P-glycoprotein  functional  activity  in  «soviet chinchilla» rabbits  during  pregnancy

Natalia M. Popova; Попова Наталья Михайловна; Aleksey V. Shchulkin; Шулькин Алексей Владимирович; Ivan V. Chernykh; Черных Иван Владимирович; Anna S. Esenina; Есенина Анна Сергеевна; Maria M. Gradinar; Градинарь Мария Михайловна; Larisa V. Nikiforova; Никифорова Лариса Владимировна; Alexander N. Ryabkov; Рябков Александр Николаевич; Elena N. Yakusheva; Якушева Елена Николаевна

doi:10.23888/PAVLOVJ2018264466-473

Функциональная активность гликопротеина-р у кроликов породы «советская шиншилла» при беременности

Авторы: Попова Н.М.¹, Шулькин А.В.¹, Черных И.В.¹, Есенина А.С.¹, Градинарь М.М.¹, Никифорова Л.В.¹, Рябков А.Н.¹, Якушева Е.Н.¹
Учреждения:
1. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова
Выпуск: Том 26, № 4 (2018)
Страницы: 466-473
Раздел: Оригинальные исследования
Статья получена: 08.01.2019
Статья опубликована: 29.12.2018
URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/10842
DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2018264466-473
ID: 10842

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Гликопротеин-P (Рgp, ABCB1-белок) – мембранный белок-транспортер, играющий ключевую роль в фармакокинетике широкого спектра лекарственных веществ. Субстратами данного транспортера является ряд препаратов (антибактериальные, антиретровирусные, гипотензивные), которые требуется назначать беременным женщинам длительными курсами, иногда на протяжении всего срока гестации.

Цель. Изучить активность белка-транспортера Рgp на уровне целостного организма у самок-кроликов породы «Советская Шиншилла» во время беременности.

Материалы и методы. Исследование выполнено на 21 кролике-самке породы «Советская Шиншилла» массой 3000-3500 г. Животные были разделены на 3 серии. Первая серия (n=6) – кролики на 7 сут. беременности; вторая серия (n=5) – животные на 14 сут. беременности; третья серия (n=10) – кролики на 21 сут. беременности. За 7 сут. до начала исследования и в указанные сроки гестации проводили оценку функциональной активности Pgp по фармакокинетике маркерного субстрата транспортера – фексофенадина после его однократного перорального введения в дозе 67,5 мг/кг массы и определение сывороточных концентраций прогестерона, эстрадиола, тестостерона и пролактина радиоиммунным методом.

Результаты. Во все изучаемые сроки беременности сывороточная концентрация эстрадиола, тестостерона и пролактина у самок кроликов статистически значимо не отличалась от показателей до беременности, а уровень прогестерона в сыворотке крови значимо повышался по сравнению с уровнем нормы. На 7 сут. беременности фармакокинетические параметры фексофенадина достоверно не изменялись по сравнению с исходными значениями. На 14 сут. беременности отмечалось достоверное повышение С_max, AUC_0-t, T_1/2 фексофенадина по сравнению с параметрами до беременности, что свидетельствует о снижении функциональной активности Рgp на уровне целостного организма. На 21 сут. беременности оставалась повышенной С_max фексофенадина. Остальные фармакокинетические параметры достоверно не изменялись.

Вывод. Установлено снижение функциональной активности гликопротеина-Р, определяемой по фармакокинетике его маркерного субстрата – фексофенадина, у кроликов породы «Советская Шиншилла» на 14 и 21 сут. беременности на фоне значительного повышения уровня прогестерона.

Ключевые слова

гликопротеин-Р, АВСВ1-белок, функциональная активность, беременность, прогестерон

Полный текст

Одним из важнейших вопросов клинической фармакологии является фармакотерапия во время беременности. По данным международных исследований более 80% беременных женщин принимали хотя бы одно лекарственное средство [1].

Гликопротеин-P (Рgp, ABCB1-белок) – мембранный белок-транспортер, который играет важную роль в фармакокинетике широкого спектра лекарственных веществ, являющихся его субстратами, регулируя их всасывание в кишечнике, проникновение через гистогематические барьеры, в том числе плацентарный, и выведение печенью и почками [2]. Следует отметить, что субстратами указанного транспортера являются препараты, которые назначаются беременным женщинам длительными курсами, а иногда на протяжении всего срока гестации. К субстратам Рgp, применяемым у беременных, относятся некоторые антибактериальные (эритромицин, азитромицин, цефазолин, цефоперазон), антиретровирусные (саквинавир, ритонавир, индинавир), гипотензивные (атенолол, нифедипин, амлодипин) средства [2].

Активность Рgp способна значительно изменяться под влиянием внешних и внутренних факторов, в том числе под действием гормонов [3-5]. Известно, что в течение беременности в организме наблюдается выраженная гормональная перестройка, сопровождающаяся нарастанием сывороточных концентраций половых гормонов [6], что предполагает изменение функционирования Рgp в организме беременной.

В изученной нами литературе обнаружены лишь исследования активности транспортера и экспрессии гена ABCB1 (MDR1), кодирующего Рgp, в гематоплацентарном барьере в различные сроки беременности. Функционирование транспортера в плаценте препятствует проникновению его субстратов от матери к плоду, поэтому его изучение является важным для оценки безопасности и эффективности применяемых лекарственных препаратов в отношении плода. Однако динамика активности Рgp в организме беременной в целом может стать причиной существенного изменения фармакокинетики назначаемых субстратов. Так снижение функциональной активности транспортера может привести к накоплению его субстратов в организме женщины и развитию нежелательных лекарственных реакций как у матери, так и у плода, а повышение – к уменьшению содержания лекарственных веществ и снижению эффективности проводимой фармакотерапии.

Целью настоящего исследования явилось изучение активности белка-транспор-тера Рgp на уровне целостного организма у самок-кроликов породы «Советская Шиншилла» во время беременности.

Материалы и методы

Исследование выполнено на 21 кролике-самке породы «Советская Шиншилла» массой 3000-3500 г. Животные получены из питомника ОАО «Касимов-Миакро», имели соответствующие ветеринарные свидетельства, содержались в стандартных условиях вивария ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России. Работа с животными проводилась в соответствии с правилами лабораторной практики (Приказ МЗ РФ №199н от 1 апреля 2016 г).

Все животные были разделены на 3 серии. Первая серия (n=6) – животные на 7 сут. беременности; вторая серия (n=5) – кролики на 14 сут. беременности; третья серия (n=10) – животные на 21 сут. беременности.

За 7 сут. до начала исследования и в указанные сроки гестации у животных всех серий определяли функциональную активность Pgp и сывороточную концентрацию гормонов (прогестерона, эстрадиола, тестостерона и пролактина) радиоиммунным методом с использованием стандартной тест-системы «IMMUNOTECH» (Чехия). Полученные результаты обрабатывали на анализаторе «Иммунотест» (Россия).

Первым днем беременности считали первый день после спаривания с самцом. В окончательный анализ включали самок, беременность которых закончилась родами.

Функциональную активность Pgp оценивали по фармакокинетике фексофенадина («Аллегра», «Sanofy Aventis», Франция) после его однократного перорального введения в дозе 67,5 мг/кг массы в виде водной суспензии (5 мл/кролик) по методике, описанной нами ранее [7, 8].

С использованием модельно независимого метода [9] рассчитывали следующие фармакокинетические параметры фексофенадина: C_max – максимальная концентрация (нг/мл); AUC_0-t – площадь под фармакокинетической кривой концентрация-время от нуля до времени последнего забора крови (нг*ч/мл); T_1/2– период полувыведения, ч. Концентрацию гормонов (прогестерона, эстрадиола, тестостерона, пролактина) в сыворотке крови определяли в ЦНИЛ РязГМУ.

