Изменение деформабельности и резистентности мембран эритроцитов у потомства крыс с экспериментальной преэклампсией под действием производных гамма-аминомасляной кислоты

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГАМК — гамма-аминомасляная кислота

ИЭЭ — индекс элонгации эритроцитов

ПОЛ — перекисное окисление липидов

ЭП — экспериментальная преэклампсия

ВВЕДЕНИЕ

На настоящий момент преэклампсия затрагивает около 5% беременностей в мире и является одной из основных причин детской и материнской заболеваемости. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о том, что данное осложнение беременности способствует формированию аномалий развития плода, генетических патологий, увеличивает риск возникновения заболеваний сердечно-сосудистой и нервной систем, метаболических и гематологических нарушений у детей в разные периоды индивидуального развития [1, 2].

Системная эндотелиальная дисфункция при преэклампсии у матери приводит к недостаточному поступлению кислорода и питательных веществ к развивающемуся плоду. Хроническая внутриутробная гипоксия сопровождается окислительным стрессом, что ведет к нарушению структурного и функционального состояния органов ребенка [3].

Степень деструкции и дисфункции клеток организма потомства может отражать снижение резистентности эритроцитов к действию повреждающих агентов, поскольку мембрана эритроцитов является универсальной моделью плазматической мембраны [4]. Важным реологическим параметром, демонстрирующим адекватное обеспечение кислородом тканей и органов, является деформабельность эритроцитов. Снижение данного показателя свидетельствует об увеличении вязкости крови и ухудшении микроциркуляции, что повышает вероятность развития гемодинамических нарушений [5].

В этой связи поиск веществ, обладающих мембранопротекторным действием и снижающих вязкость крови, является актуальным. Было показано, что производные гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) обладают эндотелиопротективным, антиоксидантным и антигипоксическим эффектами, стабилизируют мембраны клеток [6], что делает их перспективными соединениями для коррекции постгипоксических осложнений у детей от матерей с преэклампсией.

Цель ― оценить влияние Сукцикарда®, Салифена® и Фенибута®, являющихся производными гамма-аминомасляной кислоты, на деформабельность и резистентность мембран эритроцитов у 8- и 14-месячного потомства, рожденного крысами с экспериментальной преэклампсией (ЭП).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование было выполнено на 84 самцах (n = 42) и самках (n = 42), рожденных белыми неинбредными крысами (ФГУП «Питомник Лабораторных Животных «Рапполово» РАМН, д. Рапполово, Ленинградская область, Российская Федерация) с неосложненной беременностью и ЭП. ЭП моделировали посредством замены питьевой воды на 1,8% раствор NaCl в период гестации (1–21 день) [6].

Уход за самками и потомством, эксперименты с их участием были выполнены согласно требованиям и рекомендациям государственного стандарта Р-33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», «Директивы Европейского Парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/EU» о защите животных, используемых для научных целей от 22.09.2010 и «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18.03.1986. Данное исследование было одобрено региональным независимым этическим комитетом Волгоградской области (протокол № 2044-2017 от 25.12.2017).

Потомство распределяли по группам таким образом, чтобы в каждой оказалось по 7 животных:

- группы 1 и 2 (позитивный контроль) составляли самцы и самки соответственно, рожденные крысами с неосложненной беременностью; ежедневно внутрижелудочно в одно и то же время в течение 30 дней (с 40 по 70 день жизни) получали дистиллированную воду;

- в группы 3 и 4 (негативный контроль) входили самцы и самки соответственно от крыс с ЭП, которым вводили дистиллированную воду в аналогичном режиме;

В опытные группы были включены самцы и самки от крыс с ЭП:

- группы 5 (самцы) и 6 (самки) ― крысы, получавшие Сукцикард® 22 мг/кг (4-фенилпирацетам и этан-1,2-дикарбоновая кислота, соотношение 2:1);

- группы 7 (самцы) и 8 (самки) ― крысы, получавшие Салифен® 7,5 мг/кг (4-амино-3-фенилбутановая кислота и 2-гидроксибензойная кислота, соотношение 2:1);

- группы 9 (самцы) и 10 (самки) — крысы, получавшие Фенибут® 25 мг/кг (4-амино-3-фенилмасляная кислота).

Все препараты для групп 5–10 были предоставлены Российским государственным педагогическим университетом им. А. И. Герцена, г. Санкт-Петербург.

Группы 11 (самцы) и 12 (самки) ― животные, получавшие Пантогам® (кальция гопантенат) 50 мг/день (сироп 100 мг/мл, ПИК-ФАРМА ПРО ООО, Российская Федерация) в качестве препарата сравнения.

У потомства в возрасте 8 мес. определяли деформабельность и резистентность мембран эритроцитов. Для этого забирали кровь из подъязычной вены и стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия (Вектон, Российская Федерация), соотношение 9:1, после чего аккуратно перемешивали без образования пены.

Исследование резистентности мембран эритроцитов к соляной кислоте осуществляли по методу И. А. Терского и И. И. Гительзона (1961). После трехкратной отмывки в физиологическом растворе 10 мкл эритроцитов ресуспендировали в 5 мл 0,9% раствора NaCl (Эском НПК, Российская Федерация). Суспензию эритроцитов (290 мкл) вносили в кювету и на 1 мин помещали ее в термостатируемую ячейку лазерного анализатора агрегации со встроенной магнитной мешалкой 220 LA (НПФ Биола, Российская Федерация). Через 10 секунд после включения записи в кювету добавляли 10 мкл 0,1 N раствора HCl. Время достижения половины величины максимальной амплитуды эритрограммы (Т1/2 гемолиза) служило показателем резистентности эритроцитов к действию соляной кислоты.

Оценку деформабельности эритроцитов осуществляли по индексу элонгации эритроцитов (ИЭЭ) в проточной микрокамере. После заполнения микрокамеры эритроцитами в 0,9% растворе NaCl с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, США) производили подачу давления. Рассчитывали напряжение сдвига (τ):

$\tau =\frac{6\eta Q}{W{h}^2}$

где: η — вязкость суспензии (около 1,0 мПа × с при 20°C); Q — объемная скорость; W — ширина проточного канала; h — высота канала, равная толщине прокладки.

Записывали полученное изображение и анализировали его в программе Adobe Photoshop CC (2021, пробная версия), фиксируя длину и ширину элонгированных эритроцитов. Согласно полученным данным, производили расчет индекса элонгации эритроцитов (ИЭЭ):

$ИЭЭ=\frac{L-W}{L+W}$

где: L — длина деформированной клетки; W — ширина деформированной клетки.

В возрасте 14 мес. аналогичным образом проводили вышеперечисленные тесты у самцов и самок групп позитивного (n = 6 и n = 6) и негативного (n = 7 и n = 6) контроля, опытных групп: 5 (n = 6), 6 (n = 7), 7 (n = 7), 8 (n = 6), 9 (n = 6), 10 (n = 7), 11 (n = 6), 12 (n = 6).

Статистическую обработку результатов экспериментального исследования осуществляли в пакете прикладных программ «Statistica» версия 12.5 (лицензионный номер 133-190-095, Stat Soft Inc., США). Для парных и множественных сравнений выборок использовали критерии Стьюдента и Ньюмена–Кейлса соответственно. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У 8-месячных самцов от крыс с ЭП наблюдалось снижение резистентности мембран эритроцитов к действию соляной кислоты. Время достижения половины величины максимальной амплитуды эритрограммы у них было на 17,7% (p = 0,0196) короче относительно группы позитивного контроля. В 14 мес. у потомства группы негативого контроля отмечалась тенденция к уменьшению Т1/2 гемолиза.

