношении катепсина Н карнитин вызывал у крыс в in vivo эксперименте [9]. Также наблюдалось повышение избирательной проницаемости мембраны для данного фермента при одно- и двухчасовой инкубации.

Статистически значимое нарастание значение Клаб для всех изучаемых катеп-синов при четырехчасовой инкубации может объясняться повреждением лизосомальной мембраны.

При исследовании влияния карнитина на изучаемые показатели в зависимости от продолжительности воздействия обнаружено, что основные изменения касаются распределения ферментов между вне- и внутрилизосомальной фракциями. Так, после 2-х часов инкубации в среде, содержащей 5 мМ L-карнитин, наблюдалось статистически значимое увеличение НСА катепсина L на 43,2% (р=0,02) и снижение СА на 71,1% (р=0,02) относительно 1-го часа инкубации (рис. 1), однако удлинение времени воздействия до 4-х часов не приводило к усугублению описываемых эффектов. Для кислой фосфатазы по мере увеличения времени инкубации (1, 2 и 4 часа) наблюдался рост НСА фермента и падение СА (рис. 2). Также с течением времени наблюдалось увеличение Клаб по кислой фосфатазе (табл. 1). В отношении катепсинов В и Н статистически значимых изменений активности и распределения во временном аспекте выявлено не было.

 

Выводы

  1. Карнитин в концентрации 5 мМ вызывает статистически значимый рост общей активности катепсинов B и L и снижение общей активности катепсина Н при  in vitro -инкубации лизосом печени крыс.
  2. Инкубация в 5 мМ растворе L-карнитина приводит к росту неседименти-руемой активности и падению седименти-руемой активности для катепсина L при двухчасовом, а для кислой фосфатазы - при двух- и четырехчасовом воздействии.
  3. При одно- и двухчасовой инкубации L-карнитин в концентрации 5 мМ стабилизирует лизосомальную мембрану, однако увеличение времени инкубации до 4-х часов приводит к её повреждению.
  4. 5 мМ L-карнитин повышает избирательную проницаемость лизосомальной мембраны для исследуемых катепсинов, в наибольшей степени - для катепсина Н.

Конфликт интересов отсутствует

About the authors

M A. Fomina

Ryazan State Medical University

Author for correspondence.
Email: anyakudlaeva@mail.ru

Russian Federation Ph

A M. Kudlaeva

Ryazan State Medical University

Email: anyakudlaeva@mail.ru

Russian Federation ассистент кафедры биологической химии

A N. Ryabkov

Ryazan State Medical University

Email: anyakudlaeva@mail.ru

Russian Federation Ph

References

  1. Turk V., Stoka V., Vasiljeva O., Ren-ko M., Sun T., Turk B. et al. Cysteincatep-sines: from structure, function and regulation to new frontiers // Biochimica et Biophysi-caActa. 2012. Vol. 1824, №1. P. 68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002.
  2. Абаленихина Ю.В., Фомина М.А., Исаков С.А. Окислительная модификация белков и изменение активности катепсина L селезенки крыс в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2013. Т. 21, №1. С. 45-49.
  3. Арапова А.И., Фомина М.А. Аутокаталитические эффекты лизосомальных-цистеиновых протеиназ гладкой мышцы аорты крыс // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2015. №4. С. 27-32.
  4. Потеряева О.Н. Участие цистеино-выхпротеиназ и их ингибиторов в развитии злокачественных опухолей (обзор литературы) // Медицина и образование в Сибири. 2009. № 1. Available at: http://ngmu.ru/cozo/ mos/article/abauthors.php?id=327 (accessed 30 August 2016).
  5. Пупышев А.Б. Пермеабилизация лизосомных мембран как апоптогенный фактор // Цитология. 2011. Т. 53, №4. С. 313-324.
  6. Фомина М.А., Кудлаева А.М. Изучение in vitro-воздействия L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз изолированно и на фоне оксидативного стресса // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2016. №1. С. 55-59.
  7. Mutomba M.C., Yuan H., Konyavko M., Adachi S., Yokoyama C.B., Esser V. et al. Regulation of the activity of caspases by L-carnitine and palmitoylcarnitine // FEBS Letters. 2000. Vol. 478, №1-2. P. 19-25.
  8. Roy M.J., Dionne S., Marx G., Qureshi I., Sarma D., Levy E. et al. In vitro studies on the inhibition of colon cancer by butyrate and carnitine // Nutrition. 2009. Vol. 25, №11-12. P. 11931201. doi: 10.1016/j.nut.2009.04.008.
  9. Ильичёва А.С., Фомина М.А. Влияние L-аргинина и карнитина на активность катепсинов L и H и проницаемость лизосомальной мембраны в сердечной мышце при выраженной гипергомоцистеинемии // Казанский медицинский журнал. 2015, №5. С. 819-824.
  10. Barrett A.J., Kirschke H. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L // Methods in En-zymol. 1981. Vol. 80. P. 535-561.
  11. Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. М.: Наука, 1976. 378 с.
  12. Felbor U., Dreier L., Bryant R., Ploegh H., Olsen B., Mothes W. Secreted ca-thepsin L generates endostatin from collagen XVIII // EMBO J. 2000. Vol. 19, №6. P. 11871194. doi: 10.1093/emboj/19.6.1187.
  13. Terman A., Kurz T., Gustafsson B., Brunk U.T. Lysosomal Labilization // IUBMB Life. 2006. Vol. 58, №9. P. 531-539. doi: 10.1080/15216540600904885.

Statistics

Views

Abstract - 334

PDF (Russian) - 210

PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Fomina M.A., Kudlaeva A.M., Ryabkov A.N.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies