Регуляция функционирования ABCB1-белка в коре головного мозга на фоне глобальной церебральной ишемии

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НАДФН₂ — восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат

G-per — glutathione peroxidase (глутатионпероксидаза)

HIF-1α — hypoxia inducible factor 1α (индуцируемый гипоксией фактор 1α)

Nrf2 — nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (редокс-чувствительный транскрипционный фактор 2)

ВВЕДЕНИЕ

ABCB1-белок (син.: гликопротеин-P, Pgp) — мембранный белок-транспортер, осуществляющий эффлюкс из клеток широкого спектра субстратов липофильной природы, в т. ч. лекарственных веществ. Локализуясь в слизистой оболочке тонкого кишечника, на билиарной мембране гепатоцитов, в эпителиоцитах канальцев нефронов, в гистогематических барьерах транспортер препятствует всасыванию субстратов в желудочно-кишечном тракте, выводит их в мочу и желчь и предотвращает проникновение в забарьерные органы (головной мозг, яичники, внутреннюю среду глаза, к плоду) [1, 2].

Функционирование ABCB1-белка определяется генетическими особенностями организма, наличием патологических состояний, приемом ряда пищевых продуктов и лекарственных препаратов. Изменение активности транспортера может привести к межлекарственным взаимодействиям, в результате которых вследствие активации белка-переносчика снижается эффективность фармакотерапии, а на фоне его ингибирования повышается риск относительной лекарственной передозировки [1, 2].

Изменение функциональной активности ABCB1-белка в гематоэнцефалическом барьере является причиной развития множественной лекарственной устойчивости опухолей головного мозга, неэффективности применения нейропротекторов при нарушениях мозгового кровообращения, возникновения эпилепсии, резистентной к лекарственному лечению [3]. Следует отметить, что направленная фармакологическая регуляция ABCB1-белка может повысить эффективность фармакотерапии указанных патологий за счет повышения проникновения субстратов транспортера в ткань головного мозга.

Ишемическо-гипоксическое поражение головного мозга занимает ведущую роль в патогенезе ряда заболеваний и патологических состояний: инсультов, ишемическо-гипоксической энцефалопатии, дисциркуляторной энцефалопатии, метаболических и токсических поражений центральной нервной системы.

Большинство исследований ABCB1-белка in vitro показало увеличение его функциональной активности и синтеза, а также экспрессии гена MDR1, кодирующего транспортер, в результате воздействия гипоксической гипоксии [4]. При этом функционирование ABCB1-белка при циркуляторной гипоксии изучено недостаточно, а результаты влиянии церебральной ишемии и ишемии-реперфузии на транспортер in vivo весьма противоречивы [3].

Следует отметить, что регуляция функционирования ABCB1-белка в научной литературе оценивалась преимущественно in vitro на культурах клеток, гиперэкспрессирующих данный белок-транспортер. Результаты, полученные на животных, немногочисленны и противоречивы. Совместное участие редокс-чувствительного транскрипционного фактора 2 (англ.: nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2) и индуцируемого гипоксией фактора 1α (англ.: hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α) в контроле работы ABCB1-белка также не было рассмотрено ранее.

Учитывая вышеизложенное, установление механизмов регуляции ABCB1-белка на фоне ишемическо-гипоксических поражений головного мозга позволит расширить подход к направленному изменению его активности, что может повысить эффективность фармакотерапии указанных патологий с применением субстратов данного транспортера.

Цель — изучение регуляции функционирования ABCB1-белка в коре головного мозга крыс на фоне глобальной церебральной ишемии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперимент выполнен на 30 половозрелых крысах-самцах сток вистар массой 250–360 г, полученных из питомника «Столбовая» (Московская область, Россия) в соответствии с правилами лабораторной практики, регламентируемыми Приложением к приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н, затем — на основании Приказа Министерства здравоохранения Российской Федерации от 1 апреля 2016 г. № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Исследование было одобрено комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных Рязанского государственного медицинского университета имени академика И. П. Пав- лова (Протокол № 7 от 03.04.2018). Все оперативные вмешательства проводились в условиях операционной вивария Рязанского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова под наркозом, который осуществляли внутрибрюшинным введением препарата Золетил 50® (Virbac, Франция) в дозе 10 мг/кг [3]. Эвтаназия животных осуществлялась путем забора крови из брюшной аорты под глубоким наркозом (внутрибрюшинное введение Золетила 50® в дозе 30 мг/кг), после чего у животных извлекали образцы коры головного мозга [3].

