Сукцинат и сукцинатдегидрогеназа моно-ядерных лейкоцитов крови как маркеры адаптации митохондрий к гипоксии у больных при обострении хронической об-структивной болезни легких
- Авторы: Бельских Э.С.1, Урясьев О.М.1, Звягина В.И.1, Фалетрова С.В.1
-
Учреждения:
- ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
- Выпуск: Том 28, № 1 (2020)
- Страницы: 13-20
- Раздел: Оригинальные исследования
- Статья получена: 25.06.2019
- Статья одобрена: 13.01.2020
- Статья опубликована: 09.04.2020
- URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/14376
- DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ202028113-20
- ID: 14376
Цитировать
Аннотация
Цель. Изучить концентрацию сукцината и активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) мононуклеарных лейкоцитов крови как маркеров быстрой адаптации митохондрий к гипоксии у пациентов при обострении хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
Материалы и методы. В исследование было включено 58 пациентов с ХОБЛ и 13 условно здоровых добровольцев 40-75 лет. В соответствии с принципами комплексной оценки GOLD 2018 пациенты были разделены на группы B (n=18), C (n=20), D (n=20), сопоставимые по возрасту, уровню ОФВ1 и индексу пачко-лет. Больные группы D отличались более выраженной гипоксемией. В выделенных из крови мононуклеарных лейкоцитах определяли активность СДГ и концентрацию сукцината.
Результаты. Больные с обострением ХОБЛ, разделенные на группы в соответствии с частотой обострений и выраженностью симптомов, характеризовались различной тяжестью нарушений функций митохондрий моноядерных лейкоцитов. Больные группы С имели наибольшую концентрацию сукцината (428 [357;545] нмоль / 106 клеток 1 мл суспензии) и активность СДГ (64[56;73] нмоль сукцината / мин * 106 клеток 1 мл суспензии) в моноядерных лейкоцитах по сравнению с группами B (снижение сукцината в 1,43 раза, p=0,002; снижение СДГ в 1,88 раза p=0,0015) и D (снижение сукцината в 2,06 раза, p<0,0001; снижение СДГ в 4,26 раза, p<0,0001). Больные группы D демонстрировали наиболее выраженное снижение маркеров адаптации к гипоксии.
Выводы. Малое количество симптомов при обострении у больных ХОБЛ связано с наибольшими показателями механизма быстрой адаптации митохондрий мононуклеарных лейкоцитов к гипоксии. Наличие у пациентов выраженных симптомов и частых обострений связано с наиболее тяжелым нарушением механизмов адаптации митохондрий к гипоксии.
Ключевые слова
Полный текст
Установлено, что больные хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) с выраженными бронхобструктивными нарушениями способны адаптироваться к дыхательной недостаточности, что приводит к уменьшению жалоб на одышку и, в свою очередь, может оказывать влияние на результаты оценки тяжести заболевания [1, 2]. Наличие непосредственной связи между дыхательной недостаточностью и нарушением процессов тканевого дыхания, связанного с функционированием митохондрий, позволяет предположить, что одним из потенциальных маркеров адаптации больных с ХОБЛ может стать определение показателей функциональной активности митохондрий [3-5]. Активное изучение роли вторичной митохондриальной дисфункции при ХОБЛ позволило установить её системный характер, что позволяет фиксировать нарушения функций митохондрий не только в клетках тканей легких, но и других органов, например в мышцах, клетках крови [5-8]. Поэтому большой интерес представляет изучение показателей адаптации к гипоксии митохондрий клеток периферической крови, которые наиболее доступны для исследования в рутинной клинической практике [9-11].
Для функционирования митохондрий в условиях гипоксемии, характерной для обострения ХОБЛ, большое значение имеют процессы быстрой адаптации митохондрий, связанные с аккумуляцией внутриклеточного сукцината и повышением активности II комплекса дыхательной цепи митохондрий, которые ранее были установлены для нейронов [12]. Срыв этих адаптивных механизмов связан с образованием избытка активных форм кислорода, развитием окислительного стресса и повреждением клеток [12].
Изменения функционирования митохондрий связанные с развитием дыхательной недостаточности у больных с ХОБЛ можно зафиксировать в лейкоцитах периферического кровотока. Исследование показателей функционирования митохондрий клеток крови в группах, выделенных с помощью комбинированной оценки ХОБЛ, позволит установить значение механизма быстрой адаптации к гипоксии митохондрий для развития клинических проявлений ХОБЛ.
Таким образом, целью данного исследования стало изучение концентрации сукцината и активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в моноядерных лейкоцитах крови как маркеров механизма быстрой адаптации митохондрий к гипоксии у больных с обострением ХОБЛ.
Материалы и методы
Проведённое исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол №2 от 7.10.2016) и соответствует требованиям Надлежащей Клинической Практики (GCP) и Хельсинской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования».
В текущее пилотное исследование было включено 58 пациентов с ХОБЛ и 13 условно здоровых добровольцев в возрасте от 40 до 75 лет. Минимальный размер выборки рассчитывали с учетом ранее проведенных исследований и использованием калькулятора Open Epi со статистическими допущениями альфа-ошибки 5 и 95% доверительным интервалом (ДИ), с учетом снижения концентрации сукцината лейкоцитов крови, по меньшей мере, на 25% для 98% пациентов с ХОБЛ [11]. В группу больных с ХОБЛ включались пациенты проходившие лечение в ГБУ РО ОКБ (г. Рязань) и обратившиеся к пульмонологу ГБУ РО поликлиники №6 (г. Рязань) по поводу обострения заболевания.
Критериями включения в группу больных ХОБЛ служили подписанное Информированное согласие, возраст от 40 до 75 лет, исходный постбронходилатационный показатель ОФВ1/ФЖЕЛ ≤0,7. Для контрольной группы, включавшей здоровых добровольцев, критериями включения служили: подписанное Информированное согласие, возраст от 40 до 75 лет, отсутствие документированных хронических заболеваний легких и сердечно-сосудистой системы в анамнезе.
Критериями исключения для всех групп служили хирургические вмешательства на легких в анамнезе, злоупотребление алкоголем и наркотиками, пациенты с легочными заболеваниями, отличными от ХОБЛ и хронического бронхита, или имеющие значимые воспалительные заболевания, другие хронические заболевания внутренних органов в фазе декомпенсации, моноцитоз в результатах общего анализа крови. С помощью спирометра MicroLab (Micro Medical, Великобритания) на второй день госпитализации всем пациентам проводилось определение функции внешнего дыхания, включавшее определение объема форсированного выдоха за одну секунду (ОФВ1). Пульсоксиметрию проводили с использованием Spirotel SpO2 (Medical International Research, Италия). Клинико-функциональные и демографические характеристики исследуемых групп представлены в таблице 1.
Таблица 1
Клинико-функциональные и демографические характеристики исследуемых групп
Показатель | ХОБЛ, n=58 | Контроль, n=13 |
Возраст, лет | 67 [61;71] | 54 [50;63], p=0,088 |
Пол: мужской, n женский, n |
48 9 |
5 8 |
Курение: курильщики, n экс-курильщики, n не курившие ранее, n |
34 24 0 |
0 0 13 |
ОФВ1, % | 48 [38;61] | 92 [91;93], p<0,0001 |
SpO2, % | 92 [89;93] | 97 [97;98], p<0,0001 |
Примечание: ОФВ1 – отношение измеренного ОФВ1 к рассчитанной должной величине, принятой за 100%; SpO2 – сатурация кислорода крови
В рамках общеклинического обследования выполнялась комбинированная оценка ХОБЛ с учетом данных об обострениях ХОБЛ в анамнезе и результатами заполнения опросников Modified Medical Research Council Dyspnea Scale (mMRC) и The COPD Assessment Test (CAT) [2]. Больные с ХОБЛ, разделенные на группы B, C, D были сопоставимы по уровню ОФВ1, индексу пачко-лет и SpO2 (табл. 2).
Таблица 2
Клинико-функциональные характеристики исследуемых групп больных ХОБЛ разделенных в соответствии с выраженностью симптомов и частотой обострений
Показатель | Группа B, n=18 (1) | Группа C, n=20 (2) | Группа D, n=20 (3) |
Индекс пачко-лет | 25 [20;30] | 25 [20;30] | 22 [20;28] |
ОФВ1, % | 48 [38;63] | 55 [39;62] | 45 [40;58] |
SpO2, % | 92 [91;93] | 92 [91;94] | 91 [87;93], p1-3=0,02, p2-3=0,003 |
mMRC, балл | 2 [1;4] | 1 [1;1], p1-2=0,0001 | 3 [2;5], p2-3<0,0001 |
CAT, балл | 19 [12;31] | 8 [6;9], p1-2<0,0001 | 28 [12;34], p2-3<0,0001 |
Примечание: ОФВ1 – отношение измеренного ОФВ1 к рассчитанной должной величине, принятой за 100%; SpO2 – сатурация кислорода крови
Забор крови осуществлялся утром натощак на второй день госпитализации путём венепункции с помощью вакуумных систем для забора крови из кубитального доступа с помощью пробирок, содержащих гепарин натрия, разделительный гель и раствор фиколла для создания градиента плотности (BD Vacutainer CPT, США).
После центрифугирования крови в пробирках BD CPT при 1600 G в течение 16 минут мононуклеарные лейкоциты отделяли от плазмы путем центрифугирования при 3000 оборотах в мин в течение 10 мин. Полученные клетки отмывали 0,9% NaCl с последующим центрифугирование при 3000 оборотах в мин в течение 5 мин троекратно.
Выделенные мононуклеарные лейкоциты ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды, получая суспензию. В 20 мкл суспензии подсчитывали количество клеток, окрашенных раствором метиленового синего в камере Горяева с последующим их перерасчетом на объем суспензии. После завершения подсчета клеток к 1 мл суспензии добавляли детергент (10 мкл Triton X-100) и замораживали её.
После разморозки суспензию использовали для определения показателей окислительного стресса, концентрации янтарной кислоты и активности ферментов с последующим пересчетом показателей на 106 клеток/мл суспензии.
Активность СДГ определяли фотометрически по реакции восстановления гексацианоферрата (III) калия [12]. Концентрацию сукцината определяли с помощью набора Succinate Colorimetric Assay Kit (Sigma-Aldrich, США).
Сбор и обработка данных осуществлялась с использованием программы Office Excel 2016 (Microsoft Corporation, США), статистическая обработка результатов проводилась с использованием Statistica 10.0. (Stat Soft Inc., США). Соответствие выборок нормальному распределению проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Так как распределение в выборках носило характер отличный, от нормального применялся критерий Манна-Уитни для попарного сравнения, при множественном сравнении использовали критерий Краскела-Уоллиса и критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми считали отличия при вероятности нулевой гипотезы об отсутствии различий p<0,05.
Результаты и их обсуждение
В соответствии с результатами, представленными в таблице 3, у больных с ХОБЛ при обострении заболевания наблюдалось значительное снижение активности СДГ и уменьшение концентрации янтарной кислоты в суспензии моноядерных лейкоцитах периферической крови (табл. 3). Дан-ные изменения указывали, вероятно, на увеличение доли клеток в исследуемой суспензии, которые были подвержены вторичной митохондриальной дисфункции, в свою очередь создающей предпосылки к развитию окислительного стресса и нарушению функционирования мононуклеарных лейкоцитов периферической крови.
Таблица 3
Исследование показателей функционирования митохондрий моноядерных лейкоцитов у больных с обострением ХОБЛ и контрольной группы
Исследуемые показатели | ХОБЛ, n=58 | Контроль, n=13 |
Активность СДГ, нмоль сукцината / мин * 106клеток 1 мл суспензии | 34 [19;56] | 94 [88;95], снижение в 2,76 раз, p<0,0001 |
Концентрация сукцината, нмоль / 106клеток 1 мл суспензии | 319 [215;407] | 731 [679;768], снижение в 2,29 раз, p<0,0001 |
При сравнении показателей больных с ХОБЛ, выделенных в соответствии с уровнем симптомов и частотой обострений, было установлено, что они статистически значимо отличались друг от друга по исследуемым маркерам адаптации митохондрий к гипоксии. При этом больные группы С, характеризовавшиеся минимальной выраженностью симптомов, отличались наибольшей активностью СДГ и концентрацией сукцината в суспензии мононуклеарных лейкоцитов, что, возможно, отражало сохранность механизмов быстрой адаптации к гипоксии в большей части клеток.
У больных групп B и D, у которых отмечалось большое количество симптомов, наблюдалось значительное снижение активности СДГ и уменьшение концентрации сукцината в моноядерных лейкоцитах по сравнению с показателями группы больных С. При этом наиболее низкая активность СДГ отмечалась в группе больных D, отличавшейся наиболее выраженной гипоксемией. Это демонстрировало, вероятно, срыв адаптационного механизма у данной группы больных вследствие повреждения митохондрий на фоне выраженной гипоксемии (табл. 4). Ранее было установлено, что более высокий уровень сукцината плазмы у больных с ХОБЛ стабильного течения связан с более выраженным утолщением стенки бронхов, определяемым с помощью компьютерной томографии высокого разрешения. При этом данная группа больных отличалась большим улучшением спирометрических показателей и результатов опросника SGRQ на фоне терапии ингаляционными глюкокортикоидами ответ по сравнению с группой пациентов, имевших эмфизему без утолщения бронхиальной стенки и статистически значимо меньшую концентрацию сукцината в плазме [15].
Анализ связи между исследуемыми показателями позволил выявить сильную отрицательную корреляцию между маркерами адаптации митохондрий к гипоксии и выраженностью симптомов больных с ХОБЛ (табл. 5). При этом была выявлена достоверная положительная связь между активностью СДГ и концентрацией сукцината с одной стороны и функциональными показателями (ОФВ1, SpO2) больных с другой. Стаж курения, определяемый по показателю пачко-лет, характеризовался отрицательной связью умеренной силы.
Таким образом, сукцинат-опосредо-ванный механизм быстрой адаптации митохондрий к гипоксии, вероятно, играет важную роль в адаптации больных ХОБЛ к дыхательной недостаточности при обострении заболевания. В связи с этим исследование активности СДГ и концентрации сукцината в мононуклеарных лейкоцитах может по-служить дополнительным способом оценки адаптации пациентов с ХОБЛ к гипоксии.
Таблица 4
Исследование показателей функционирования митохондрий в мононуклеарных лейкоцитах крови больных ХОБЛ разделенных в зависимости от уровня симптомов и частоты обострений
Исследуемые показатели | ХОБЛ, B (1) n=18 | ХОБЛ, C (2) n=20 | ХОБЛ, D (3) n=20 |
Активность СДГ, нмоль сукцината/ мин* 106клеток 1 мл суспензии | 34 [25;48] ↓1-2 в 1,88 раз p1-2=0,0015; ↑1-3 в 2,26 раз p1-3=0,0019 | 64 [56;73] ↑2-3 в 4,26 раз p2-3<0,0001 | 15 [11;20] |
Концентрация сукцината, нмоль на / 106клеток 1 мл суспензии | 299 [216;365] ↓1-2 в 1,43 раз p1-2=0,002 | 428 [357;545] ↑2-3 в 2,06 раз p2-3<0,0001 | 208 [157;276] |
Таблица 5
Корреляционный анализ связи между показателями адаптации митохондрий мононуклеарных лейкоцитов к гипоксии и основными клинико-функциональными показателями больных с ХОБЛ
Ранговые корреляции Спирмена R (p<0,05) | mMRC, баллы | CAT, баллы | ОФВ1, % | SpO2, % | Индекс пачко-лет |
Активность СДГ, нмоль сукцината / мин * 106клеток 1 мл суспензии | -0,8380 | -0,8586 | 0,7039 | 0,7433 | -0,4277 |
Концентрация сукцината, нмоль / 106клеток 1 мл суспензии | -0,8129 | -0,8062 | 0,7070 | 0,7350 | -0,5100 |
Выводы
- Малое количество симптомов при обострении у больных хронической обструктивной болезнью легких связано с наибольшими показателями механизма быстрой адаптации митохондрий мононуклеарных лейкоцитов к гипоксии.
- Наличие у пациентов выраженных симптомов и частых обострений сопровождалось наиболее тяжелым нарушением механизмов адаптации митохондрий к гипоксии.
Дополнительная информация [Additional Info]
Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках реализации внутривузовского гранта ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России № 2/17 «Исследование митохондриальной дисфункции лимфоцитов крови у больных хронической обструктивной болезнью легких как возможного предиктора тяжести заболевания».
[Finanсing of study. The study was carried out within the framework of the intra-University grant of Ryazan State Medical University №2/17 «Research of mitochondrial dysfunction of blood lymphocytes in patients with chronic obstructive pulmonary disease as a possible predictor of the severity of the disease».]
Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить в связи с публикацией данной статьи.
[Conflict of interests. The authors declare no actual and potential conflict of interests which should be stated in connection with publication of the article]
Благодарности. Авторы выражают благодарность коллективу пульмонологического отделения ГБУ РО ОКБ г. Рязань за помощь в проведении исследования.
[Acknowledgements. The authors express their gratitude to the staff of the Pulmonology Department of the Ryazan Regional Clinical Hospital for their assistance in conducting the study.]
