Оценка цитотоксичности гликонаночастиц золота на клетках аденокарциномы ободочной кишки человека

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НЧЗ — наночастицы золота

ГНЧЗ — гликонаночастицы золота

IC₅₀ — 50% inhibitory concentration (концентрация полумаксимального ингибирования)

Au-Fuc-MHH — aurum-fucose-mercaptohexanoylhydrazide (золото-фукоза-меркаптогексаноилгидразид)

Au-Lac-MPH — aurum-lactose-mercaptopropanoylhydrazide (золото-лактоза-меркаптопропаноилгидразид)

Au-Gal-MPH — aurum-galactose-mercaptopropanoylhydrazide (золото- галактоза-меркаптопропаноилгидразид)

МТТ — 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолий

ВВЕДЕНИЕ

Онкологические заболевания являются второй по частоте причиной смертности в мире после сердечно-сосудистой патологии и составляют более 15% в структуре общей смертности [1]. В настоящее время реализуется Национальная стратегия по борьбе с онкологическими заболеваниями на долгосрочный (до 2030 г.) период, приоритетным направлением которой является доступ к безопасным, эффективным, качественным и недорогим основным лекарственным средствам и вакцинам для всех, а также внедрение современных средств и систем с направленной доставкой лекарственных веществ [2].

Наиболее распространенными формами онкологических заболеваний являются опухоли легких и груди (8,09 млн смертей в 2018 г.), колоректальные опухоли (1,8 млн), опухоли предстательной железы (1,28 млн), кожи (1,04 млн) и желудка (1,03 млн), требующие своих способов лечения: хирургического, радио- и фармакотерапии [2].

Одним из перспективных направлений противоопухолевой лекарственной терапии, а также таргетной доставки химиопрепаратов является использование наночастиц благородных металлов, благодаря наличию у них комплекса специфических оптических и электрических свойств, развитой поверхности и возможности ее модификации прежде всего путем введения заместителей посредством тиольной группы, имеющей высокое сродство к металлам [3−5].

Для использования НЧЗ in vivo на экспериментальных моделях опухолей необходимо проанализировать цитотоксичность тестируемых веществ на культурах нормальных и опухолевых клеток in vitro с целью установления концентраций и длительности инкубации, при которых они являются более токсичными по отношению именно к мальформированным клеткам.

Цель — оценить цитотоксичность растворов наночастиц золота с поверхностью, модифицированной остатками фукозы, лактозы и галактозы, на культуре клеток аденокарциномы ободочной кишки человека Caco-2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использовали следующие водные коллоидные растворы модифицированных НЧЗ с диаметром 18−21 нм [7], синтезированные в лаборатории полимерных наноматериалов и композиций для оптических сред Института высокомолекулярных соединений РАН (Санкт-Петербург, Россия):

1) золото-фукоза-меркаптогексаноилгидразид (Au-Fuc-MHH) (1 мг/мл);

2) золото-лактоза-меркаптопропаноилгидразид (Au-Lac-MPH) (2 мг/мл);

3) золото-галактоза-меркаптопропаноилгидразид (Au-Gal-MPH) (1 мг/мл).

Синтез гликонаночастиц золота (ГНЧЗ) (III) включал две стадии: взаимодействие природных моно- и дисахаридов (I) с гидразидами 3-меркаптопропионовой или 6-меркаптогексановой кислот и модификация коллоидного золота продуктами конденсации (II), полученными на первой стадии процесса (рис. 1) [6, 7].

 

Рис. 1. Схематичное изображение синтеза гликонаночастицы золота [6, 7].

Примечания: X — атом водорода или фрагмент D-галактозы, Z — атом кислорода, R — метильная или гидроксиметильная группа, n — 1-тиопропаноильная группа или 4-тиогексаноильная группа; I — природные моно- и дисахариды, II — продукт конденсации, III — гликонаночастицы золота.

 

Для приготовления рабочих растворов ГНЧЗ маточные растворы разбавляли средой для культивирования клеток до конечных концентраций 10−600 мкг/мл для частиц, модифицированных остатками фукозы (10, 25, 50, 100, 200, 400, 450, 475, 500, 550, 600 мкг/мл), 10−900 мкг/мл для частиц, покрытых остатками лактозы (10, 25, 50,100, 200, 400, 600, 650, 700, 750, 850, 900 мкг/мл), и 10−550 мкг/мл для частиц, модифицированных остатками галактозы (10, 25, 50, 100, 200, 400, 450, 475, 500, 550 мкг/мл). Сроки инкубации веществ с клетками составили 2 ч, 8 ч и 24 ч.

В качестве препарата сравнения использовали фторурацил (стандартный фармакопейный образец Nantong Jinghua Pharmaceutical Co., Ltd.), который рекомендован для адъювантной терапии колоректальных опухолей [8], в концентрациях 50−2000 мкг/мл (50, 200, 600, 800, 1000, 1500, 2000 мкг/мл). Продолжительность его инкубации с клетками — 2 ч и 8 ч в связи с продемонстрированной в данной работе более высокой цитотоксичностью ГНЧЗ по отношению к опухолевым клеткам именно при указанных сроках.

Исследование цитотоксичности ГНЧЗ и фторурацила выполнено на линии клеток аденокарциномы ободочной кишки человека — Caco-2 (Центр коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали при 37℃ и 5% содержании СО₂ в инкубаторе WS-189C (WorldScience, Корея) в Дульбекко модифицированной среде Игла с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л), содержащей L-глутамин (4 мМ), 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл и 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина (все компоненты Sigma-Aldrich, Германия) соответственно. После достижения 80%-го монослоя клетки снимали с фласка добавлением раствора трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина и 0,2% ЭДТА, Sigma-Aldrich, Германия) и высеивали в 96-луночный планшет (Сorning, США) в количестве 10⁴ клеток на лунку. Далее клетки культивировали в течение 48 ч после достижения монослоя (культура опухолевых клеток — аденокарциномы ободочной кишки человека — первая серия) или 21 сут после образования монослоя (культура клеток, подобная эпителиоцитам тонкого кишечника человека — дифференцированные клетки — вторая серия [9]). Cмену питательной среды производили ежедневно.

Цитотоксичность (влияние на интенсивность клеточного метаболизма) растворов ГНЧЗ и фторурацила оценивали в ходе МТТ-теста. Растворы тестируемых веществ описанных концентраций в среде инкубации добавляли в лунки с клетками первой и второй серий на 2 ч, 8 ч и 24 ч. После окончания инкубации в каждую лунку добавляли по 20 мкл 0,5%-го изотонического раствора бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолия (МТТ; Sigma, США) и инкубировали в течение 2 ч, затем раствор МТТ удаляли и добавляли 100 мкл диметилсульфоксида (ПанЭко, Россия). Оптическую плотность растворов измеряли через 10 мин при 530 нм на спектрофотометре для планшетов StatFax 2100 (Awareness Technology, США) с дифференциальным фильтром на 620 нм.

Цитотоксичность рассчитывали по формуле:

цитотоксичность= (ОП опытных лунок — ОП blank)/(ОП контрольных лунок — ОП blank) × 100%

где ОП — оптическая плотность, blank — лунка без клеток, контрольные лунки — лунки с клетками при инкубации с чистой питательной средой.

Для каждой ГНЧЗ и срока инкубации использовали по 4 повторения.

В дальнейшем с помощью программы GraphPad Prizm 8.4.3 была рассчитана концентрация полумаксимального ингибирования (IC₅₀) в мкг/мл для каждой из ГНЧЗ и фторурацила при всех сроках инкубации, и проведено сравнение данных параметров для опухолевых и дифференцированных клеток.

Для анализа влияния изучаемых ГНЧЗ и фторурацила в концентрациях, соответствующих IC₅₀ при сроках инкубации, на фоне которых IC₅₀ для опухолевых клеток была достоверно ниже, чем для дифференцированных, на выживаемость опухолевых клеток проводилась их окраска красителем трипановым синим (Bio-Rad, США) путем смешивания 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл красителя и нанесения смеси на картридж автоматического счетчика клеток Countess II FL (Thermo FS, США). Для проведения анализа клетки культивировали в 96-луночных планшетах. В качестве контроля использовали клетки, инкубируемые с питательной средой без добавления исследуемых соединений. На каждое вещество и срок инкубации использовали по 3 повторения.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 13.0 (Stat Soft Inc., США). Данные представлены в виде среднего арифметического ± стандартное отклонение (M ± SD). Распределение данных анализировали, используя критерий Шапиро−Уилка. Межгрупповые различия IC₅₀ ГНЧЗ и фторурацила при разных сроках инкубации с клетками, а также между опухолевыми и дифференцированными клетками анализировали с помощью критерия Стьюдента для несвязанных выборок. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При исследовании цитотоксичности ГНЧЗ и фторурацила на клетки Caco-2 были получены следующие результаты (рис. 2−4).

 

Рис. 2. Графики метаболической активности клеток Caco-2 при их инкубации с гликонаночастицами золота и фторурацилом в течение 2 часов.

Примечания: Au-Fuc-MHH — золото-фукоза-меркаптогексаноилгидразид, Au-Gal-MPH — золото-галактоза-меркаптопропаноилгидразид, Au-Lac-MPH — золото-лактоза-меркаптопропаноилгидразид. Точки на графике соответствуют среднему арифметическому значению, разброс — стандартному отклонению.

 

 

Рис. 3. Графики метаболической активности клеток Caco-2 при их инкубации с гликонаночастицами золота и фторурацилом в течение 8 часов.

Примечания: Au-Fuc-MHH — золото-фукоза-меркаптогексаноилгидразид, Au-Gal-MPH — золото-галактоза-меркаптопропаноилгидразид, Au-Lac-MPH — золото-лактоза-меркаптопропаноилгидразид. Точки на графике соответствуют среднему арифметическому значению, разброс — стандартному отклонению.

 

Рис. 4. Графики метаболической активности клеток Caco-2 при их инкубации с гликонаночастицами золота и фторурацилом в течение 24 часов.

Примечания: Au-Fuc-MHH — золото-фукоза-меркаптогексаноилгидразид, Au-Gal-MPH — золото-галактоза-меркаптопропаноилгидразид, Au-Lac-MPH — золото-лактоза-меркаптопропаноилгидразид. Точки на графике соответствуют среднему арифметическому значению, разброс — стандартному отклонению.

 

IC₅₀ для наночастиц с фукозой по отношению к опухолевым клеткам (первая серия) составила 581,5 ± 28,9 мкг/мл и 335,5 ± 35,5 мкг/мл после 2- и 8-мичасовой инкубации соответственно; для наночастиц с лактозой — 768,9 ± 50,3 мкг/мл и 514,5 ± 44,8 мкг/мл, для наночастиц с галактозой — 466,9 ± 29,2 мкг/мл и 298,6 ± 27,8 мкг/мл. Более длительная инкубация привела к достоверному снижению IC₅₀ протестированных наночастиц в 1,43 (p = 0,0007), в 1,50 (p = 0,0003) и в 1,56 раза (p = 0,0003) в сравнении с 2 ч инкубацией соответственно.

В отношении дифференцированных клеток (вторая серия) IC₅₀ для всех типов наночастиц была достоверно выше, чем для опухолевых клеток: для наночастиц с фукозой — 530,1 ± 2,7 мкг/мл при 2 ч инкубации (p = 0,037) и 410,0 ± 14,7 мкг/мл при 8 ч инкубации (p = 0,002); для наночастиц с лактозой — 830,9 ± 6,5 мкг/мл при 2 ч инкубации (p = 0,019) 638,9 ± 13,7 мкг/мл при 8 ч инкубации (p = 0,015); для наночастиц с галактозой — 510,7 ± 20,9 мкг/мл при 2 ч инкубации (p = 0,018) и 376,1 ± 35,8 мкг/мл при 8 ч инкубации (p = 0,007).

Увеличение продолжительности инкубации дифференцированных клеток с ГНЧЗ, содержащих остатки фукозы, лактозы и галактозы, с 2 ч до 8 ч привело к достоверному снижению IC₅₀ в 1,29 (p = 0,000004) и 1,30 (p < 0,00001) в 1,36 раза (p = 0,0006) соответственно.

При 24-часовой инкубации клеток Caco-2 с наночастицами, поверхность которых модифицирована фукозой, IC₅₀ по отношению к опухолевой и дифференцированной их разновидностям достоверно не отличалась (p > 0,05): 386,2 ± 9,2 мкг/мл — для первой серии, 246,5 ± 1,6 мкг/мл — для второй серии. В случае остальных ГНЧЗ IC₅₀ по отношению к опухолевым клеткам достоверно превосходила данный параметр для дифференцированных клеток: 730,6 ± 139,5 мкг/мл и 591,9 ± 7,8 мкг/мл для наночастиц с лактозой (p < 0,0001); 381,4 ± 13,3 мкг/мл и 235,0 ± 7,9 мкг/мл для наночастиц с галактозой (p < 0,0001).

В ряде случаев наблюдалось повышение интенсивности клеточного метаболизма дифференцированных (преимущественно) и опухолевых клеток выше 100% при инкубации с ГНЧЗ в низких дозах.

При изучении выживаемости опухолевых клеток было обнаружено, что при их инкубации с НЧЗ, модифицированными фукозой, лактозой и галактозой, в течение 2 ч процент живых клеток не отличался от значений при инкубации с чистой питательной средой (p > 0,05). При 8 ч инкубации с наночастицами данные показатели были ниже значений контроля и составили соответственно 24,17 ± 0,39% (p = 0,041), 30,55 ± 8,56% (p = 0,046), 32,81 ± 3,13% (p = 0,030, табл. 1).

 

Таблица 1. Значения выживаемости опухолевых клеток при инкубации с исследуемыми соединениями, %

Срок инкубации	Au-Fuc-MHH	Au-Lac-MPH	Au-Gal-MPH	Фторурацил
Контроль	100	100	100	100
2 часа	36,6 ± 1,78	60,6 ± 15,0	41,8 ± 7,33	28,8 ± 1,25
8 часов	24,17 ± 0,39*	30,55 ± 8,56*	32,81 ± 3,13*	45,37 ± 18,88*

Примечания: * — различия по сравнению с контролем с p < 0,05; Au-Fuc-MHH — золото-фукоза-меркаптогексаноилгидразид, Au-Lac-MPH — золото-лактоза-меркаптопропаноилгидразид, Au-Gal-MPH — золото-галактоза-меркаптопропаноилгидразид

 

Контрольный препарат фторурацил проявил цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам с IC₅₀ 2107,5 ± 19,1 мкг/мл и 1764,0 ± 192,8 мкг/мл при 2 ч и 8 ч инкубации соответственно. По отношению к дифференцированным клеткам IC₅₀ фторурацила составляла 1995,0 ± 19,7 мкг/мл после 2 ч инкубации и 1694,4 ± 101,5 мкг/мл при 8 ч инкубации (рис. 2, 3). Значимой разницы между IC₅₀ фторурацила по отношению к дифференцированным и опухолевым клеткам с одинаковой продолжительностью инкубации не наблюдалось (p > 0,05). Увеличение продолжительности инкубации привело к снижению IC₅₀ по отношению к опухолевым клеткам в 1,19 раза (p = 0,012); по отношению к дифференцированным клеткам — в 1,18 раза (p = 0,0024). IC₅₀ фторурацила по отношению к клеткам первой серии достоверно превосходила данный параметр для Au-Fuc-MHH, Au-Lac-MPH и Au-Gal-MPH: при 2 ч инкубации соответственно в 3,62 раза (p = 0,00019), 2,74 раза (p = 0,00018) и 4,51 раза (p = 0,0002); при 8 ч инкубации соответственно в 5,25 раза (p = 0,00019), 3,73 раза (p = 0,00017) и 5,90 раза (p = 0,0002).

Процент живых опухолевых клеток при инкубации с фторурацилом в концентрациях, соответствующих его IC₅₀, был ниже контроля только при 8 ч инкубации и составил 45,37 ± 18,88% (p = 0,035).

При сравнении процента мертвых опухолевых клеток после 8 ч инкубации с протестированными ГНЧЗ и фторурацилом разницы выявлено не было (p > 0,05). Таким образом, эффективность цитостатического действия веществ не отличается.

ОБСУЖДЕНИЕ

Целью исследования послужил анализ цитотоксичности НЧЗ, модифицированных фрагментами фукозы, лактозы и галактозы через остаток тиолсодержащих гидразидов карбоновых кислот по отношению к культуре клеток Caco-2 с помощью МТТ-теста. Причем клетки линии Caco-2 культивировали в 96-луночном планшете или 48 ч после достижения монослоя для получения опухолевых клеток, или в течение 21 сут после образования монослоя, поскольку при данном сроке происходит их спонтанная дифференцировка в физиологически поляризованный монослой, подобный эпителию тонкого кишечника [9]. Таким образом, в работу включали клетки разной морфологии, но одного предшественника — аденокарциномы ободочной кишки человека.

В нашей работе показана цитотоксичность НЧЗ по отношению к культуре клеток Caco-2 уже при 2-часовом инкубировании. При этом наблюдались более высокие значения IC₅₀ протестированных частиц по отношению к клеткам, дифференцированным в эпителиоциты тонкого кишечника. Аналогичные результаты выявлены и при 8-часовой инкубации.

Полученные результаты могут быть связаны с разной степенью накопления ГНЧЗ в дифференцированных и опухолевых клетках, что обусловлено наличием на поверхности частиц остатков сахаров, обладающих сродством к поверхностным лектинам опухолевых клеток [10]. Дальнейший анализ содержания наночастиц в клетках после инкубации может подтвердить это предположение. Увеличение продолжительности инкубации до 24 ч приводило к тому, что IC₅₀ наночастиц по отношению к опухолевым и дифференцированным клетками либо не отличалась (Au-Fuc-MHH), либо для опухолевых клеток становилась выше, чем для нормальных (Au-Lac-MPH и Au-Gal-MPH), что, вероятно, вызвано проникновением частиц также в нормальные клетки механизмом, отличным от рецептор-зависимого [11]. Так, в опухолевые ткани наночастицы способны проникать также пассивным путем, с помощью эффекта повышенной проницаемости и удерживания — EPR-эффекта (англ.: enhanced permeability and retention, эффект повышенной проницаемости и удерживания), связанного с ускоренным ростом опухолевых тканей и возникновением между клетками и в клеточных мембранах значительных полостей, а также с дефективной опухолевой васкуляризацией и нерегулярным эпителием, сниженным количеством лимфатических сосудов и незначительным поглощением интерстициальной жидкости [5].

Следует отметить выявленное возрастание метаболической активности как дифференцированных в эпителиоциты тонкого кишечника (преимущественно), так и опухолевых клеток при инкубировании с ГНЧЗ в течение указанных сроков. Одна из возможных причин данного феномена — это G2/M блокада клеточного цикла, которая сопровождается повышенной митохондриальной активностью. Данный процесс предшествует клеточной смерти [12].

Еще одна вероятная причина роста метаболической активности — ингибирование эффлюксного белка-транспортера гликопротеина-P (ABCB1-белка) наночастицами. МТТ является субстратом гликопротеина-P, и на фоне снижения его активности возможно более интенсивное внутриклеточное накопление вещества и его восстановление до формазана, поглощающего свет в ультрафиолетовом диапазоне [13]. Необходимо обратить внимание на то, что предварительное совместное инкубирование ГНЧЗ и МТТ в течение 8 ч не приводило к изменению оптического поглощения последнего, что теоретически могло бы привести к переоценке метаболической активности клеток при проведении МТТ-теста.

Превалирование того или иного механизма внутриклеточного проникновения наночастиц и, следовательно, последствия их применения зависят от типа клеток. Например, продемонстрирована повышенная потребность в моносахариде L-фукозе клеток колоректального рака, что создало предпосылки использования липосом с данным веществом для таргетной доставки противоопухолевых агентов [14]. На мембранах клеток рака поджелудочной железы также обнаружены специфические рецепторы, связывающиеся с фукозой [15], а культура клеток меланомы B16F10 более интенсивно взаимодействует с галактозо-модифицированными магнитными наночастицами [16].