Полученные результаты обрабатывали с помощью программы «Stat Soft Statistica 7.0» (США). Статистическую значимость различий между показателями гормонального статуса животных оценивали с помощью критерия Вилкоксона. Полученные результаты представлены в виде медианы (Med), нижнего (lq) и верхнего (up) квартилей. Статистическую значимость различий между фармакокинетическими параметрами фексофенадина оценивали исходя из представления о лог-нормальном распределении данных. Сравнение изучаемых фармакокинетических параметров проводили с помощью дисперсионного анализа (ANOVA) после их логарифмирования. Полученные результаты (фармакокинетические параметры) представлены в таблицах в виде среднего геометрического и его 95% доверительного интервала (ДИ). Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Дополнительно рассчитывали двухсторонний 90% ДИ отношения средних геометрических фармакокинетических параметров фексофенадина в исследуемый срок беременности к параметрам интактных животных (до беременности). Согласно U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research значимыми считаются различия между фармакокинетическими параметрами, если двухсторонний 90% ДИ их отношения находится за пределами диапазона 0,8-1,25 (80-125%), поскольку изменение фармакокинетических параметров только более чем на 25% может привести к изменению фармакодинамики препаратов.

Результаты и их обсуждение

Во все изученные сроки беременности сывороточная концентрация эстрадиола, тестостерона и пролактина у самок кроликов породы «Советская Шиншилла» статистически значимо не отличалась от показателей до беременности.

В то же время уровень прогестерона в сыворотке крови повышался на 7 сут. беременности в 6,06 раз (p=0,017), на 14 сут. – в 11,0 раз (p=0,001), а на 21 сут. – в 18,8 раз (p=0,001) по сравнению со значениями нормы (табл. 1).

На протяжении беременности отмечались изменения фармакокинетики маркерного субстрата Pgp – фексофенадина, представленные в таблице 2.

Таблица 1. Сывороточные концентрации гормонов у самок кроликов в различные сроки беременности (Med, lq, uq)

Параметры	Изучаемые сроки эксперимента
	7 сут.		14 сут.		21 сут.
	норма	n=6	норма	n=5	норма	n=10
Прогестерон, нг/мл	0,675 (0,383; 1,29)	4,09 (3,35; 5,09)*	0,79 (0,47; 1,96)	8,69 (8,19; 9,65)*	0,39 (0,17; 1,02)	7,33 (6,2; 8,55)*
Эстрадиол, пг/мл	256,0 (247,25; 434,0)	352,7 (312,9; 473,1)	295,9 (254,1; 483,1)	314,83 (247,2; 406,7)	253,46 (241,04; 335,93)	208,08 (183,13; 251,75)
Тестостерон, нмоль/л	0,8 (0,69; 1,74)	1,28 (0,99; 1,74)	0,78 (0,66; 1,74)	1,08 (0,95; 1,78)	0,76 (0,62; 0,8)	1,35 (0,62; 1,35)
Пролактин, мМЕ/мл	24,55 (17,88; 26,21)	20,91 (15,61; 22,43)	22,58 (16,5; 25,23)	19,1 (18,4; 23,4)	20,6 (15,15; 24,55)	19,7 (16,36; 24,54)

Примечание: * – статистически значимые различия от исходных показателей (норма), p<0,05

Таблица 2. Фармакокинетические параметры фексофенадина у самок кроликов в различные сроки беременности (среднее геометрическое и его 90% ДИ)

Параметры	Изучаемые сроки эксперимента
	7 сут.		14 сут.		21 сут.
	норма	n=6	норма	n=5	норма	n=10
С_max, нг/мл	198,18 (121,89; 322,20)	233,32 (109,88; 495,44)	139,04 (89,13; 216,88)	329,13 (161,68; 670,02)*	216,58 (141,64; 331,15)	424,47 (247,02; 729,39)*
AUC_0-_t, нг/мл*ч	2054,97 (1127,67; 3744,82)	2085,94 (1230,51; 3536,06)	1107,11 (570,18; 2149,65)	2777,07 (840,69; 9173,43)*	1841,29 (1162,62; 2916,11)	2499,49 (1594,07; 3919,17)
T_1/2, ч	9,17 (2,34; 35,89)	18,24 (5,28; 62,96)	8,45 (4,14; 17,24)	25,70 (10,62; 62,22)*	5,44 (2,48; 11,96)	9,72 (4,94; 19,12)

Примечание: * – статистически значимые отличия от исходных показателей (норма), p<0,05

На 7 сут. беременности фармакокинетические параметры фексофенадина достоверно не изменялись по сравнению с исходными значениями.

