Сравнительная оценка роли липидного обмена и системного воспаления в развитии атеросклероза на животных моделях

Полный текст

Атеросклероз (АС) является глобальной проблемой современного человечества, ассоциирован со снижением продолжительности и качества жизни, экономическим и социальным бременем [1]. При этом, исследование механизмов развития АС до настоящего времени остается актуальной задачей. В непростой истории изучения АС сформировалось несколько парадигм, определяющих современные представления о данном патологическом процессе.

Ключевая роль в его развитии отводится нарушениям липидного обмена, на коррекцию которых во многом направлены основные клинические усилия. Кроме того, результаты многочисленных исследований свидетельствуют о важной роли нарушений иммунного статуса в патогенезе АС. Действительно, макрофаги, являющиеся частью врожденной иммунной системы, вносят весомый вклад в развитие и прогрессирование заболевания, и накопление «пенистых» макрофагов в интиме артерий – необходимое его звено.

Причины инициализации данного процесса являются предметом многочисленных дискуссий, в т.ч. касаются роли коморбидных заболеваний, например хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), поэтому представляют интерес работы, посвященные анализу системного воспаления при ХОБЛ и его участия в патогенезе АС.

Исследования роли системного воспаления, врожденной иммунной системы в патогенезе АС требуют выбора адекватных моделей.

В последние годы улучшилось понимание связей нарушений липидного обмена и врожденного звена иммунной системы в развитии и прогрессировании АС, причем иммунной системе в патогенезе АС на сегодня отводится главенствующая роль. Так, она выступает также связующим звеном в коморбидном течении ХОБЛ и АС.

Считается, что врожденная иммунная система для детекции стандартных молекулярных структур (паттернов), специфичных для больших групп патогенов, в т.ч. вирусов, бактерий, грибов, паразитов и простейших опирается на большое семейство рецепторов распознавания образов (англ.: pattern-recognition receptors, PRR), к числу которых относятся Toll-подобные рецепторы (англ.: Toll-like receptor, TLR) макрофагов. Они представляют собой семейство трансмембранных рецепторов I типа и играют важную роль в инициализации воспаления при АС и ХОБЛ. В соответствии с современными представлениями TLR4, представитель большой группы Toll-подобных рецепторов отвечает за распознавание грамотрицательных бактерий (в частности, липополисахарида (ЛПС) их клеточной стенки) и является механизмом, обеспечивающим специфичность для врожденной иммунной системы. Кроме того, TLR4 могут стимулироваться компонентами табачного дыма и насыщенными жирными кислотами, что подчеркивает их важную роль в патогенезе рассматриваемых заболеваний.

Учитывая значимую роль врожденной иммунной системы в патогенезе АС и ХОБЛ, нельзя не отметить и видоспецифические отличия, которые сформировались из-за различных патогенов, с которыми сталкиваются люди и модельные животные.

Цель – оценка особенностей липидного обмена и системного воспаления при ХОБЛ в развитии атеросклероза на моделях животных.

Материалы и методы

Для реализации поставленной цели был проведен анализ перекрестных связей видоспецифических особенностей липидного обмена и иммунного ответа, а также проведен биоинформационный анализ различий рецептора врожденного иммунитета TLR4 у мышей, крыс и кроликов в сравнении с человеком. Поиск и анализ аминокислотных последовательностей рецептора TLR4 человека, мыши, крысы и кролика выполнен в международной базе данных GenBank Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) и базе The Universal Protein Resource (UniProt).

Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей рецептора проведено в программе Clustal Omega, версия 1.2.4. Clustal – это серия широко используемых компьютерных программ, применяемых в биоинформатике для множественного выравнивания последовательностей. Clustal Omega является одной из наиболее современных версий программы, и позволяет выравнивать множество последовательностей, обладая при этом достаточной эффективностью.

Реконструкция и визуализация молекулярных филогенетических деревьев выполнены с помощью программы MEGA7 по методу ближайших соседей (англ.: Neighbor-Joining, NJ) и методу максимальной экономии (англ.: Maximum Parsimony, MP). MEGA7 – это программное обеспечение молекулярно-эволюционного генетического анализа, которое содержит множество сложных методов и инструментов для филогеномики и филомедицины.

Статистическая поддержка для каждого узла дерева была обеспечена путем выполнения 1000 повторов bootstrap анализа. Для вычисления эволюционных расстояний использовался метод коррекции Пуассона.