Сукцикард®, Салифен®, Фенибут® и Пантогам® способствовали увеличению продолжительности достижения половины величины максимальной амплитуды эритрограммы у самцов опытных групп в 8 мес. на 24,3% (p = 0,0006); 25,9% (p = 0,0003); 14,7% (p = 0,0281) и 20,3% (p = 0,0041) соответственно по сравнению с данными в группе негативного контроля. У 14-месячных самцов и у самок разного возраста, которым вводили данные производные ГАМК, не было обнаружено различий относительно показателей потомства крыс с ЭП контрольной группы (рис. 1).

 

Рис. 1. Влияние производных гамма-аминомасляной кислоты на продолжительность достижения половины величины максимальной амплитуды эритрограммы (Т1/2 гемолиза) у 8- (А) и 14-месячного (Б) потомства крыс с экспериментальной преэклампсией (M ± m). Примечания: * p < 0,05 по сравнению с данными в группе позитивного контроля (t-критерий Стьюдента); # p < 0,05 по сравнению с данными в группе негативного контроля (критерий Ньюмена–Кейлса).

 

У 8-месячных самцов, рожденных крысами с осложненной ЭП беременностью, ИЭЭ был на 20,0% меньше (p = 0,0034), чем у потомства здоровых самок, у 14-мес животных достоверных отличий между группами позитивного, негативного контролей и опытными не было.

Сукцикард®, Салифен®, Фенибут® и Пантогам® способствовали увеличению деформабельности мембран эритроцитов у 8-месячных самцов опытных групп — ИЭЭ у них был на 17,9% (p = 0,0013); 15,1% (p = 0,0016); 22,2% (p = 0,0002) и 17,6% (p = 0,0009) соответственно больше относительно исследуемого показателя в группе негативного контроля. К 14 мес. эффект от терапии данными производными ГАМК в раннем возрасте сглаживался и статистически значимых различий между группами не было обнаружено (рис. 2).

 

Рис. 2. Влияние производных гамма-аминомасляной кислоты на величину индекса элонгации эритроцитов у 8-(А) и 14-месячного (Б) потомства крыс с экспериментальной преэклампсией (M ± m). Примечания: * p < 0,05 по сравнению с данными в группе позитивного контроля (t-критерий Стьюдента); # p < 0,05 по сравнению с данными в группе негативного контроля (критерий Ньюмена–Кейлса).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Согласно полученным результатам, у самцов группы негативного контроля в 8 мес. наблюдалось снижение устойчивости мембран эритроцитов к действию повреждающих агентов и ухудшение деформабельности мембран, о чем свидетельствовали короткое время достижения половины величины максимальной амплитуды эритрограммы и уменьшение ИЭЭ по сравнению с потомством здоровых крыс.

Вероятно, это может быть связано с нарушением маточно-плацентарного кровообращения при преэклампсии у матери и недостаточным поступлением кислорода к плоду. Было показано, что в первые дни жизни крысят, подвергшихся внутриутробной гипоксии, отмечается усиление процессов эритропоэза, что, однако, впоследствии приводит к истощению функциональных резервов эритроцитарной системы [7] и недостаточной перфузии и оксигенации тканей потомства крыс с ЭП. Гипоксия опосредует развитие окислительного повреждения мембран и патологическую модификацию белков эритроцитов [8]. Накопление продуктов окисления в эритроцитарных мембранах ассоциируется с изменением их текучести и деформируемости [9]. В результате образуется более жесткая и хрупкая конструкция мембран эритроцитов, изменяется мембранный потенциал и проницаемость для ионов, что приводит к внутрисосудистому гемолизу. В ранее проведенных нами исследованиях было выявлено, что у потомства крыс с ЭП в плазме крови повышен уровень продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) — малонового диальдегида, а также снижена активность супероксиддисмутазы и каталазы по сравнению с аналогичными показателями у животных от крыс с физиологически протекающей беременностью [10].

Сукцикард®, Салифен®, Фенибут® и Пантогам® способствовали повышению деформабельности мембран эритроцитов и их резистентности к соляной кислоте у самцов в возрасте 8 мес. Очевидно, это связано, в первую очередь, с их способностью ограничивать процессы ПОЛ и увеличивать активность ферментов антиоксидантной системы. Кроме того, известно нормализующее влияние производных ГАМК на микроциркуляцию, их антигипоксическая активность и мембранопротекторное действие [11].

