Сукцинат и сукцинатдегидрогеназа моно-ядерных лейкоцитов крови как маркеры адаптации митохондрий к гипоксии у больных при обострении хронической об-структивной болезни легких

Полный текст

Установлено, что больные хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) с выраженными бронхобструктивными нарушениями способны адаптироваться к дыхательной недостаточности, что приводит к уменьшению жалоб на одышку и, в свою очередь, может оказывать влияние на результаты оценки тяжести заболевания [1, 2]. Наличие непосредственной связи между дыхательной недостаточностью и нарушением процессов тканевого дыхания, связанного с функционированием митохондрий, позволяет предположить, что одним из потенциальных маркеров адаптации больных с ХОБЛ может стать определение показателей функциональной активности митохондрий [3-5]. Активное изучение роли вторичной митохондриальной дисфункции при ХОБЛ позволило установить её системный характер, что позволяет фиксировать нарушения функций митохондрий не только в клетках тканей легких, но и других органов, например в мышцах, клетках крови [5-8]. Поэтому большой интерес представляет изучение показателей адаптации к гипоксии митохондрий клеток периферической крови, которые наиболее доступны для исследования в рутинной клинической практике [9-11].

Для функционирования митохондрий в условиях гипоксемии, характерной для обострения ХОБЛ, большое значение имеют процессы быстрой адаптации митохондрий, связанные с аккумуляцией внутриклеточного сукцината и повышением активности II комплекса дыхательной цепи митохондрий, которые ранее были установлены для нейронов [12]. Срыв этих адаптивных механизмов связан с образованием избытка активных форм кислорода, развитием окислительного стресса и повреждением клеток [12].

Изменения функционирования митохондрий связанные с развитием дыхательной недостаточности у больных с ХОБЛ можно зафиксировать в лейкоцитах периферического кровотока. Исследование показателей функционирования митохондрий клеток крови в группах, выделенных с помощью комбинированной оценки ХОБЛ, позволит установить значение механизма быстрой адаптации к гипоксии митохондрий для развития клинических проявлений ХОБЛ.

Таким образом, целью данного исследования стало изучение концентрации сукцината и активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) в моноядерных лейкоцитах крови как маркеров механизма быстрой адаптации митохондрий к гипоксии у больных с обострением ХОБЛ.

Материалы и методы

Проведённое исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (протокол №2 от 7.10.2016) и соответствует требованиям Надлежащей Клинической Практики (GCP) и Хельсинской декларации Всемирной Медицинской Ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования».

В текущее пилотное исследование было включено 58 пациентов с ХОБЛ и 13 условно здоровых добровольцев в возрасте от 40 до 75 лет. Минимальный размер выборки рассчитывали с учетом ранее проведенных исследований и использованием калькулятора Open Epi со статистическими допущениями альфа-ошибки 5 и 95% доверительным интервалом (ДИ), с учетом снижения концентрации сукцината лейкоцитов крови, по меньшей мере, на 25% для 98% пациентов с ХОБЛ [11]. В группу больных с ХОБЛ включались пациенты проходившие лечение в ГБУ РО ОКБ (г. Рязань) и обратившиеся к пульмонологу ГБУ РО поликлиники №6 (г. Рязань) по поводу обострения заболевания.

Критериями включения в группу больных ХОБЛ служили подписанное Информированное согласие, возраст от 40 до 75 лет, исходный постбронходилатационный показатель ОФВ₁/ФЖЕЛ ≤0,7. Для контрольной группы, включавшей здоровых добровольцев, критериями включения служили: подписанное Информированное согласие, возраст от 40 до 75 лет, отсутствие документированных хронических заболеваний легких и сердечно-сосудистой системы в анамнезе.

Критериями исключения для всех групп служили хирургические вмешательства на легких в анамнезе, злоупотребление алкоголем и наркотиками, пациенты с легочными заболеваниями, отличными от ХОБЛ и хронического бронхита, или имеющие значимые воспалительные заболевания, другие хронические заболевания внутренних органов в фазе декомпенсации, моноцитоз в результатах общего анализа крови. С помощью спирометра MicroLab (Micro Medical, Великобритания) на второй день госпитализации всем пациентам проводилось определение функции внешнего дыхания, включавшее определение объема форсированного выдоха за одну секунду (ОФВ₁). Пульсоксиметрию проводили с использованием Spirotel SpO₂ (Medical International Research, Италия). Клинико-функциональные и демографические характеристики исследуемых групп представлены в таблице 1.

 

Таблица 1

Клинико-функциональные и демографические характеристики исследуемых групп

Показатель	ХОБЛ, n=58	Контроль, n=13
Возраст, лет	67 [61;71]	54 [50;63], p=0,088
Пол: мужской, n женский, n	48 9	5 8
Курение: курильщики, n экс-курильщики, n не курившие ранее, n	34 24 0	0 0 13
ОФВ1, %	48 [38;61]	92 [91;93], p<0,0001
SpO2, %	92 [89;93]	97 [97;98], p<0,0001

Примечание: ОФВ₁ – отношение измеренного ОФВ₁ к рассчитанной должной величине, принятой за 100%; SpO₂ – сатурация кислорода крови

 

 В рамках общеклинического обследования выполнялась комбинированная оценка ХОБЛ с учетом данных об обострениях ХОБЛ в анамнезе и результатами заполнения опросников Modified Medical Research Council Dyspnea Scale (mMRC) и The COPD Assessment Test (CAT) [2]. Больные с ХОБЛ, разделенные на группы B, C, D были сопоставимы по уровню ОФВ₁, индексу пачко-лет и SpO₂ (табл. 2).

 

Таблица 2

Клинико-функциональные характеристики исследуемых групп больных ХОБЛ разделенных в соответствии с выраженностью симптомов и частотой обострений

Показатель	Группа B, n=18 (1)	Группа C, n=20 (2)	Группа D, n=20 (3)
Индекс пачко-лет	25 [20;30]	25 [20;30]	22 [20;28]
ОФВ1, %	48 [38;63]	55 [39;62]	45 [40;58]
SpO2, %	92 [91;93]	92 [91;94]	91 [87;93], p1-3=0,02, p2-3=0,003
mMRC, балл	2 [1;4]	1 [1;1], p1-2=0,0001	3 [2;5], p2-3<0,0001
CAT, балл	19 [12;31]	8 [6;9], p1-2<0,0001	28 [12;34], p2-3<0,0001

Примечание: ОФВ₁ – отношение измеренного ОФВ₁ к рассчитанной должной величине, принятой за 100%; SpO₂ – сатурация кислорода крови

 

 Забор крови осуществлялся утром натощак на второй день госпитализации путём венепункции с помощью вакуумных систем для забора крови из кубитального доступа с помощью пробирок, содержащих гепарин натрия, разделительный гель и раствор фиколла для создания градиента плотности (BD Vacutainer CPT, США).

После центрифугирования крови в пробирках BD CPT при 1600 G в течение 16 минут мононуклеарные лейкоциты отделяли от плазмы путем центрифугирования при 3000 оборотах в мин в течение 10 мин. Полученные клетки отмывали 0,9% NaCl с последующим центрифугирование при 3000 оборотах в мин в течение 5 мин троекратно.

Выделенные мононуклеарные лейкоциты ресуспендировали в 1 мл дистиллированной воды, получая суспензию. В 20 мкл суспензии подсчитывали количество клеток, окрашенных раствором метиленового синего в камере Горяева с последующим их перерасчетом на объем суспензии. После завершения подсчета клеток к 1 мл суспензии добавляли детергент (10 мкл Triton X-100) и замораживали её.

После разморозки суспензию использовали для определения показателей окислительного стресса, концентрации янтарной кислоты и активности ферментов с последующим пересчетом показателей на 10⁶ клеток/мл суспензии.

Активность СДГ определяли фотометрически по реакции восстановления гексацианоферрата (III) калия [12]. Концентрацию сукцината определяли с помощью набора Succinate Colorimetric Assay Kit (Sigma-Aldrich, США).

Сбор и обработка данных осуществлялась с использованием программы Office Excel 2016 (Microsoft Corporation, США), статистическая обработка результатов проводилась с использованием Statistica 10.0. (Stat Soft Inc., США). Соответствие выборок нормальному распределению проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Так как распределение в выборках носило характер отличный, от нормального применялся критерий Манна-Уитни для попарного сравнения, при множественном сравнении использовали критерий Краскела-Уоллиса и критерий Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Статистически значимыми считали отличия при вероятности нулевой гипотезы об отсутствии различий p<0,05.