Результаты и их обсуждение

Результаты вычислений показали, что наиболее сходной аминокислотной последовательностью TLR4 с таковой у человека обладает кролик (рис. 1). Полученные данные свидетельствуют об идентичности аминокислот TLR4 рецептора человека рецепторам крысы, мыши, и кролика примерно на 67, 68 и 73% соответственно, что может лежать в основе видоспецифических особенностей иммунного ответа. Полученные сведения подтверждаются данными о том, что ответы человека и мыши на активацию TLR имеют некоторые сходства, но также и глубокие различия [2, 3]. Сходство аминокислот между последовательностями TLR4 мыши и человека составляет 62% во внеклеточном домене, 70% в трансмембранном домене и 83% в цитоплазматическом домене, тогда как белки MD-2 мыши и человека имеют сходство аминокислот примерно на 57% [3-6]. Во внеклеточном домене TLR4 крысы и люди имеют общее сходство аминокислот 61% [3, 6]. Указанные различия TLR4 и MD-2 могут лежать в основе видоспецифичного распознавания лигандов.

По сравнению с мышами и крысами TLR4 кролика больше похож на свой человеческий аналог, демонстрируя примерно 70% сходство аминокислот, причем во внеклеточном домене TLR4 дистальная область демонстрирует наибольшее общее сходство (77%, рис. 1) [4, 5, 7]. Поскольку сходство аминокислот, характерное для внеклеточного домена человека, больше у кролика, чем у мыши, TLR4 кролика может распознавать патогены человека лучше, чем TLR4 мыши [3, 6]. Это и большее общее сходство между TLR4 кролика и человека позволяют предположить, что иммунный ответ человека на некоторые патогены может быть лучше смоделирован у кроликов, чем у мышей, что обусловлено большей филогенетической близостью TLR4. Описанные предположения подтверждает реконструкция эволюционной истории TLR4 (рис. 2).

Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей TLR4 человека, мыши, крысы, кролика (белок-содержащий домен TIR). Выполнено в программе CLUSTAL O версия 1.2.4. Таблица идентичности аминокислотных последовательностей построена с использованием инструмента BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool).

Примечания: «*» – идентичные аминокислотные остатки; «:» – очень сходные по физико-химическим свойствам аминокислоты (консервативные замены); «.» – просто сходные по физико-химическим свойствам аминокислоты (полуконсервативные замены); « » (пробел) – отсутствие сходства; «-» – вставки, автоматически добавленные программой для оптимального выравнивания; Max Score – максимальный вес, Query Cover – отражает, какой % длины исходной последовательности выровнялся с находкой, E value – отражает, насколько случайно полученное выравнивание, Ident – процент совпавших аминокислотных остатков

Рис. 2. Филогенетическое дерево TLR4 человека, мыши, крысы, кролика (белок-содержащий домен TIR). Выполнено с использованием метода Neighbor-Joining

Примечания: дерево построено в масштабе, с длинами ветвей в тех же единицах, что и у эволюционных расстояний, используемых для определения филогенетического дерева. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода поправки Пуассона и выражены в единицах количества аминокислотных замен на сайт. В анализе участвовали 4 аминокислотные последовательности. Все позиции, содержащие пробелы и пропущенные данные, были исключены. Эволюционный анализ был проведен в MEGA7

Таким образом, цитоплазматический домен TLR4 гораздо более консервативен, чем внеклеточный домен, что вероятно, обусловлено тем, что его функция заключается в трансдукции сигнала молекулам с консервативными структурами, тогда как внеклеточный домен адаптирован к рецепции структур, определяемых разными экологическими нишами людей и грызунов [6]. Например, люди и кролики проявляют интенсивную реакцию на низкие концентрации ЛПС, тогда как большинство грызунов относительно более устойчивы [5]. Данные отличия следует учитывать так как известно, что компоненты табачного дыма способны активировать TLR4 рецептор и его нисходящие сигнальные пути.

В 2009 г. J. Vasl, et al. сообщили о дополнительных функциональных различиях между человеческим и мышиным компонентом MD-2 рецепторного комплекса CD14/TLR4/MD2, распознающего ЛПС. Различия включают способность человеческого, но не мышиного MD-2 секретироваться и функционировать как внеклеточный эндотоксин-связывающий белок с TLR4 или без него [3, 8].

K. Schroder, et al. описали различия в регуляции генов макрофагов человека и мыши после стимуляции ЛПС [2, 3]. Хотя гены-мишени TLR4 быстрее индуцируются в макрофагах человека, чем в макрофагах мыши, после воздействия ЛПС несколько регуляторов отрицательной обратной связи пути TLR4 индуцируются быстрее и в большей степени в макрофагах мыши. Эта усиленная регуляция отрицательной обратной связи может дополнительно снижать первичный ответ на ЛПС в макрофагах мыши, тем самым способствуя более низкой чувствительности к эндотоксину у мышей по сравнению с людьми. Это явление, называемое толерантностью к ЛПС, в основном связано с потерей поверхностной экспрессии TLR4. Предварительная обработка ЛПС макрофагов мыши подавляет выработку воспалительных цитокинов в зависимости от времени и дозы и значительно снижает активность NF-κB [3]. Так, ЛПС увеличивает экспрессию TLR4 в макрофагах и моноцитах человека, тогда как в перитонеальных макрофагах и нейтрофилах мыши, напротив, экспрессия TLR4 снижается после воздействия ЛПС и остается неизменной в мышиных моноцитах [3].

Известно, что существующие типичные модели животных, используемые в исследованиях АС, помимо описанных отличий имеют ряд недостатков, связанных со значительными различиями липидного обмена как от людей, так и друг от друга, а также его связей с врожденной иммунной системой. Например, мыши очень устойчивы к АС из-за видоспецифических особенностей метаболизма липопротеинов. Так, у человека наиболее распространенным подтипом аполипопротеинов B (ApoB) является AроВ-100, который синтезируется только в печени и является главным компонентом аполипопротеина в липопротеинах очень низкой плотности (ЛПОНП), липопротеинах промежуточной плотности (ЛППП) и липопротеинах низкой плотности (ЛПНП). Изоформа ApoB-48 синтезируется в кишечнике и находится в хиломикронах, обеспечивая перенос липидов из кишечника в мышечную, жировую и другие ткани. Однако, некоторые грызуны, такие как крысы и мыши, могут синтезировать ApoB-48 также в печени, поэтому у мышей большинство (около 70%) всех ЛПНП, продуцируемых в печени, переносят ApoB-48, в отличие от АроВ-100 у человека. АроВ-48, основной компонент кишечных хиломикронов, обладает ускоренным обменом в плазме, по сравнению с белком АроВ-100. Это приводит к более быстрому клиренсу атерогенных ApоВ – содержащих липопротеинов печенью.

Другое отличие липидного метаболизма заключается в том, что у грызунов (мышей и крыс), в отличие от человека, а также приматов, кроликов и хомяков, в плазме крови отсутствует белок CETP (англ.: cholesteryl ester transfer protein), переносящий эфиры холестерина с ЛПВП на содержащие AроВ ЛПНП и ЛПОНП [9, 10]. Следовательно, мыши дикого типа, имеют естественно низкий уровень ЛПНП и высокий ЛПВП, в которых переносится до 90% холестерина и имеют низкую восприимчивость к развитию АС [11, 12]. Трансгенные мыши, экспрессирующие CETP человека, имеют повышенный обратный транспорт холестерина, вероятно, из-за усиленного, зависимого от рецептора ЛПНП, клиренса липопротеинов ApоВ в печени. Они также демонстрируют увеличенную постпрандиальную триглицеридемию, повышенное поглощение печенью ЛПС и повышенную выживаемость при эндотоксемии [13].

Таким образом, участие в липидном гомеостазе не единственная функция CETP. Полученные в последние годы сведения улучшили наше понимание связей CETP с воспалительным ответом. Экспериментальные данные убедительно свидетельствуют о том, что CETP в макрофагах, а также в печени предотвращает взаимодействие ЛПС с TLR4, тем самым уменьшая воспалительную реакцию [14]. Он играет также полезную роль в снижении воспалительного ответа на бактериальные эндотоксины посредством удаления ЛПС. Противовоспалительная функция CETP осуществляется благодаря его принадлежности к семейству белков, включающих липополисахарид-связывающий белок (англ.: lipopolysaccharide binding protein, LBP) и бактерицидный белок, повышающий проницаемость (англ.: bactericidal permeability increasing protein, BPI) [14-17]. CETP имеет структурную гомологию с LBP, который участвует во врожденном иммунном ответе, связываясь с ЛПС, вызывая воспалительный ответ, опосредованный рецептором TLR4, и, в конечном итоге, приводит к активации фактора транскрипции NF-κB [17, 18]. Таким образом, благодаря CETP, ЛПС связывается с циркулирующими ЛПВП, ЛПНП и ЛПОНП, что делает его недоступным для стимуляции врожденной иммунной системы [12, 19-21]. Хотя CETP обладает слабой способностью связывать ЛПС по сравнению с LBP или BPI, он ассоциирован с устойчивостью к сепсису [12, 22]. Мыши, трансгенные по CETP человека, имеют более низкую смертность после введения ЛПС по сравнению с мышами дикого типа [12, 14].

Есть несколько свидетельств, подтверждающих, что ЛПС удаляется из кровотока в основном печенью, хотя точные механизмы остаются неопределенными. Механизм элиминации ЛПС включает участие CETP, облегчающего перенос ЛПС из ЛПВП в ЛПНП [12], и опосредованное ЛПНП-рецептором поглощение ЛПС-ассоциированных липопротеинов печенью [12, 17, 23]. Поглощение печеночными клетками ЛПВП рецептором SR-B1 также участвует в клиренсе ЛПС [12]. Клетки Купфера поглощают большую часть свободного ЛПС, а также инактивируют ЛПС путем деацилирования ацилоксиацилгидролазой [17, 24].

CETP снижается как у хомяков, так и у трансгенных по CETP человека мышей в ответ на ЛПС [12]. Это согласуется с результатами небольшого исследования на людях, в котором сообщалось о связи повышенной смертности с величиной снижения CETP у госпитализированных пациентов с сепсисом [12, 14]. Дефицит CETP является генетическим заболеванием, которое приводит к чрезвычайно высокому уровню холестерина ЛПВП. Однако, это не приводит к ожидаемому увеличению продолжительности жизни. Так, ингибитор СЕТР дальцетрапиб повышает уровни ЛПВП, но не снижает риск повторных сердечно-сосудистых событий у пациентов с недавно перенесенным острым коронарным синдромом [25], а торцетрапиб увеличивает инфекционную и онкологическую заболеваемость [17, 26].

Кроме того, грызуны имеют и другие особенности метаболизма липопротеинов: высокий уровень циркулирующих липаз и специфичного белка – переносчика фосфолипидов (англ.: specific phospholipid transfer protein, PLTP), что также объясняет их устойчивость к АС. У мышей, нокаутных по PLTP, наблюдается увеличение смертности, связанной с эндотоксинами, задержка поглощения ЛПС липопротеинами и снижение клиренса ЛПС [12, 27].

Таким образом, мыши и крысы дикого типа являются млекопитающими с преимущественно высоким уровнем ЛПВП, тогда как люди, так и кролики являются млекопитающими с высоким уровнем ЛПНП. Тем не менее, определенные различия между кроликами и людьми с точки зрения метаболизма липопротеинов также существуют.

Известно, что кролики обладают примерно вдвое большей активностью CETP в плазме, чем люди [11, 12], и они очень чувствительны к вызванному диетой АС [12, 28], риск которого снижается путем ингибирования CETP [12, 29]. Учитывая участие CETP во врожденном иммунном ответе, логично предположить отличие в ЛПС стимуляции кроликов от человека. Кроме того, плазма кролика не содержит ApoA-II [30, 31], важного белкового компонента ЛПВП у людей, хотя в геноме кролика существует аналогичный ген ApoA-II, но до сих пор неясно, является ли он действительно функциональным или псевдогеном [31].

АpоА-II является вторым по распространенности белковым компонентом ЛПВП человека и широко представлен также у грызунов, но либо отсутствует, либо экспрессируется на низких уровнях у кроликов [32-34]. У людей, мышей и крыс ApоА-II синтезируется главным образом печенью и в значительно меньшей степени – кишечником [34, 35]. Однако, аминокислотные последовательности мышиного и человеческого ApоА-II различаются примерно на 40%, и они оказывают противоположное влияние на метаболизм липопротеинов при экспрессии у трансгенных мышей [34]. Некоторые исследования предполагают, что повышение уровня ApоА-II может быть проатерогенным за счет снижения обратного транспорта холестерина и уменьшения защиты от окислительной модификации ЛПНП [34, 36]. Однако, эксперименты с экспрессией человеческого ApоА-II у кроликов показали выраженный антиатерогенный эффект, возможный механизм которого может быть объяснен противовоспалительной активностью ApоА-II [37]. Эти данные противоречат известным сведениям о том, что мышиные ApоА-II ЛПВП потенциально могут быть провоспалительными. Указанные различия могут быть обусловлены отличиями в структуре мышиного и человеческого ApоА-II [37]. Роль ApоА-II в атерогенезе может демонстрировать и тот факт, что ЛПВП стимулирует эндотелиальную синтазу оксида азота (англ.: endothelial nitric oxide synthase, eNOS) в культивируемых эндотелиальных клетках. При этом, антитела только против ApоА-I, но не ApоА-II, ингибируют вызванную ЛПВП активацию eNOS. В данной связи можно предположить, что в отличие от ApоА-I, ApоА-II не участвуют в активации eNOS [34].