Серии эксперимента. Крысы были разделены на 6 серий:

• - 1 серия — «ложная операция» (контроль),
• - 2–6 серии — животные через 30 мин., 2 ч., 4 ч., 24 ч. и 72 ч. после глобальной церебральной ишемии, которую моделировали за счет билатеральной окклюзии общих сонных артерий крыс.

При этом проводили вскрытие мягких тканей шеи животных, выделяли общие сонные артерии и накладывали на них лигатуры Surgipro II 4.0 (Covidien, Швейцария) с последующим ушиванием раны.

Подготовка биологического материала. У каждого животного проводили забор лобной доли коры головного мозга, образцы измельчали ножницами и гомогенизировали на холоде в фосфатном буфере с рН 7,4 (1:10 по массе) с последующей трехкратной заморозкой-разморозкой для лизиса клеток, как указано в инструкции к набору для иммуноферментного анализа, и центрифугированием при 1750 g. Замороженный супернатант хранили до анализа при -80°С не более трех недель.

Определение количества ABCB1-белка в коре головного мозга. Для оценки абсолютного количества ABCB1-белка в коре головного мозга применяли метод гетерогенного иммуноферментного анализа с использованием готового диагностического набора ElisaKits BlueGene (КНР), предназначенного для работы с тканями крыс.

Исследование свободнорадикального статуса в гомогенате коры головного мозга крыс. Определение концентрации малонового диальдегида (тиобарбитуровая кислота — реактивных продуктов). Для анализа содержания малонового диальдегида применяли набор ТБК-АГАТ (АГАТ-МЕД, Россия). Метод основан на способности малонового альдегида реагировать с 2-тиобарбитуровой кислотой с образованием эквимолярного количества окрашенного комплекса с максимумами поглощения при 535 нм и 570 нм. В пробирку вносили 0,25 мл супернатанта, 3,0 мл 1,4%-ной ортофосфорной кислоты, 1,0 мл раствора 2-тиобарбитуровой кислоты (150 мг — 31 мл дистиллированной воды), после чего пробирки инкубировали 45 мин. на водяной бане при 100°С и охлаждали холодной водой в течение 3 мин. Далее добавляли 4,0 мл н-бутанола, встряхивали пробирки до образования однородной белой суспензии с розовым оттенком, центрифугировали при 1750 g 10 мин., и в 3 мл органической фазы определяли оптическую плотность на спектрофотометре UV-150-02 (Shimadzu, Япония) при двух длинах волн против холостой пробы (0,25 мл дистиллированной воды вместо гомогената мозга). Полученные результаты выражали в нмоль/мг белка.

Определение содержания общих сульфгидрильных (SH) групп. Применяемый метод основан на способности сульфгидрильных групп восстанавливать растворенный в этаноле дисульфид 5,5-дитиобис-2-нитробензоат (реактив Эллмана) с образованием эквивалентного количества окрашенных в желтый цвет анионов 2-нитро-5-тиобензоата, которые определяли по приросту светопоглощения раствора на спектрофото-метре UV-150-02 (Shimadzu, Япония) при длине волны 412 нм. В пробирку вносили 100 мкл супернатанта и добавляли 100 мкл 0,2 М раствора этилендиаминтетраацетата в реактиве Эллмана. Полученную смесь сфектрофотометрировали через 30 мин. инкубации при температуре 22–25°С.

Расчет содержания общих сульфгидрильных групп осуществляли с использованием коэффициента молярной экстинкции 0,0136 см^-1 × нмоль^-1, результаты выражали в мкмоль/мг белка.

Определение активности глутатионпероксидазы (G-per). Спектрофотометрическое определение активности G-per основано на регистрации уменьшения оптической плотности опытного образца при 340 нм и температуре 37°C в результате реакции окисления восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН2), который является донором редуцирующих эквивалентов для реакции ферментативного восстановления глутатиона, который предварительно окисляется гидроперекисью трет-бутила. Интенсивность окисления НАДФН2 тем выше, чем выше активность G-per, и тем более выражено уменьшение интенсивности поглощения света.

Реакционная смесь содержала 1,2 мл 0,05 М изотонического фосфатного буфера с рН 7,4, 0,1 мл 1 мМ этилендиаминтетраацетата, 0,1 мл 0,12 мМ НАДФН2, 0,2 мл 1,85 мМ раствора восстановленного глутатиона, 0,5 ЕД глутатионредуктазы, 0,2 мл 0,2 мМ гидроперекиси трет-бутила и 0,1 мл тестируемого образца. Реакцию инициировали добавлением гидроперекиси трет-бутила, после чего пробирку инкубировали при температуре 37°С в течение 3 мин. Оптическую плотность регистрировали на биохимическом анализаторе Humalaizer 2000 (Германия) при длине волны 340 нм. За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для окисления 1 мкМ восстановленного глутатиона в минуту в условиях определения. Результаты активности выражали в нмоль НАДФН2/мин х мг белка.

Определение уровня транскрипционных факторов. Для оценки содержания транскрипционных факторов Nrf2 и HIF-1α образец коры головного мозга гомогенизировали в фосфатном буфере с pH 7,4 (1:1 по массе) на холоде с последующей трехкратной заморозкой-разморозкой для лизиса клеток, как указано в инструкции к набору для иммуноферментного анализа, и центрифугированием при 1750 g. Абсолютное количество факторов определяли методом гетерогенного иммуноферментного анализа с применением наборов ElisaKits Cloud-Clone (КНР) и ElisaKits BlueGene (КНР) соответственно, предназначенных для работы с тканями крыс.

Именно рост количества указанных факторов за счет их стабилизации в условиях дефицита кислорода (HIF-1α) или накопления продуктов перекисного окисления липидов (Nrf2) является свидетельством их активации [5].

Абсолютное количество ABCB1-белка и транскрипционных факторов, а также показателей интенсивности перекисного окисления липидов в ткани мозга соотносили с общим количеством белка, определяемым по методу Бредфорда.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием пакета Microsoft Office XP (США) и программы Statistica 7.0 (США). Характер распределения данных оценивали по критериям Шапиро–Уилка, Колмогорова–Смирнова и Лиллиефорса. Равенство дисперсий доказывали с использованием критерия Левена. Межгрупповые различия определяли по критерию Ньюмена–Кейлса. Зависимость содержания ABCB1-белка в ткани головного мозга от показателей свободнорадикального статуса и уровня транскрипционных факторов оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона (r). Достаточным уровнем статистической значимости считали p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Установлено, что билатеральная окклюзия общих сонных артерий вызывала недостоверное снижение количества ABCB1-белка в коре головного мозга крыс через 2 ч. после дебюта патологии, после чего его уровень возрастал, и к четвертому часу ишемии превышал показатели ложнооперированных животных в 3,55 раза (p < 0,05). Через 24 ч после выполнения окклюзии содержание транспортера было достоверно выше значения серии ложной операции в 3,27 раза (p < 0,05), а через 72 ч. его количество уменьшалось до значений, не отличающихся от уровня ложнооперированных крыс (p > 0,05).

При исследовании свободнорадикального статуса коры головного мозга крыс нами были получены следующие результаты (табл. 1).

 

Таблица 1. Содержание ABCB1-белка и показатели выраженности окислительного стресса в коре головного мозга крыс при билатеральной окклюзии общих сонных артерий

Параметры	Серии эксперимента
	Ложная операция	Билатеральная окклюзия общих сонных артерий
		30 мин.	2 ч.	4 ч.	24 ч.	72 ч.
n	5	5	5	5	5	5
Уровень ABCB1-белка, нг/мг белка	0,22 (0,16; 0,25)	0,14 (0,064; 0,15)	0,38 (0,21; 0,42)	0,78 (0,40; 0,82)*	0,72 (0,62; 2,08)*	0,22 (0,11; 0,22)
Уровень малонового диальдегида, нмоль/мг белка	24,69 (11,21; 33,12)	31,36 (29,41; 40,17)*	68,61 (59,12; 82,54)*	45,46 (24,17; 79,72)*	47,22 (18,48; 69,09)	34,31 (31,10; 38,71)
SH-группы, мкмоль/мг белка	48,92 (41,41; 64,01)	24,77 (20,04; 43,31)	55,55 (44,96; 72,67)	42,11 (40,07; 53,31)	31,93 (17,28; 68,08)	40,37 (30,38; 41,49)
Активность глутатионпероксидазы, нмоль НАДФН/мг белка × мин	20,48 (18,6; 22,76)	16,1 (12,7; 19,3)*	20,9 (19,2; 27,4)	15,4 (14,3; 18,0)*	17,04 (16,83; 17,14)	20,71 (19,77; 20,98)