Участие авторов. Урясьев О.М. – концепция и дизайн исследования, редактирование, Бельских Э.С., Фалетрова С.В. – набор материала, статистическая обработка и анализ данных, написание текста, Звягина В.И. – выполнение лабораторных исследований, анализ результатов, написание текста.
[Participation of authors. O.M. Uryasiev – concept and design of the study, editing, E.S. Belskikh, S.V. Faletrova – set of material, statistical processing and analysis of data, writing the text, V.I. Zvyagina – performing laboratory research, analysis of results, writing the text.]
Об авторах
Эдуард Сергеевич Бельских
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Автор, ответственный за переписку.
Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1803-0542
SPIN-код: 9350-9360
Scopus Author ID: 57195313786
ResearcherId: A-7202-2019
аспирант кафедры факультетской терапии с курсом терапии ФДПО
Россия, РязаньОлег Михайлович Урясьев
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8693-4696
SPIN-код: 7903-4609
ResearcherId: S-6270-2016
д.м.н., проф., зав. кафедрой факультетской терапии с курсом терапии
Россия, РязаньВалентина Ивановна Звягина
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2800-5789
SPIN-код: 7553-8641
к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики болезней ФДПО
Россия, РязаньСветлана Васильевна Фалетрова
ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России
Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1532-0827
SPIN-код: 1427-8316
ассистент кафедры факультетской терапии с курсом терапии ФДПО
Россия, РязаньСписок литературы
- Барабанова Е.Н. GOLD 2017: что и почему изменилось в глобальной стратегии лечения хронической об-структивной болезни легких? // Пульмонология. 2017. Т. 27, №2. С. 274-282. doi: 10.18093/0869-0189-2017-27-2-274-282
- Низов А.А., Ермачкова А.Н., Абросимов В.Н., и др. Комплексная оценка степени тяжести ХОБЛ на амбула-торно-поликлиническом приеме // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2019. Т. 27, №1. С. 59-65. doi: 10.23888/PAVLOVJ201927159-65
- Nam H.S., Izumchenko E., Dasgupta S., et al. Mitochondria in chronic obstructive pulmonary disease and lung can-cer: where are we now? // Biomarkers in Medicine. 2017. Vol. 11, №6. P. 475-489. doi: 10.2217/bmm-2016-0373
- Agrawal A., Mabalirajan U. Rejuvenating cellular respiration for optimizing respiratory function: targeting mito-chondria // American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 2016. Vol. 310, №2. P. 103-113. doi: 10.1152/aj-plung.00320.2015
- Lerner C.A., Sundar I.K., Rahman I. Mitochondrial redox system, dynamics, and dysfunction in lung inflammaging and COPD // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 2016. Vol. 81, Pt. B. P. 294-306. doi: 10.1016/j.biocel.2016.07.026
- Ли Л.А., Лебедько О.А., Козлов В.К. Оценка дисфункции митохондрий при внебольничной пневмонии у детей // Дальневосточный медицинский журнал. 2015. №2. С. 30-36.
- Singh S., Verma S.K., Kumar S., et al. Evaluation of Oxidative Stress and Antioxidant Status in Chronic Obstructive Pulmonary Disease // Scandinavian Journal of Immunology. 2017. Vol. 85, №2. P. 130-137. doi: 10.1111/sji.12498
- Лобанова Е.Г., Кондратьева Е.В., Минеева Е.Е., и др. Мембранный потенциал митохондрий тромбоцитов у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких // Клиническая лабораторная диагностика. 2014. Т. 59, №6. С. 13-16.
- Денисенко Ю.К., Новгородцева Т.П., Виткина Т.И., и др. К вопросу о митохондриальной дисфункции при хронической обструктивной болезни легких // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. 2016. №60. С. 28-33. doi: 10.12737/20048
- Lukyanova L.D., Kirova Y.I. Mitochondria-controlled signaling mechanisms of brain protection in hypoxia // Fron-tiers in Neuroscience. 2015. Vol. 9. P. 320. doi: 10.3389/fnins.2015.00320
- Бельских Э.С., Урясьев О.М., Звягина В.И., и др. Исследование окислительного стресса и функции митохон-дрий в мононуклеарных лейкоцитах крови у больных с хроническим бронхитом и с хронической обструк-тивной болезнью легких // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2018. Т. 6, №2. С. 203-210. doi: 10.23888/HMJ201862203-210
- Методы биохимических исследований: (Липидный и энергетический обмен). Л.: Издательство ЛГУ; 1982.