На 14 сут. беременности С_max фексофенадина увеличивалась в 2,37 раза (90% ДИ 1,38; 4,05, р=0,027), AUC_0-_t – в 2,51 раз (90% ДИ 1,48; 4,24, р=0,02), T_1/2 – в 3,04 раза (90% ДИ 1,56; 5,91, р=0,023) по сравнению со значениями до беременности.

На 21 сут. беременности повышенной оставалась С_max фексофенадина, которая превышала показатели до беременности в 1,96 раза (90% ДИ 1,22; 3,14, р=0,029). Остальные фармакокинетические параметры достоверно не изменялись.

Поскольку беременность у кроликов длится 28-35 дней [10], исследование гормонального статуса и активности белка-транспортера Pgp проводилось на 7, 14 и 21 сут. гестации.

Фексофенадин является маркерным субстратом Pgp, поэтому его фармакокинетика определяется преимущественно функционированием данного белка-тран-спортера. Отсутствие изменений фармакокинетических параметров фексофенадина на 7 сут. гестации свидетельствует о сохранении исходной активности Pgp. Повышение С_max,AUC_0-_t,T_1/2 фексофенадина на 14 день беременности и увеличение С_max на 21 сут. свидетельствуют о повышении содержания препарата в организме кроликов и, следовательно, о снижении активности транспортера в данные сроки гестации.

Так как содержание эстрадиола, тестостерона, пролактина в сыворотке крови беременных кроликов достоверно не изменилось, ингибирование активности Pgp, вероятно, обусловлено значительным повышением концентрации прогестерона при беременности.

В ряде экспериментов in vitro прогестерон показал дозозависимое влияние на экспрессию гена MDR1, кодирующего Pgp, и активность транспортера: в высоких концентрациях он являлся ингибитором активности Pgp, а в низких – индуктором экспрессии гена MDR1 и активности транспортера [11-13].

В исследовании на кроликах нами было установлено, что введение прогестерона в дозе 2 мг/кролик при овариоэктомии приводило к повышению функциональной активности Pgp по сравнению с показателями животных, подвергнутых изолированной овариоэктомии, однако активность транспортера оставалась сниженной по сравнению с данными до операции. Применение прогестерона в дозе 15 мг/кролик на фоне овариоэктомии повышало функциональную активность Pgp по сравнению с результатами кастрированных кроликов, восстанавливая его активность до показателей интактных животных [5]. Индуцирующее влияние прогестерона на белок-транспортер в данном эксперименте обусловлено его низкими сывороточными концентрациями.

Однако, в настоящем исследовании уровень прогестерона у беременных самок кроликов значительно превышал показатели животных на фоне овариоэктомии при введении экзогенного прогестерона как в низкой, так и в высокой дозе, что, возможно, послужило причиной ингибирующего влияния стероида на Pgp. Следует отметить, что на фоне овариоэктомии животным замещали только содержание прогестерона, а уровень эстрадиола оставался низким, в то время как во время беременности влияние на транспортер оказывали как прогестерон в высокой концентрации, так и эстрадиол.

Функционирование Рgp может изменяться как вследствие непосредственного влияния на активность белка-транспор-тера, так и за счет модификации экспрессии гена MDR1 [3].

В данном эксперименте не проводилось изучение экспрессии Pgp в органах и тканях беременных кроликов, что не дает возможности показать, за счет чего изменилось функционирование белка-транс-портера (из-за модуляции экспрессии гена или собственной активности). Также необходимо уточнить в каком органе (кишечник, почки, печень, гематоплацентарный барьер) изменение активности Pgp привело к динамике фармакокинетических параметров фексофенадина.

Дальнейшие исследования белка-тран-спортера Pgp при беременности позволят установить органоспецифичные молекулярные механизмы модуляции его функционирования в различные сроки гестации.

Вывод

Установлено снижение функциональной активности гликопротеина-Р, определяемой по фармакокинетике его маркерного субстрата – фексофенадина, у кроликов породы «Советская Шиншилла» на 14 и 21 сутки беременности на фоне значительного повышения уровня прогестерона.

Об авторах

Наталья Михайловна Попова

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5166-8372
SPIN-код: 7553-9852
ResearcherId: B-1130-2016

к.м.н., старший преподаватель кафедры фармакологии с курсом фармации факультета дополнительного профессионального образования