Результаты и их обсуждение

В соответствии с результатами, представленными в таблице 3, у больных с ХОБЛ при обострении заболевания наблюдалось значительное снижение активности СДГ и уменьшение концентрации янтарной кислоты в суспензии моноядерных лейкоцитах периферической крови (табл. 3). Дан-ные изменения указывали, вероятно, на увеличение доли клеток в исследуемой суспензии, которые были подвержены вторичной митохондриальной дисфункции, в свою очередь создающей предпосылки к развитию окислительного стресса и нарушению функционирования мононуклеарных лейкоцитов периферической крови.

 Таблица 3

Исследование показателей функционирования митохондрий моноядерных лейкоцитов у больных с обострением ХОБЛ и контрольной группы

Исследуемые показатели	ХОБЛ, n=58	Контроль, n=13
Активность СДГ, нмоль сукцината / мин * 106клеток 1 мл суспензии	34 [19;56]	94 [88;95], снижение в 2,76 раз, p<0,0001
Концентрация сукцината, нмоль / 106клеток 1 мл суспензии	319 [215;407]	731 [679;768], снижение в 2,29 раз, p<0,0001

 

 При сравнении показателей больных с ХОБЛ, выделенных в соответствии с уровнем симптомов и частотой обострений, было установлено, что они статистически значимо отличались друг от друга по исследуемым маркерам адаптации митохондрий к гипоксии. При этом больные группы С, характеризовавшиеся минимальной выраженностью симптомов, отличались наибольшей активностью СДГ и концентрацией сукцината в суспензии мононуклеарных лейкоцитов, что, возможно, отражало сохранность механизмов быстрой адаптации к гипоксии в большей части клеток.

У больных групп B и D, у которых отмечалось большое количество симптомов, наблюдалось значительное снижение активности СДГ и уменьшение концентрации сукцината в моноядерных лейкоцитах по сравнению с показателями группы больных С. При этом наиболее низкая активность СДГ отмечалась в группе больных D, отличавшейся наиболее выраженной гипоксемией. Это демонстрировало, вероятно, срыв адаптационного механизма у данной группы больных вследствие повреждения митохондрий на фоне выраженной гипоксемии (табл. 4). Ранее было установлено, что более высокий уровень сукцината плазмы у больных с ХОБЛ стабильного течения связан с более выраженным утолщением стенки бронхов, определяемым с помощью компьютерной томографии высокого разрешения. При этом данная группа больных отличалась большим улучшением спирометрических показателей и результатов опросника SGRQ на фоне терапии ингаляционными глюкокортикоидами ответ по сравнению с группой пациентов, имевших эмфизему без утолщения бронхиальной стенки и статистически значимо меньшую концентрацию сукцината в плазме [15].

Анализ связи между исследуемыми показателями позволил выявить сильную отрицательную корреляцию между маркерами адаптации митохондрий к гипоксии и выраженностью симптомов больных с ХОБЛ (табл. 5). При этом была выявлена достоверная положительная связь между активностью СДГ и концентрацией сукцината с одной стороны и функциональными показателями (ОФВ₁, SpO2) больных с другой. Стаж курения, определяемый по показателю пачко-лет, характеризовался отрицательной связью умеренной силы.

Таким образом, сукцинат-опосредо-ванный механизм быстрой адаптации митохондрий к гипоксии, вероятно, играет важную роль в адаптации больных ХОБЛ к дыхательной недостаточности при обострении заболевания. В связи с этим исследование активности СДГ и концентрации сукцината в мононуклеарных лейкоцитах может по-служить дополнительным способом оценки адаптации пациентов с ХОБЛ к гипоксии.