Следует также отметить, что активность липазы печени кролика примерно в 10 раз ниже, чем активность липазы у крысы [31, 38]. Предполагается, что эти различия ответственны за высокую восприимчивость кроликов быстрому развитию АС на холестериновой диете.

Кроме описанных различий, в плазме человека существует специфический липопротеин, похожий на ЛПНП, называемый липопротеином (а) (Lp (а)), который образуется через дисульфатную связь между ApоВ-100 и Apо (а). Хотя Lp (a) обычно не присутствует в плазме кроликов и мышей, исследования трансгенных мышей показали, что ApoB-100 кролика, но не ApoB-100 мыши [31, 39], могут связываться с Apo (a) человека с образованием Lp (a), которые усиливают развитие АС [31, 40].

Кроме того, рецепторы ЛПОНП, которые участвуют в образовании пенистых клеток, высоко экспрессируются в макрофагах именно кроликов и людей, но не у мышей [31, 41].

Следует отметить отличия в синтезе оксида азота (NO) мышиными и человеческими макрофагами. Известно, что NO, продуцируемый индуцибельной NO-синтазой (англ.: inducible NO-synthase, iNOS; син.: NOS-2), является важным компонентом опосредованной макрофагами иммунной защиты от многочисленных патогенов. Мышиные макрофаги продуцируют NO при стимуляции классическими индукторами iNOS – интерфероном гамма (англ.: interferon gamma, IFN-γ) и ЛПС, тогда как при сходных условиях человеческие макрофаги продуцируют низкие уровни или вообще не образуют NO. Хотя человеческие макрофаги могут экспрессировать мРНК и белок iNOS при активации, вопрос о том, обладают ли они полным механизмом, необходимым для синтеза NO, остается спорным [42, 43]. Теоретически, отсутствие высокой активности синтеза NO in vitro может не коррелировать с данными, полученными in vivo во время воспалительных процессов, т.е. следует осторожно переносить экспериментальные данные, полученные на грызунах [42, 43].

Заключение

Таким образом, липидный обмен и системное воспаление, опосредованное врожденной иммунной системой, участвующее в патогенезе атеросклероза при ХОБЛ, имеют свои видоспецифические особенности, которые необходимо учитывать при анализе результатов исследований.

Дополнительная информация 

 Источник финансирования. Бюджет ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, о которых необходимо сообщить, в связи с публикацией данной статьи.

 Участие авторов. Котляров С.Н. – концепция, сбор и перевод материала, написание текста, редактирование. Котлярова А.А. – сбор и перевод материала, редактирование. 

Об авторах

Станислав Николаевич Котляров

Автор, ответственный за переписку.
Email: SKMR1@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7083-2692
SPIN-код: 3341-9391
ResearcherId: Q-3633-2017

к.м.н., доцент, зав. кафедрой сестринского дела, ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Анна Анатольевна Котлярова

Email: kaa.rz@yandex.ru
SPIN-код: 9353-0139
ResearcherId: K-7882-2018

к.б.н., ассистент кафедры фармакологии с курсом фармации ФДПО, ФГБОУ ВО Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России

Список литературы

Дополнительные файлы

Доп. файлы

Действие

1. JATS XML

Скачать

2. Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей TLR4 человека, мыши, крысы, кролика (белок-содержащий домен TIR). Выполнено в программе CLUSTAL O версия 1.2.4. Таблица идентичности аминокислотных последовательностей построена с использованием инструмента BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool).

Скачать (2MB)

Метаданные

3. Рис. 2. Филогенетическое дерево TLR4 человека, мыши, крысы, кролика (белок-содержащий домен TIR). Выполнено с использованием метода Neighbor-Joining

Скачать (42KB)

Метаданные

4. 注意：该树是按比例绘制的，其分支长度与用于定义系统发育树的进化距离的单位相同。使用泊松校正方法计算进化距离，并以每个位点的氨基酸取代数表示。分析涉及4个氨基酸序列。排除所有包含空格和缺少数据的条目。MEGA7中进行了进化分析 图 2人，小鼠，大鼠，兔子的TLR4的系统发育树（含蛋白质的TIR结构域）。使用Neighbor-Joining方法完成

Скачать (5KB)

Метаданные