В нашей работе в качестве препарата сравнения был выбран одобренный FDA (англ.: Food and Drug Administration, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) препарат — фторурацил, так как он продемонстрировал эффективность в терапии большого числа злокачественных новообразований, в т. ч. аденокарциномы толстого кишечника. Препарат ингибирует фермент тимидилсинтазу, что приводит к внутриклеточному дисбалансу нуклеотидов и двуцепочечным разрывам ДНК [17]. Также имеются сведения о стимуляции препаратом транскрипционного фактора p53 [18].

Результаты нашего исследования демонстрируют более высокую избирательность цитотоксического действия ГНЧЗ по сравнению с химиопрепаратом сравнения. Актуальным является дальнейший анализ in vitro возможных механизмов цитотоксичности НЧЗ. При этом рационально применять 2- и 8-часовую продолжительность инкубации, что связано с более высокой активностью частиц против опухолевых клеток по сравнению с дифференцированными в кишечный эпителий.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, наночастицы золота с поверхностью, модифицированной остатками фукозы, лактозы и галактозы, оказывают цитотоксическое действие на клетки аденокарциномы ободочной кишки человека, превосходя по активности классический цитостатик фторурацил.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Финансирование. Работа поддержана стипендией Президента Российской Федерации молодым ученым и аспирантам (Конкурс СП-2022).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов: Черных И. В. — концепция и дизайн исследования, анализ и интерпретация данных; Копаница М. А. — проведение исследований, редактирование рукописи; Щулькин А. В. — концепция и дизайн исследования, статистическая обработка данных; Якушева Е. Н. — концепция и дизайн исследования; Ершов А. Ю., Мартыненков А. А., Лагода И. В. — синтез исследуемых соединений; Волкова А. М. — проведение исследований. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Funding. The work was supported by a scholarship of the President of the Russian Federation for young scientists and graduate students (Competition SP-2022)..

Conflict of interests. The authors declare no conflicts of interests.

Contribution of the authors: I. V. Chernykh — study concept and design, data analysis and interpretation; M. A. Kopanitsa — conducting research, editing the manuscript; A. V. Shchul’kin — concept and design of the study, statistical data processing; E. N. Yakusheva — concept and design of the study; A. Yu. Ershov, A. A. Martynenkov, I. V. Lagoda — synthesis of the studied compounds; A. M. Volkova — researching. The authors confirm the correspondence of their authorship to the ICMJE International Criteria. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work.

Об авторах

Иван Владимирович Черных

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: ivchernykh88@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5618-7607
SPIN-код: 5238-6165

д.б.н., доцент

Россия, Рязань

Мария Андреевна Копаница

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Автор, ответственный за переписку.
Email: kopanitsa412@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7476-4538
SPIN-код: 8147-5006
Россия, Рязань

Алексей Владимирович Щулькин

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: alekseyshulkin@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1688-0017
SPIN-код: 2754-1702

д.м.н., доцент

Россия, Рязань

Елена Николаевна Якушева

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: enya.rzn@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-6887-4888
SPIN-код: 2865-3080

д.м.н., профессор

Россия, Рязань

Андрей Юрьевич Ершов

Институт высокомолекулярных соединений РАН

Email: ershov305@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2266-4380
SPIN-код: 2997-1043

д.х.н.

Россия, Санкт-Петербург

Александр Алексеевич Мартыненков

Институт высокомолекулярных соединений РАН

Email: martynenkoff@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-0951-1451
SPIN-код: 1736-1306

к.х.н.

Россия, Санкт-Петербург

Игорь Викторович Лагода

Государственный научно-исследовательский испытательный институт военной медицины

Email: lagodai@peterstar.ru
ORCID iD: 0000-0002-3906-2909
SPIN-код: 2791-1103

к.х.н.

Россия, Санкт-Петербург

Александра Максимовна Волкова

Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

Email: saaashavolkovaaa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2516-2095
SPIN-код: 4378-3029
Россия, Рязань

Список литературы

Дополнительные файлы