 

Таблица 4

Исследование показателей функционирования митохондрий в мононуклеарных лейкоцитах крови больных ХОБЛ разделенных в зависимости от уровня симптомов и частоты обострений

Исследуемые показатели	ХОБЛ, B (1) n=18	ХОБЛ, C (2) n=20	ХОБЛ, D (3) n=20
Активность СДГ, нмоль сукцината/ мин* 106клеток 1 мл суспензии	34 [25;48] ↓1-2 в 1,88 раз p1-2=0,0015; ↑1-3 в 2,26 раз p1-3=0,0019	64 [56;73] ↑2-3 в 4,26 раз p2-3<0,0001	15 [11;20]
Концентрация сукцината, нмоль на / 106клеток 1 мл суспензии	299 [216;365] ↓1-2 в 1,43 раз p1-2=0,002	428 [357;545] ↑2-3 в 2,06 раз p2-3<0,0001	208 [157;276]

 

Таблица 5

Корреляционный анализ связи между показателями адаптации митохондрий мононуклеарных лейкоцитов к гипоксии и основными клинико-функциональными показателями больных с ХОБЛ

Ранговые корреляции Спирмена R (p<0,05)	mMRC, баллы	CAT, баллы	ОФВ1, %	SpO2, %	Индекс пачко-лет
Активность СДГ, нмоль сукцината / мин * 106клеток 1 мл суспензии	-0,8380	-0,8586	0,7039	0,7433	-0,4277
Концентрация сукцината, нмоль / 106клеток 1 мл суспензии	-0,8129	-0,8062	0,7070	0,7350	-0,5100

 

 Выводы

1. Малое количество симптомов при обострении у больных хронической обструктивной болезнью легких связано с наибольшими показателями механизма быстрой адаптации митохондрий мононуклеарных лейкоцитов к гипоксии.
2. Наличие у пациентов выраженных симптомов и частых обострений сопровождалось наиболее тяжелым нарушением механизмов адаптации митохондрий к гипоксии.

Дополнительная информация [Additional Info]

Источник финансирования. Исследование выполнено в рамках реализации внутривузовского гранта ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России № 2/17 «Исследование митохондриальной дисфункции лимфоцитов крови у больных хронической обструктивной болезнью легких как возможного предиктора тяжести заболевания».

[Finanсing of study. The study was carried out within the framework of the intra-University grant of Ryazan State Medical University №2/17 «Research of mitochondrial dysfunction of blood lymphocytes in patients with chronic obstructive pulmonary disease as a possible predictor of the severity of the disease».]

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить в связи с публикацией данной статьи.

[Conflict of interests. The authors declare no actual and potential conflict of interests which should be stated in connection with publication of the article]

Благодарности. Авторы выражают благодарность коллективу пульмонологического отделения ГБУ РО ОКБ г. Рязань за помощь в проведении исследования.

[Acknowledgements. The authors express their gratitude to the staff of the Pulmonology Department of the Ryazan Regional Clinical Hospital for their assistance in conducting the study.]

Участие авторов. Урясьев О.М. – концепция и дизайн исследования, редактирование, Бельских Э.С., Фалетрова С.В. – набор материала, статистическая обработка и анализ данных, написание текста, Звягина В.И. – выполнение лабораторных исследований, анализ результатов, написание текста.

[Participation of authors. O.M. Uryasiev – concept and design of the study, editing, E.S. Belskikh, S.V. Faletrova – set of material, statistical processing and analysis of data, writing the text, V.I. Zvyagina – performing laboratory research, analysis of results, writing the text.]

 

Об авторах

Эдуард Сергеевич Бельских

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1803-0542
SPIN-код: 9350-9360
Scopus Author ID: 57195313786
ResearcherId: A-7202-2019

аспирант кафедры факультетской терапии с курсом терапии ФДПО

Россия, Рязань

Олег Михайлович Урясьев

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8693-4696
SPIN-код: 7903-4609
ResearcherId: S-6270-2016

д.м.н., проф., зав. кафедрой факультетской терапии с курсом терапии

Россия, Рязань

Валентина Ивановна Звягина

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2800-5789
SPIN-код: 7553-8641

к.б.н., доцент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики болезней ФДПО

Россия, Рязань

Светлана Васильевна Фалетрова

ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Email: ed.bels@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1532-0827
SPIN-код: 1427-8316

ассистент кафедры факультетской терапии с курсом терапии ФДПО

Россия, Рязань

Список литературы

Дополнительные файлы