Примечания: * — статистически значимые различия по сравнению с показателями ложнооперированных животных (p < 0,05); результаты представлены в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей — при распределении данных, отличном от нормального; НАДФ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат

 

Содержание малонового диальдегида в коре больших полушарий статистически значимо увеличивалось через 2 ч. и 4 ч. после проведения окклюзии в 2,78 (p < 0,05) и в 1,84 раза (p < 0,05) соответственно, после чего постепенно уменьшалось до исходных значений. Концентрация общих SH-групп достоверно не отличалась от показателей ложнооперированных крыс, а активность G-per снижалась через 30 мин. на 21,5% (p < 0,05) и через 4 ч. — на 24,9% (p < 0,05) по сравнению с контрольными значениями.

Установлено, что повышение количества ABCB1-белка в коре головного мозга крыс на фоне глобальной церебральной ишемии коррелирует с показателями липопероксидации, что показывает выявленная прямая корреляционная зависимость (r = 0,33, уровень тенденции, p = 0,066) между уровнем белка-транспортера в коре головного мозга и количеством малонового диальдегида — основного показателя, характеризующего интенсификацию липопероксидации ткани.

Для выявления зависимости количества ABCB1- белка от интенсивности окислительного стресса при глобальной церебральной ишемии и оценки механизмов регуляции транспортера изучено абсолютное количество транскрипционных факторов Nrf2 и HIF-1α в коре больших полушарий головного мозга крыс.

Оценка динамики уровня транскрипционных факторов в коре больших полушарий крыс показала, что содержание Nrf2 возрастало через 2 ч. после моделирования двусторонней окклюзии общих сонных артерий в 3,83 раза (p < 0,05), а через 4 ч. ишемии — в 4,05 раза (p < 0,05). При этом через сутки уровень данного фактора снижался, но оставался выше значений ложнооперированных крыс в 1,29 раза на уровне тенденции (p = 0,076). На третий день эксперимента содержание Nrf2 достигало исходных значений (табл. 2).

 

Таблица 2. Содержание транскрипционных факторов Nrf2 и HIF-1α в коре головного мозга крыс при билатеральной окклюзии общих сонных артерий

Параметры	Серии эксперимента
	Ложная операция	Билатеральная окклюзия общих сонных артерий
		30 мин.	2 ч.	4 ч.	24 ч.	72 ч.
n	5	5	5	5	5	5
Количество Nrf2, нг/мг белка	0,021 (0,013; 0,031)	0,011 (0,0052; 0,014)	0,038* (0,028; 0,044)	0,085* (0,015; 0,122)	0,027** (0,023; 0,031)	0,003 (0,0021; 0,0062)

Примечания: * — статистически значимые различия по сравнению с показателями ложнооперированных животных (p < 0,05); ** — различия по сравнению с показателями ложнооперированных животных на уровне тенденции (0,05 < p < 0,1); HIF-1α — hypoxia inducible factor 1α (индуцируемый гипоксией фактор 1α), Nrf2 — nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (редокс-чувствительный транскрипционный фактор 2)

 

Установлено, что билатеральная окклюзия общих сонных артерий приводила к увеличению содержания HIF-1α на уровне тенденции в 32,12 раза (p = 0,083) через 24 ч. после операции, и к достоверному повышению в 17,21 раза (p < 0,05) через 72 ч. после экспериментального влияния. При этом в остальные временные точки, различия с показателями ложнооперированных крыс были недостоверны (p > 0,05) (табл. 2).

При проведении корреляционного анализа была выявлена прямая зависимость между количеством ABCB1-белка и содержанием Nrf2 в коре головного мозга крыс при билатеральной окклюзии общих сонных артерий (r = 0,33, p = 0,047).

ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения функционирования ABCB1-белка в коре больших полушарий головного мозга нами была выбрана модель, представляющая собой билатеральную окклюзию общих сонных артерий крыс-самцов, которая является адекватной моделью хронической церебральной гипоперфузии [6].

Установлено, что на фоне билатеральной окклюзии общих сонных артерий уровень ABCB1-белка в коре головного мозга крыс начинал увеличиваться, начиная с 4 ч. после дебюта патологии, и сохранялся повышенным до суток эксперимента. Следует отметить, что ишемия продолжительностью более 3 сут. не изучалась из-за низкой выживаемости животных, что согласуется с литературными данными [7], а также вследствие частичного восстановления кровообращения в мозге из-за неоангиогенеза у выживших крыс [8], что повлекло бы неверную интерпретацию данных.

В научной литературе продемонстрирована прямая корреляционная зависимость между количеством ABCB1-белка и его функциональной эффлюксной активностью [9]. Соответственно повышение количества ABCB1-белка в коре головного мозга при глобальной церебральной ишемии приведет к усилению его функционирования, что проявится снижением проникновения субстратов белка-транспортера, в т. ч. лекарственных веществ, в ткань головного мозга.

Результаты подобных исследований в научной литературе немногочисленны и противоречивы. Так установлено, что 20-минутная окклюзия вертебральных и сонных артерий вызывала повышение концентрации в головном мозге крыс доксорубицина — субстрата ABCB1-белка, что, по мнению авторов, связано с истощением уровня аденозинтрифосфата в ткани мозга и уменьшением активности транспортера [10]. Отличия наших результатов от данных других экспериментов могут быть обусловлены разным объемом ишемии головного мозга, длительностью и способом моделирования патологии, выраженностью окислительного стресса, областью взятия образца ткани, различными методами анализа.

Активация перекисного окисления липидов является признаком ряда заболеваний центральной нервной системы, в том числе ишемической этиологии [11]. При исследовании свободнорадикального статуса коры головного мозга крыс нами было обнаружено, что повышение количества ABCB1-белка в коре головного мозга крыс на фоне глобальной церебральной ишемии коррелирует с показателями липопероксидации, что показывает выявленная прямая корреляционная зависимость между уровнем транспортера в мозге и количеством малонового диальдегида — основного показателя, характеризующего интенсификацию перекисного окисления липидов. Полученная зависимость согласуется с результатами других научных трудов, где выявлено, что при ишемии наблюдается активация экспрессии и функциональной активности ABCB1-белка, коррелирующая с интенсификацией перекисного окисления липидов.

Так в эксперименте in vitro показано, что влияние перекиси водорода (200 мкМ) приводило к окислительному стрессу и увеличению количества ABCB1-белка и транкриптов mdr1a и mdr1b в культуре эндотелиальных клеток сосудов головного мозга крыс [12].

При инкубации культур клеток опухолей KB31, KBV1, A549 и DMS-53 на гипо- и гипергликемических средах установлено развитие окислительного стресса за счет НАДФН2-зависимой оксидазы 4 и дестабилизации мембран митохондрий, увеличение экспрессии и активация транскрипционного фактора HIF-1 и выраженное повышение функциональной активности ABCB1-белка, приводящее к резистентности к его субстрату — доксорубицину [13].

Следует отметить, что в научной литературе также представлены данные об ингибировании ABCB1-белка на фоне активации перекисного окисления липидов.

Так на фоне ишемии-реперфузии кишечника отмечалось снижение экскреции печенью субстрата ABCB1- белка — родамина-123, которое может быть обусловлено уменьшением экспрессии транспортера, вследствие увеличения уровня перекисного окисления липидов и повышения содержания информационной рибонуклеиновой кислоты индуцибельной NO-синтазы [14].

В эксперименте in vitro установлено, что низкие дозы перекиси водорода (0,1–1,0 мкМ) при инкубации с клетками, гиперэкспрессирующими ABCB1-белок, приводили к увеличению количества транспортера, но его активность оставалась неизменной. При повышении концентрации прооксиданта до 10 мкМ функциональная активность транспортера снижалась, а при концентрациях 50−100 мкМ происходило снижение его количества и активности [15].

Ингибирование ABCB1-белка на фоне активации перекисного окисления липидов в описанных выше экспериментах, вероятно, обусловлено развитием более выраженного, некомпенсированного окислительного стресса.

Для выявления зависимости количества ABCB1-белка от интенсивности окислительного стресса при глобальной церебральной ишемии и оценки механизмов регуляции транспортера изучено абсолютное количество транскрипционных факторов Nrf2 и HIF-1α в коре больших полушарий головного мозга крыс. Nrf2 является внутриклеточным сенсором активных форм кислорода и прооксидантов и активатором ряда ферментов детоксикации и эффлюксных транспортеров ксенобиотиков и токсичных продуктов метаболизма, в т. ч. ABCB1-белка [16], а HIF-1 — детектор тканевого дефицита кислорода [17].

Оценка динамики уровня транскрипционных факторов в коре больших полушарий крыс показала, что содержание Nrf2 возрастало через 2 ч., 4 ч. и 24 ч. после моделирования двусторонней окклюзии общих сонных артерий. На третий день эксперимента содержание Nrf2 снижалось до исходных значений. Количество HIF-1α увеличивалось только через 24 ч. и 72 ч. после операции. При этом при проведении корреляционного анализа была выявлена прямая зависимость между количеством ABCB1-белка и содержанием Nrf2 в коре головного мозга, которая демонстрирует роль данного фактора в регуляции уровня белка-транспортера. Это подтверждается в экспериментах in vitro, где показано предотвращение роста количества ABCB1-белка на фоне гипоксии в результате нокдауна гена, кодирующего Nrf2 [18].

В другом исследовании in vitro установлено что ингибирование транскрипционного фактора HIF-1 предотвращает увеличение содержания ABCB1-белка при гипоксии [19]. Следует отметить, что отсутствие достоверных изменений HIF-1α в первые часы ишемии в нашем эксперименте, вероятно, связано с межиндивидуальными различиями животных. Также известно, что синтезированный Nrf2 быстро разрушается посредством 26S протеосомы в цитоплазме клеток, а образование HIF-1α характеризуется длительным латентным периодом и большей продолжительностью функционирования из-за сохранения дефицита кислорода [20]. Учитывая приведенные данные in vitro и наши результаты, можно предположить, что на ранних этапах ишемии основная роль в регулировании количества АВСВ1-белка принадлежит Nrf2, а на поздних — кислородчувствительному фактору.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, количество ABCB1-белка в коре головного мозга крыс при глобальной церебральной ишемии зависит от показателей выраженности окислительного стресса, при этом в его регуляции играют роль транскрипционные факторы Nrf2 и HIF-1α. Снижение количества транспортера в гематоэнцефалическом барьере за счет влияния на процессы перекисного окисления липидов или синтез изученных транскрипционных факторов расширяет возможности для увеличения проникновения субстратов ABCB1-белка в головной мозг с целью повышения эффективности фармакотерапии различных заболеваний центральной нервной системы, при которых продемонстрирована интенсификация работы транспортера.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Финансирование. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов: Черных И. В. — концепция исследования, проведение исследования; Щулькин А. В. — анализ и курирование данных; Попова Н. М. — анализ и курирование данных, написание текста; Гацанога М. В. — проведение исследования, разработка методологии; Якушева Е. Н. — руководство научно-исследовательской работой. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Funding. This study was not supported by any external sources of funding.

Conflict of interests. The authors declare no conflicts of interests.

Contribution of the authors: I. V. Chernykh — concept of study, execution of study; A. V. Shchul’kin — analysis and processing of data; N. M. Popova — analysis and processing of data , writing the text; M. V. Gatsanoga — execution of study, methodology development; E. N. Yakusheva — research management. The authors confirm the correspondence of their authorship to the ICMJE International Criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Об авторах

Иван Владимирович Черных

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: ivchernykh88@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5618-7607
SPIN-код: 5238-6165
ResearcherId: R-1389-2017

доктор биологических наук, доцент

Россия, Рязань

Алексей Владимирович Щулькин

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: alekseyshulkin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1688-0017
SPIN-код: 2754-1702

доктор медицинских наук, доцент

Россия, Рязань

Наталья Михайловна Попова

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: p34-66@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5166-8372
SPIN-код: 7553-9852

кандидат медицинских наук, доцент

Россия, Рязань

Мария Валерьевна Гацанога

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: mvgatsanoga@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1116-6271
SPIN-код: 9645-5079
ResearcherId: T-3803-2017

кандидат медицинских наук

Россия, Рязань

Елена Николаевна Якушева

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: enya.rzn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6887-4888
SPIN-код: 2865-3080
ResearcherId: T-6343-2017

доктор медицинских наук, профессор

Россия, Рязань

Список литературы

Дополнительные файлы