Морфофункциональная оценка мышц голени и стопы после аутонейропластики резекционного дефекта большеберцовой порции седалищного нерва взрослых крыс и однократной интраоперационной электронейростимуляции

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АН — аутонейропластика

ИЭС — интраоперационная электростимуляция

TFI — tibial nerve function index (индекс функции большеберцового нерва)

ВВЕДЕНИЕ

Несмотря на способность волокон периферической нервной системы к регенерации и явления нейральной пластичности, повреждения периферических нервов существенно снижают качество жизни пациентов, вызывая длительные расстройства чувствительности и движений. Анатомические перерывы нервов требуют хирургического вмешательства, и если прямое сшивание проксимального и дистального концов пересечённого нерва оказывается невыполнимым, то золотым стандартом восстановительной операции считается аутонейропластика [1].

Полное функциональное восстановление после первичного шва нерва достигается только в 10% случаев [2], а после аутонейропластики хорошие результаты возможны у пациентов не старше 25 лет [3]. Результаты аутопластики нервов нижней конечности хуже, чем верхней конечности [4].

Наряду с совершенствованием методов реконструктивной хирургии нервов, в экспериментах на животных разрабатываются многочисленные молекулярные и биоинженерные стратегии улучшения нейрорегенерации, в т. ч. методы электростимуляции [5]. Особый интерес для клинической практики представляет однократная интраоперационная электростимуляция (ИЭС). При разных видах повреждений нервов тазовой конечности крыс доказано её положительное воздействие на нейрорегенерацию и восстановление функциональных параметров [6].

Влияние ИЭС на результаты пластики дефектов нервов показало неоднозначные результаты. При регенерации нерва сквозь кондуит с коллагеновым гелем репарация нерва и восстановление функции конечности были улучшены в сериях с 10-минутной и 60-минутной ИЭС по сравнению с нестимулированным контролем на протяжении 12 недель эксперимента [7]. В аналогичных опытах с аутопластикой 10-минутная ИЭС выявила достоверную разницу толщины регенерировавших нервных волокон через 6 недель после операции, однако ИЭС не влияла на выраженность атрофии икроножной мышцы [8].

В доступной литературе мы не встретили данных о влиянии однократной ИЭС на состояние мышц голени и стопы в отдалённые сроки после аутопластики седалищного нерва у взрослых крыс.

Цель — изучить морфофункциональные характеристики мышц голени и стопы после аутонейропластики резекционного дефекта большеберцовой порции седалищного нерва взрослых крыс и однократной интраоперационной электронейростимуляции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В условиях операционной 30 лабораторным крысам линии Wistar (мужской пол, возраст 8–15 мес., вес 360–460 г) осуществляли внепроекционный разрез кожи на уровне средней трети бедра для доступа к правому седалищному нерву остро-тупым способом через двуглавую мышцу. При 8-кратном увеличении операционного микроскопа (OPMI-6, Германия) острым сосудистым микрозондом и ножницами для иридэктомии выполняли эпифасцикулярные продольные эпиневротомические разрезы для выделения большеберцовой порции седалищного нерва. После резекции её участка протяжённостью 6 мм осуществляли интерфасцикулярную аутологичную пластику получившегося дефекта с использованием микрохирургического шовного материала калибра 9–0 и 10–0.

16 крыс составили нестимулированный контроль — по окончании аутонейропластики (АН) рану послойно ушивали рассасывающимся шовным материалом калибра 3–0 — серия АН. 14 крысам сразу после АН на проксимальный участок нерва устанавливали электроды. Используя систему электростимуляции периферических нервов «НейСи-3М» (рег. удостоверение № ФСЗ 2011/10004), в течение 40 мин. проводили ИЭС проксимального отрезка нерва монополярными электрическими импульсами прямоугольной формы с амплитудой 0,25 мА, частотой 20 Гц и длительностью 100 мкс, затем рану ушивали — серия АН + ИЭС.

Эксперимент выполнен согласно Европейской Конвенции по защите позвоночных животных, Директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, и СП 2.2.1.3218-14; ГОСТу 33217-2014; ГОСТу 33215-2014. Дизайн исследования одобрен Этическим комитетом учреждения (Протокол № 2 (57) от 17.05.2018). Животные содержались в контролируемых гигиенических условиях, имели доступ к воде и корму. Для наркоза и обезболивания животным вводили внутримышечно 0,8 мг гидрохлорида ксилазина и 0,4 мг тилетамина/золазепама на 100 г массы тела, на правом бедре и голени выстригали шёрстный покров.

Чтобы обеспечить сопоставимость опытных групп по возрасту, в каждый операционный день оперировали пару крыс: одну без стимуляции, другую со стимуляцией, в одной паре восьмимесячных крыс были обе без стимуляции.

Животных выводили из эксперимента через 4 и 6 мес. после операции. Образцы икроножных мышц и фрагменты стоп после фиксации в 10% растворе нейтрального формалина и декальцинации стоп в смеси соляной и муравьиной кислот заливали по стандартной методике в парафин. Поперечные парафиновые срезы (5–7 мкм) икроножных мышц и тотальные срезы фрагментов стоп, сохраняющие топографию и гистоархитектонику мышц, готовили на микротоме НМ 450 (Thermo Scientific, США), окрашивали трехцветным методом по Массону, гематоксилином и эозином. Часть образцов после альдегидно-осмиевой фиксации заключали в аралдит, алмазными ножами на ультрамикротоме Nova LKB (Швеция) изготавливали полутонкие срезы (1 мкм), окрашивали метиленовым синим, азуром II и основным фуксином.

Микроскопию срезов и получение полноцветных цифровых изображений осуществляли с помощью микроскопа AxioScope.A1 и цифровой камеры AxioCam (Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Германия). В программе «ВидеоТесТ Мастер-Морфология, 4.0» при увеличении 400× измеряли средние диаметры мышечных волокон (200–400 волокон у каждого животного). В программе «PhotoFiltre 7» при увеличении 400× с помощью тестовой решетки равноудаленных точек с прозрачными центрами методом точко-счетной объемометрии определяли количественное соотношение (%) мышечных волокон, эндомизия и кровеносных сосудов.

Контроль — 9 взрослых интактных крыс, близких по возрасту к оперированным крысам на момент эвтаназии — 16–18 мес. (в данной группе отсутствуют статистически значимые различия между исследуемыми количественными показателями).

Оценку функционального восстановления конечности проводили через 4 и 6 мес. после операции методом анализа следов-отпечатков лап крыс на пешеходной дорожке (рис. 1) и расчета индекса функции большеберцового нерва (англ.: tibial nerve function index, TFI). TFI = 0 — нормальная функция, TFI = -100 — полная потеря функции. Использовали формулу, модифицированную J. R. Bain, et al. [9]:

TFI = –37,2 (EPL – NPL)/КPL + 104,4 (ЕTS – NTS)/ NTS + 45,6 (EIT – NIT)/NIT – 8,8,

где PL — длина отпечатка стопы от пятки до третьего пальца, TS — расстояние между первым и пятым пальцами, IT — расстояние между вторым и четвертым пальцами, NPL, NTS и NIT — данные неоперированной (контралатеральной) конечности, ЕPL, ЕTS и ЕIT — данные экспериментальной (оперированной) конечности (рис. 1). Для расчета применяли данные ручных измерений параметров в мм.

 

Рис. 1. Следы-отпечатки стоп крыс на пешеходной дорожке: а — серия АН, б — серия АН + ИЭС.

Примечания: PL — расстояние от пятки до третьего пальца, TS — расстояние между первым и пятым пальцами, IT — расстояние между вторым и четвертым пальцами; ЕPL, ЕTS и ЕIT — измерения экспериментальной конечности; NPL, NTS и NIT — неоперированной конечности; АН — аутонейропластика, ИЭС — интраоперационная электростимуляция.

 

Статистическую обработку данных выполняли в компьютерной программе Attestat, версия 9.3.1 (разработчик И. П. Гайдышев, сертификат о регистрации в Роспатенте № 2002611109). Проверку выборок на нормальность распределения значений осуществляли с помощью критерия Колмогорова. Для попарного сравнения групп животных использовали критерии Манна–Уитни и χ². Значения параметров представляли в виде медиан и квартилей Me (Q₁; Q₃). Отличия считали значимыми при р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В икроножных и подошвенных межкостных мышцах оперированных крыс выявлены схожие, связанные с длительным денервационно-реиннервационным процессом, изменения мышечных волокон и соединительнотканных оболочек. В икроножной мышце перимизий и прослойки эндомизия утолщены в сравнении с интактной икроножной мышцей крысы (рис. 2, 3). В части нервных стволиков имеются эпи- и эндоневральные отеки, а также реактивно-деструктивно измененные нервные волокна (рис. 2в).

 

Рис. 2. Икроножная мышца крыс через 4 месяца опыта: а–в — серия АН; г–е — серия АН + ИЭС.

Примечания: поперечные парафиновые срезы, окраска гематоксилином и эозином, увеличение 100× (а, г), окраска трехцветным методом по Массону, увеличение 400× (б, д); поперечные полутонкие срезы, окраска метиленовым синим, азуром II и основным фуксином, увеличение 1000× (в, е).

 

Рис. 3. Икроножная мышца крыс через 6 месяцев опыта: а, г — контроль; б, в — серия АН; д, е — серия АН + ИЭС.

Примечания: поперечные парафиновые срезы, окраска трехцветным методом по Массону, увеличение 400× (а, д); поперечные полутонкие срезы, окраска метиленовым синим, азуром II и основным фуксином, увеличение 400× (б), 1000× (в, г, е).

 

Мышечные волокна икроножных мышц и подошвенных межкостных мышц вариабельны по размерам и формам поперечных профилей: встречались атрофированные и гипертрофированные волокна, часть теряла полигональность, приобретая округлую форму, а часть ангулярную (рис. 2–5), изменения формы чаще регистрировали в подошвенных межкостных мышцах. Реактивно-деструктивные изменения части мышечных волокон включали появление мелких вакуолей, неровных контуров, исчезновение поперечной исчерченности, неравномерное окрашивание (рис. 2в, 2е), смещение ядер к центру (рис. 2б, 2д, 4б, 4в, 5б).

 

Рис. 4. Подошвенная межкостная мышца крыс через 4 месяца опыта: а, б — серия АН; в, г — серия АН + ИЭС.

Примечания: Примечания: поперечные парафиновые срезы, окраска трехцветным методом по Массону (а, в), гематоксилином и эозином (б, г); увеличение 400×.

 

Рис. 5. Подошвенная межкостная мышца крыс через 6 месяцев опыта: а, б — серия АН; в, г — серия АН + ИЭС.

Примечания: поперечные парафиновые срезы, окраска трехцветным методом по Массону (а, в), гематоксилином и эозином (б, г); увеличение 400×.

 

Через 4 мес. отмечены отдельные участки мышц с выраженной атрофией и некробиотическим распадом ряда мышечных волокон, отеками оболочек, повышенным количеством микрососудов, отдельными очагами кровоизлияний, скоплением клеток фибробластического ряда и лимфоцитов. Такие участки (рис. 2а, 4б) более характерны для серии АН и значительно реже обнаруживались в мышцах крыс серии АН + ИЭС.

Через 6 мес. эксперимента в подошвенных межкостных мышцах в обеих сериях прогрессировали признаки фиброзного замещения пучков мышечных волокон (рис. 5а, 5в). Гистоморфометрическое исследование икроножных мышц (табл. 1) показало, что через 4 мес. после аутонейропластики большеберцовой порции седалищного нерва снижение среднего диаметра мышечных волокон по сравнению с контролем более выражено в серии АН на 43% (р < 0,05), а в серии АН + ИЭС на 24% (р < 0,05). Объемная плотность капилляров в серии со стимуляцией превышает контроль и показатели серии АН в два раза (табл. 1), свидетельствуя о лучшем кровоснабжении мышц. Объёмная плотность эндомизия по сравнению с контролем возрастает в обеих сериях (р < 0,05), но в серии АН в 2,2 раза, а в серии АН + ИЭС только в 1,4 раза.

 

Таблица 1. Количественные характеристики икроножных мышц

4 месяца эксперимента		6 месяцев эксперимента		Контроль, n = 9
Серия 1 (АН), n = 8	Серия 2 (АН и ИЭС), n = 7	Серия 1 (АН), n = 8	Серия 2 (АН и ИЭС), n = 7
Диаметр мышечных волокон, Me (Q1; Q3), мкм
28,68 (19,91; 37,68) р1–к = 0,00052* р1–2 = 0,00195*	39,92 (33,24; 46,90) р2–к = 0,00146*	37,22 (29,27; 41,91) р1–к = 0,00053* р1–2 = 0,04914*	41,10 (34,33; 47,15) р2–к = 0,00085*	52,80 (44,20; 60,93)
Объемная плотность кровеносных сосудов, Me (Q1; Q3), %
2 (2; 3) p1–к = 0,023845 р1–2 = 0,004078	4 (3; 5) р2–к = 3,27 × 10-7	2 (1; 3) р1–к = 0,09758 р1–2 = 0,004026	4 (3; 5) р2–к = 0,000017	2 (1; 3)
Объемная плотность эндомизия, Me (Q1; Q3), %
11 (8; 14) р1–к = 7 × 10-9 р1–2 = 2 × 10-9	7 (5; 8) р2–к = 0,015757	6 (5; 11) р1–к = 0,001678 р1–2 = 0,00193	5 (4; 7) р2–к = 0,76819	5 (3; 6)

Примечания: применяли критерий Манна–Уитни; р^к–1 — сравнение контроля и серии 1 (АН); р^к–2 — сравнение контроля и серии 2 (АН и ИЭС); р^1–2 — сравнение серии 1 и серии 2; АН — аутонейропластика; ИЭС — интраоперационная электростимуляция

 

Через 6 мес. после операции средние диаметры мышечных волокон остаются сниженными относительно контроля (табл. 1). Объемная плотность капилляров у стимулированных животных, как и через 4 мес. опыта, превышает контроль и значения нестимулированных в 2 раза. Объёмная плотность эндомизия в икроножной мышце превышает контроль только в серии АН, а у стимулированных животных параметр не отличается от контроля (табл. 1).

Гистоморфометрический анализ подошвенных межкостных мышц показал, что через 4 мес. после операции диаметр мышечных волокон снижен относительно контроля в серии АН на 20,6%, в серии АН + ИЭС на 11,6%, между сериями статистические различия не выявлены (табл. 2). Через 6 мес. после операции в обеих сериях сохранялись сниженные значения данного параметра относительно контроля, у нестимулированных животных значения диаметра мышечных волокон выше (р < 0,05) значений стимулированных крыс (табл. 2), что связано с гипертрофией большей части волокон (рис. 5а, 5б). Объёмная плотность сосудов микроциркуляторного русла в серии АН + ИЭС больше, чем в серии АН только через 4 мес. после операции, через 6 мес. различия по этому параметру статистически незначимы (табл. 2). Объёмная плотность эндомизия через 4 мес. после операции у стимулированных животных уменьшена по сравнению со нестимулированными, а через 6 мес. в обеих сериях параметр существенно увеличивается, превышая контроль более чем в 2 раза (табл. 2).

 

Таблица 2. Количественные характеристики подошвенных межкостных мышц

4 месяца эксперимента		6 месяцев эксперимента		Контроль, n = 9
Серия 1 (АН), n = 8	Серия 2 (АН и ИЭС), n = 7	Серия 1 (АН), n = 8	Серия 2 (АН и ИЭС), n = 7
Диаметр мышечных волокон, Me (Q1; Q3), мкм
17,07 (13,54; 22,87) рк–1 = 2 × 10-10 р1–2 = 0,4532	19,01 (13,81; 24,39) рк–2 = 3 × 10-9	17,01 (11,43; 20,52) рк–1 = 0,0001 р1–2 = 7 × 10-5	14,1 (9,41; 16,79) рк–2 = 0,0001	21,52 (17,13; 25,31)
Объемная плотность кровеносных сосудов, Me (Q1; Q3), %
3,43 (2,02; 5,59) рк–1 = 0,0007 р1–2 = 0,0196	7,35 (5,49; 8,69) pк–2 = 0,3088	6,66 (5,01; 7,51) рк–1 = 0,0266 р1–2 = 0,2234	5,72 (4,06; 6,56) рк–2 = 0,0006	8,18 (6,51; 11,45)
Объемная плотность эндомизия, Me (Q1; Q3), %
28,51 (19,32; 41,58) рк–1 = 0,0009 р1–2 = 0,0121	20,51 (17,99; 29,29) рк–2 = 0,0708	40,68 (30,66; 56,68) рк–1 = 2,01 × 10-5	46,33 (44,25; 54,33) рк–2 = 1,98 × 10-6 р1–2 = 0,3544	18,15 (17,01; 19,79)

Примечания: применяли критерий Манна–Уитни; р^к–1 — сравнение контроля и серии 1 (АН); р^к–2 — сравнение контроля и серии 2 (АН и ИЭС); р^1–2 — сравнение серии 1 и серии 2; АН — аутонейропластика; ИЭС — интраоперационная электростимуляция

 

Анализ следов-отпечатков стоп крыс на пешеходной дорожке выявил значительное нарушение функции оперированных конечностей обеих серий через 4 мес. после аутонейропластики большеберцовой порции седалищного нерва, более выраженное (р = 0,1649) у нестимулированных животных: в серии АН функциональный индекс составил -81,95 ± 15,85, а в серии АН + ИЭС составил -69,19 ± 8,57. Через 6 мес. наблюдения в серии АН + ИЭС функциональный индекс повышается до -47,95 ± 20,76, что расценивается как положительная динамика, и становится достоверно больше (р = 0,0339), чем в серии АН, в которой функциональный индекс оказывается еще более низким, чем через 4 мес., и составляет -93,64 ± 12,51, что свидетельствует о сохранении регресса двигательной функции у нестимулированных животных.

ОБСУЖДЕНИЕ

В большинстве экспериментальных разработок новых способов реконструкции нервов используются либо юные крысы [10], либо очень старые [11]. По данным эпидемиологического анализа повреждений нервов в клинике, средний возраст пострадавших превышает 40 лет, но выделяется два пика — 24 и 56 лет [12]. Периодизация возраста крыс относительно возраста человека детально не изучена, однако известно, что у двенадцатимесячных крыс линии Wistar по сравнению с восьмимесячными снижена антиоксидантная активность крови [13] и выражен метаболический синдром [14]. Для улучшения транслируемости результатов экспериментальных исследований в клиническую практику мы старались учитывать эти данные при определении возрастного состава экспериментальных групп.

Клиническая релевантность исследований регенерации седалищного нерва экспериментальных животных обусловлена его частыми повреждениями во время боевых действий [15] и при эндопротезировании тазобедренного сустава [16, 17].

В нашем исследовании впервые получены доказательства влияния однократной интраоперационной электростимуляции на морфофункциональные характеристики мышц голени и стопы в отдалённые сроки (4 и 6 мес.) после аутопластики резекционного дефекта большеберцовой порции седалищного нерва. Установлено, что в икроножной мышце стимулированных животных по сравнению с нестимулированными менее выражена атрофия мышечных волокон и фиброз эндомизия, эффект опосредован усилением васкуляризации. Наиболее клинически значимый результат, полученный в данном исследовании, — у стимулированных животных седалищный функциональный индекс улучшен по сравнению с нестимулированными вплоть до 6 мес. после операции, несмотря на то что в это время многие животные либо приближаются к возрасту связанной со старением саркопении, либо даже превышают его. Известно, что у крыс линии Wistar снижение массы мышц голени, дисфункция нейромышечных соединений, нарушения походки и изменения численно-размерного состава мышечных волокон выявляются уже в восемнадцатимесячном возрасте [18], причём у людей в мышцах голени выявляются аналогичные изменения [19].

Седалищный функциональный индекс зависит от состояния мышц не только голени, но и стопы. В подошвенных межкостных мышцах через 4 мес. после операции объёмная плотность кровеносных сосудов у стимулированных животных, также как и в икроножной мышце, достоверно больше, чем у нестимулированных, но диаметры мышечных волокон и объёмная плотность эндомизия сопоставимы. Через 6 мес. после операции в обеих сериях прогрессирует фиброз эндомизия. Однако в серии с электростимуляцией миопатически измененные мышечные волокна встречались реже.

Прогрессирование фиброза эндомизия межкостных подошвенных мышц через 6 мес. после операции, вероятно, связано с развитием возрастной саркопении. По данным других авторов, у взрослых крыс по сравнению с юными снижен уровень экспрессии нейральной молекулы межклеточной адгезии NCAM1 и повышен уровень белка Gadd45α, регулирующего биогенез митохондрий и дифференцировку преадипоцитов, что документирует связанную с взрослением денервацию подошвенных мышц [20], однако доказано, что высокоинтенсивные упражнения предотвращают связанную с возрастом денервационную атрофию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Однократная интраоперационная электростимуляция позволяет уменьшить связанные с повреждением нерва и взрослением денервационные изменения икроножных и межкостных подошвенных мышц, а также улучшить большеберцовый функциональный индекс в отдалённые сроки после аутонейропластики.

Авторы считают актуальными дальнейшие поиски новых способов повышения эффективности результатов аутонейропластики дефектов периферических нервов. Перспективны дальнейшие разработки комплекса реабилитационных мероприятий, направленные на улучшение морфофункциональных параметров мышц стопы и результатов аутонейропластики.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Финансирование. Работа поддержана программой Министерства здравоохранения Российской Федерации в рамках государственного задания ФГБУ «НМИЦ ТО им. акад. Г. А. Илизарова» Минздрава России для выполнения НИР (номер в ЕГИСУ НИОКТР 021062800186-1) на 2021–2023 гг.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов: Щудло Н. А. — руководство проектом, научное обоснование, методология, проведение исследования, написание текста, редактирование; Варсегова Т. Н. — проведение исследования, анализ данных, написание текста; Ступина Т. А. — проведение исследования, анализ данных, написание текста; Кубрак Н. В. — проведение исследования, анализ данных. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Об авторах

Наталья Анатольевна Щудло

Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г. А. Илизарова

Email: nshchudlo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9914-8563
SPIN-код: 3795-4250
ResearcherId: H-5588-2018

д.м.н.

Россия, Курган

Татьяна Николаевна Варсегова

Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г. А. Илизарова

Автор, ответственный за переписку.
Email: varstn@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5430-2045
SPIN-код: 1974-8274

к.б.н.

Россия, Курган

Татьяна Анатольевна Ступина

Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г. А. Илизарова

Email: stupinasta@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3434-0372
SPIN-код: 7598-4540
ResearcherId: O-4352-2018

д.б.н.

Россия, Курган

Надежда Владимировна Кубрак

Национальный медицинский исследовательский центр травматологии и ортопедии имени академика Г. А. Илизарова

Email: kubrak2@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-7494-8342
SPIN-код: 7310-3380
Россия, Курган

Список литературы

Дополнительные файлы