В то же время среди показателей самок разного возраста и групп не наблюдалось статистически значимых отличий, что может быть обусловлено влиянием половых гормонов в течение эстрального цикла. Эндогенные эстрогены оказывают протективное действие в отношении деформабельности эритроцитов [12, 13]. В исследовании J. Mladenovic, et. al. (2014) показано, что эстрадиол способен ограничивать окислительное повреждение эритроцитов, синергетически действуя с глутатионом и витамином Е [14].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У самцов, рожденных крысами с экспериментальной преэклампсией, в 8 месяцев отмечались увеличение жесткости и снижение прочности мембран эритроцитов относительно показателей потомства здоровых крыс. Производные гамма–аминомасляной кислоты Сукцикард®, Салифен®, Фенибут® и препарат сравнения — Пантогам® — оказывали мембранопротекторный эффект на эритроциты 8-месячных самцов опытных групп.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов: Музыко Е. А. — проведение основных этапов эксперимента, анализ и интерпретация данных, написание статьи; Науменко Л. В. — проведение основных этапов эксперимента, анализ и интерпретация данных; Перфилова В. Н. — анализ и интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания, утверждение для публикации рукописи; Завадская В. Е. — проведение основных этапов эксперимента; Варламова С. В. — проведение основных этапов эксперимента; Тюренков И. Н. — разработка концепции и дизайна, проверка критически важного интеллектуального содержания, окончательное утверждение для публикации рукописи; Васильева О. С. — анализ и интерпретация данных, проверка критически важного интеллектуального содержания. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Funding. This study was not supported by any external sources of funding.

Conflict of interests. The authors declare no conflicts of interests.

Contribution of the authors: E. A. Muzyko — implementation of the main stages of the experiments, analysis and interpretation of the data, writing the article; L. V. Naumenko — implementation of the main stages of the experiments, analysis and interpretation of the data; V. N. Perfilova — analysis and interpretation of the data, revision of the crucially important conceptual content, approval of the manuscript for publication; V. E. Zavadskaya, S. V. Varlamova — implementation of the main stages of the experiments; I. N. Tyurenkov — development of the concept and design of the study, revision of the crucially important conceptual content, final approval of the manuscript for publication; O. S. Vasilyeva — analysis and interpretation of the data, revision of the crucial conceptual content. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Об авторах

Елена Андреевна Музыко

Волгоградский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: muzyko.elena@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-0535-9787
SPIN-код: 9939-9414

к.м.н., ассистент кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии

Россия, Волгоград

Людмила Владимировна Науменко

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: milanaumenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2119-4233
SPIN-код: 8537-0991

доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры фармакологии и биоинформатики

Россия, Волгоград

Валентина Николаевна Перфилова

Волгоградский государственный медицинский университет; Волгоградский медицинский научный центр

Email: vnperfilova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2457-8486
SPIN-код: 3291-9904

доктор биологических наук, профессор, профессор кафедры фармакологии и фармации института

Россия, Волгоград; Волгоград

Валерия Евгеньевна Завадская

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: valzavadskaya@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0772-8371

студентка 4 курса фармацевтического факультета

Россия, Волгоград

Софья Владимировна Варламова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: varlamovasophia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4242-9863

студентка 4 курса фармацевтического факультета

Россия, Волгоград

Иван Николаевич Тюренков

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: fibfuv@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7574-3923
SPIN-код: 6195-6378

ЗРВШ РФ, ЗДН РФ, член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии и фармации института НМФО

Россия, Волгоград

Ольга Сергеевна Васильева

Российский государственный педагогический университет им. А. И. Герцена

Email: kohrgpu@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7779-8861
SPIN-код: 9820-9881

кандидат химических наук, старший научный сотрудник проблемной лаборатории нитросоединений кафедры органической химии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы