Молекулярные механизмы противомикробной защитной стратегии бактериальной клетки

Полный текст

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБР — антибиотикорезистентность

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

CRISPR-Cas — clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR-associated proteins (CRISPR-связанные белки)

sRNA — small untranslated ribonucleic acid (малые некодирующие рибонуклеиновые кислоты)

АКТУАЛЬНОСТЬ

Антибиотикам по праву принадлежит ведущее место среди самых перспективных классов фармацевтических препаратов и важнейших достижений в медицине, ознаменовавших начало «золотой эпохи» с момента открытия в 1928 г. пенициллина А. Флеммингом [1, 2]. Бесконтрольное и необоснованное использование на сегодняшний день антибактериальных препаратов в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве спровоцировало активизацию защитных механизмов бактериальных штаммов и, как следствие, увеличение разнообразия антибиотикорезистентных возбудителей, повлекших за собой высокий уровень заболеваемости и смертности [1, 3, 4].

К числу патогенов с чрезвычайно высокой резистентностью и проявлением вирулентных свойств отнесены возбудители инфекционных заболеваний человека и животных — Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, бактерии семейства Enterobacteriaceae и др. [5, 6].

По опубликованным данным Всемирной организации здравоохранения за 2019 г., смертность от инфекций, вызванных антибиотикорезистентными штаммами, составила 700 тыс. человек. По прогнозам на 2050 г., данный показатель возрастет до 20 млн, с экономическими потерями более чем в 2,9 трлн долларов [1].

Решение проблемы антибиотикорезистентности (АБР) и продолжающегося распространения штаммов с множественной лекарственной устойчивостью является стратегической задачей практического здравоохранения. Для совершенствования антимикробной фармакотерапии наряду с активным поиском новых эффективных лекарственных соединений необходимо детальное изучение первопричины возникновения и влияния внеклеточной среды на молекулярные механизмы устойчивости бактерий к химиопрепаратам [3, 7].

Цель — проанализировать литературу, посвященную молекулярным механизмам противомикробной защитной стратегии бактериальной клетки от воздействия лекарственных средств и перспективным стратегиям борьбы с антибиотикоустойчивыми возбудителями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проводился поиск полнотекстовых статей на русском и английском языках, опубликованных в период 2018–2022 гг. в базах PubMed, eLibrary, Europe PMC, WoS, CyberLeninka. Изначально проводили скрининг названия и резюме потенциальных исследований, в случае недостаточной информативности изучался полный текст статьи. Проанализировано 100 источников литературы, из них в обзор вошло 44. Полученные данные структурировали по направлениям: основные механизмы антибактериальной устойчивости, факторы окружающей среды, влияющие на развитие и распространение АБР, стратегии борьбы с антибиотикоустойчивыми возбудителями. К приоритетным публикациям относили исследования генетических, эволюционных и экологических аспектов возникновения защитных механизмов бактерий.

Основные механизмы антибактериальной устойчивости

Некоторые микроорганизмы обладают лекарственной устойчивостью изначально (природная), у других же она развивается из-за случайных мутаций (приобретенная) [8]. На сегодняшний момент известно, что в основе механизмов антибактериальной устойчивости лежат:

1) принцип активирования эффлюксных помп и выведения антибиотика из микробной клетки, который обуславливает возникновение полирезистентных штаммов у многих видов микроорганизмов [9]. Так, например, обнаруженные у B. subtilis Bmr эффлюксные помпы блокируют воздействие хлорамфеникола, пуромицина, бромида этидия, родамина и тетрафенилфосфона. У S. aureus наиболее изучены эффлюксные помпы QacA и QacB, состоящие из 514 аминокислотных остатков с массой 55 кДа и экструдирующие одновалентные и двухвалентные катионные препараты, диамидины и бигуанидины [9];

2) видоизменение структуры лекарственных препаратов. Примером данной стратегии устойчивости является способность патогенных штаммов K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa к гидролизу бета-лактамных антибиотиков ферментами микробной клетки бета-лактамазами [9];

3) модификация альтернативной молекулы-мишени для антибактериальных агентов, которая наиболее часто связана с мутациями рибосом и нарушением их функционирования, например метилирование 23S pРНК у актиномицетов-продуцентов авиламицина опосредовано тремя генами, кодирующими метилтрансферазу [2, 7, 10].

Препараты бета-лактамного ряда. Более подробно стоит рассмотреть препараты бета-лактамного ряда (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, монобактамы и др.) — одни из самых эффективных, малотоксичных и зарекомендовавших себя классов антибиотиков. Ежегодные расходы на данную группу препаратов насчитывают более 15 млрд долларов, что составляет 65% всего фармацевтического рынка [11, 12]. Именно при применении бета-лактамов столк-нулись с тревожным феноменом устойчивости к антибиотикам, что связано со стремительной эволюцией собственных бета-лактамаз микроорганизмов [13]. Выявлено около 2000 бета-лактамазных ферментов молекулярного класса А, большинство из которых обнаружены в различных бактериях родов и отрядов Bacillus, Clostridium, Nocardia, Nocardiopsis, Staphylococcus, Enterococcus и Streptomyces, Bacteroidetes, Bacteroidales, Chitinophagales, Cytophagales, Flavobacteriales и Sphingobacteriales и принадлежат к определенным функциональным типам: TEM, CTX-M, KPC и CARBA [14].

Собственные механизмы защиты микобактерий от воздействия лекарственных средств также включают ферментативную бета-лактамазную активность. Бета-лактамазы класса А (BlaC и Bla Mab), продуцируемые микобактериальными возбудителями (M. tuberculosis, M. abscessus, M. fortuitum), обладают расширенным спектром действия (бета-лактамазы расширенного спектра), деградируют цефалоспорины и менее чувствительны к клавулановой кислоте [14]. Геном M. tuberculosis содержит участки, кодирующие бета-лактамазу, а также синтезирующие белковую молекулу-мишень MfpA, которая обеспечивает защиту микобактерий от воздействия хинолонов за счет связывания дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) гиразы с антибиотиком, что приводит к понижению его концентрации [14].

Продуцирование бета-лактамаз грамотрицательными возбудителями инфекций мочевыводящих путей K. pneumoniae и E. coli вызывает резистентность к пенициллинам, цефалоспоринам и монобактам, что значительно осложняет терапевтический эффект [15]. Кроме того, ферменты способствуют развитию устойчивости к другим классам противомикробных препаратов — фторхинолонам, ко-тримоксазолу и аминогликозидам.

Специфические защитные белки. Значительную роль в развитии антибиотикорезистентности исследователи отводят способности бактериальных клеток вырабатывать специфические защитные белки, например рибосомные белки Tet(S), Tet(T), Tet(Q), TetB(P), Tet(W), Tet(O), Tet(M) и OtrA у некоторых грам-положительных и грамотрицательных микроорганизмов [7, 16]. В настоящее время среди известных 13 видов белков, блокирующих связывание рибосом с антибиотиками тетрациклинового ряда, наиболее подробно изучены Tet(O) и Tet(M). Впервые растворимые цитоплазматические белки были выявлены у бактерий семейства Streptococcus и Campylobacter jejuni, тогда как гены, кодирующие данные белки, обнаружены и у многих других микроорганизмов [16].

Микробные биопленки. Способность формировать биопленки является не только способом сохранения жизнеспособности микроорганизмов в различных биотопах, но и еще одним успешным механизмом сопротивления воздействию антибактериальных агентов. Биопленки представляют собой консорциум родственных и неродственных специализированных бактериальных клеток, адгезированных к поверхности или друг к другу, контактирующих между собой и погруженных в продуцируемый ими внеклеточный слизистый матрикс из полимерных соединений. Феномен биопленкообразования, открытый в конце ХХ в., характерен для многих микробных видов и рассматривается как важный фактор патогенности [17–21].

Известно, что развитие бактериальных биопленок как одного из вариантов противомикробной защиты характерно примерно для 70% инфекционных возбудителей [17, 22]. Наибольшая склонность к формированию биопленок выявлена у следующих бактериальных штаммов: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., P. aeruginosa, H. influenzae, M. catarrhalis, E. coli [22].

Исследования показывают, что устойчивость к антибактериальным агентам в полимикробных биопленках намного выше, чем в неродственных сообществах биопленок [21, 23]. Взаимодействия между микробными представителями различных физиологических групп в биопленке определяют общую резистентность популяции к противомикробным препаратам [23].

Защитные механизмы микробных биопленок чрезвычайно сложны и мало изучены, однако известно, что слизистый матрикс препятствует диффузии антибиотиков к бактериальным клеткам, а уменьшение поступления кислорода и питательных веществ изменяет метаболическую активность, стимулируя появление персистирующих форм микроорганизмов, менее восприимчивых к лекарственным препаратам [21]. Биопленка выполняет функцию физического барьера в виде многочисленных анионных и катионных молекул белков, гликопротеинов и гликолипидов, связывающих противомикробные агенты [21]. Существует мнение, что ограниченный доступ антибиотиков в матрикс биопленки «включает» процессы адаптивного иммунитета, способствуя появлению фенотипического разнообразия более толерантных микробных клеток [23]. К следующей причине низкой эффективности антибиотиков в структуре биопленок можно отнести аккумуляцию ферментов, деградирующих антибактериальные препараты. Показано, что в биопленках P. aeruginosa накапливаются бета-лактамазы, усиливающие гидролиз имипенема и цефтазидима. Активность бета-лактамаз K. pneumoniaе не позволяет ампициллину достигнуть глубоких слоев матрикса биопленок [21].

Еще одним фактором устойчивости биопленок является внеклеточная ДНК, которая, будучи анионной молекулой, хелатирует катионы, снижая концентрацию ионов магния во внешней мембране, и активирует двукомпонентные регуляторные системы PhoPQ и PmrAB у родов Pseudomonas и Salmonella, ответственные за сопротивляемость к антимикробным препаратам [18, 21]. Основные механизмы антибактериальной устойчивости представлены на рисунке 1.

 

Рис. 1. Основные механизмы антибактериальной устойчивости.

 

Факторы окружающей среды, влияющие на развитие и распространение АБР

Результаты многочисленных исследований подчеркивают потенциально важную роль окружающей среды как источника возникновения и распространения мультирезистентных патогенов, что связано с возникновением адаптированных толерантных штаммов и может отразиться на функционировании естественных бактериальных популяций, вовлеченных в биогеохимические процессы [24, 25]. Доказано, что гены АБР появились изначально именно в окружающей среде, поскольку многие микроорганизмы сами продуцируют антибиотики, ингибируя рост конкурентных штаммов, а также выполняют сигнальную функцию для межклеточной коммуникации в микробных сообществах [26].

Эволюционное происхождение генов АБР. Биомасса микроорганизмов на Земном шаре, достигающая нескольких тысяч биллионов клеток, представляет собой колоссальный генофонд для мутаций, горизонтального переноса и дрейфа генов [26]. Оказалось, что гены устойчивости обнаружены в микробных сообществах экосистем, даже не подвергавшихся никакому антропогенному вмешательству, например в отдаленных пещерах и в зоне вечной мерзлоты [3]. Данные филогенетических исследований свидетельствуют о появлении β-лактамаз класса А у прокариотов еще миллиарды лет назад, что доказывает древнее происхождение генов АБР. Представлены данные, что гены устойчивости изначально могли участвовать в метаболических процессах, не связанных с антибиотиками [27].

В то же время малоизученными остаются эволюционные и экологические процессы, ведущие к мобилизации, репликации и клиническим проявлениям бактериального ответа [26]. Патогены, защищаясь от действия антимикробных агентов, могут подключать одновременно несколько стратегий устойчивости, что приводит к появлению новых адаптированных штаммов [5].

Физиологические особенности бактерий. В то же время появление новых факторов резистентности лимитируется определенными энергетическими затратами бактериального организма, т. к. под угрозой могут оказаться другие клеточные функции [26]. Появившиеся гены устойчивости развиваются в условиях жесткой конкуренции, претерпевают строгий отбор и распространяются между различными видами патогенов [9, 26]. Таким образом, в бактериальных популяциях закрепляются новые конкурентоспособные генетические детерминанты, повышающие лекарственную устойчивость микробных клеток и способность к выживанию при повышении концентраций антибиотика. Подобные процессы естественного отбора сохраняют экологический «пул» генов АБР и лишь косвенно влияют на их окончательное формирование, поскольку не активируют мобилизацию факторов жизнеспособности. Несмотря на непрерывное возникновение все более новых и активизацию уже существующих защитных стратегий, лишь немногие генетические детерминанты устойчивости закрепляются в бактериальных популяциях. Потенциальную угрозу для здоровья несут патогенные виды с выраженным генетическим полиморфизмом и пластичным метаболизмом [9, 26].

Существенное влияние на распространение как известных, так и новых генов резистентности оказывает горизонтальный перенос генов, передающий факторы устойчивости от конкретной клетки за пределы бактериальной популяции [9, 26].

Мобильные генетические элементы. Совершенствование молекулярно-генетических подходов выявило приоритетную роль мобильных генетических элементов (плазмиды, транспозоны, интегроны) в возникновении устойчивости к антибиотикам, адаптации к новым экологическим нишам и абиотическим условиям, кодировании выгодных метаболических путей и факторов патогенности [27–31]. Мобильные генетические элементы также позволяют бактериям ассимилировать новые источники углерода и формировать устойчивые споры [32].

Наиболее вероятен обмен генами устойчивости между филогенетически родственными сапрофитными и патогенными микроорганизмами, населяющими один и тот же биотоп, даже в короткий промежуток времени [19, 20]. С другой стороны, доказан перенос генов антибиотикорезистентности между представителями разных таксонов: C. perfringens, S. pneumoniae, E. faecalis и Bacteroides [26]. Кроме того, обнаруженный кодируемый плазмидами ген qnrA у различных видов семейства Enterobacteriaceae, вероятно, перенесен от морских и пресноводных водорослей Shewanella, что подтверждает водный путь передачи генов, развивающих лекарственную устойчи-вость [27].

По мнению авторов, обитающие в почве условно-патогенные микроорганизмы B. cepacia, O. intermedium и S. maltophilia могут быть реципиентами генов устойчивости для бактерий, ассоциированных с человеческой микрофлорой, переносить их в обратном направлении и являться возбудителями инфекций [26].

Известно, что возбудители внутрибольничных инфекций, принадлежащие родам Acinetobacter, Burkholderia, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Stenotrophomonas или Serratia, в природе обычно являются симбионтами растений [26].

Стратегии борьбы с антибиотикоустойчивыми возбудителями

Дефензины. Четкое понимание формирования механизмов АБР позволяет разработать перспективные стратегии борьбы с устойчивыми штаммами. Наряду с широкомасштабными исследованиями реактивности патогенной микробиоты на воздействие лекарственных средств необходимы принципиально новые подходы к борьбе с антибиотикоустойчивыми возбудителями, в т. ч. поиск способов запустить синтез собственных катионных пептидов иммунной системы — дефензинов в комбинации с введением «обычных» антибиотиков. Дефензины представляют собой катионные антимикробные пептиды с молекулярной массой 3,5–4,5 кДа, обладающие противомикробной активностью в отношении большого числа грамположительных и грамотрицательных бактерий, грибов и вирусов. Например, дефензины HNP 1-3 и RTD-1 обладают бактерицидным действием против метициллин-резистентного S. aureus и P. aeruginosa [33].

Синтез новых антибактериальных препаратов с использованием математического моделирования. В современном мире назрела необходимость разработки инновационных антибактериальных препаратов. Одним из перспективных направлений создания таких препаратов является использование синтетических малых некодирующих RNA (англ. small untranslated RNA, sRNA) и гидовых CRISPR Cas ассоциированных RNA, которые, в свою очередь, нацелены на инактивацию эпидемически значимых в настоящее время генетических детерминант АБР. Данное методологическое направление позволяет одновременно программировать инактивацию нескольких мишеней, что повышает степень эффективности новых антибактериальных препаратов. Кроме того, результаты, полученные в ходе изучения sRNA и систем CRISPR Cas, позволяют рассматривать их в качестве новых классов антимикробных препаратов, которые открывают возможности не только для лечения инфекций, вызванных MDR патогенами, но и для изучения микробных консорциумов и контроля промышленных ферментаций [34]. Важным подходом к преодолению проблемы АБР является вопрос о возможности изменения схем применения таргетных препаратов, прогнозирования и управления распространением резистентности. Наиболее удобным инструментом в данном направлении является математическое моделирование, которое необходимо для количественного понимания действия мультитаргетной терапии. Например, построена и валидирована математическая модель прогнозирования развития бактериальной резистентности, основанная на зависимости между уровнем резистентности и объёмом потребления антибиотиков [35]. Кроме того, активно проводятся исследования по разработке новых мультитаргетных лекарственных средств с использованием итеративной модификации, методов молекулярного докинга и искусственных нейронных сетей [36]. Наряду с этим, расширяющиеся знания о молекулярных механизмах врождённых иммунных реакций активно пытаются использовать для разработки новых противомикробных препаратов [36].

Пристальный интерес в разработке инновационных антибактериальных препаратов вызывает синтез новых пиримидиновых соединений с потенциальной противомикробной и антимикобактериальной активностью. Рядом публикаций доказано бактерицидное действие производных пиримидина на S. aureus, K. pneumonia, E. coli, A. baumannii, P. aeruginosa [37, 38], M. tuberculosis [38].

Фаговая терапия. Возобновился интерес к фаговой терапии, предусматривающей использование умеренных лизогенных фагов, ассоциированных с человеческими микробными патогенами и содержащих в геноме двухцепочечную или одноцепочечную ДНК, большинство которых относится к отрядам Caudovirales и Microviridae [39]. Механизм действия включает адсорбцию бактериофага на специальных рецепторах, расположенных в клеточных стенках, полисахаридных капсулах, в пилях и жгутиках бактерий. После адсорбции вирус-фаг встраивает свою генетическую информацию в микробную клетку для дальнейшей репликации ДНК. Процесс репликации вызывает лизис возбудителя, синтезированные бактериофаги выходят из клетки, и цикл повторяется. Следует отметить, что бактерио-фаги отличаются специфичностью, они уничтожают определённые патогены, не повреждая остальные микроорганизмы [39].

Синтетическая биология. Активное развитие нового научного направления — синтетической биологии, использующей геномные и метагеномные подходы с целью проектирования и создания биологических систем с заданными свойствами и функциями, направлено на поиск антибактериальных средств природного происхождения [1, 40, 41]. Так, например, в работе О. Н. Синeвой показана антибиотическая активность в отношении грамположительных, грамотрицательных микроорганизмов, дрожжей и редких видов актиномицетов [42].

Фитофармацевтика. Фитофармацевтические препараты на основе растительных экстрактов и эфирных масел, обладающие противомикробными, противовирусными и цитотоксическими свойствами, могут быть перспективными агентами для борьбы с нарастающей резистентностью бактерий [43]. Известны синергетические эффекты эфирного масла розмарина лекарственного (Rosmarinus officnalis) в комбинации с ципрофлоксацином в отношении грамотрицательных возбудителей [44]. В работе P. Knezevic, et al. [44] выявлена антибактериальная активность (0,5–2 мкл/мл) эфирных масел эвкалипта камальдульского (Eucalyptus camaldulensis) в сочетании с ципрофлоксацином, гентамицином и полимиксином В при воздействии на штамм Acinetobacter baumannii с множественной лекарственной устойчивостью. Так как в одном эфирном масле присутствуют различные функциональные группы химических соединений (спиртовая, альдегидная, формальдегидная, карбонильная и др.), вполне вероятно, что антибактериальная активность обусловлена не одним конкретным компонентом и механизмом. Например, эфирные масла вызывают декструкцию мембран бактериальных клеток и инактивируют вирусы, разрушая липидный слой вибрионов [43]. Стратегии борьбы с антибиотикоустойчивыми возбудителями представлены на рисунке 2.

 

Рис. 2. Стратегии борьбы с антибиотикоустойчивыми возбудителями.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Открытие антибиотиков позволило справиться со многими инфекционными заболеваниями и сыграло существенную роль в увеличении продолжительности жизни людей. Ситуация усугубилась из-за появления большого числа резистентных штаммов.

В современных исследованиях тенденция антибиотикорезистентности среди микроорганизмов представляется серьезной эволюционной и экологической проблемой. Бесконтрольное и необоснованное использование на сегодняшний день антибактериальных препаратов в медицине, ветеринарии и сельском хозяйстве спровоцировало активизацию известных к настоящему моменту механизмов защитной стратегии бактериальной клетки (активирование эффлюксных помп, видоизменение структуры лекарственных препаратов, модификация альтернативной молекулы-мишени, микробные биопленки и др.), вызвав усиление адаптивной способности бактериальных патогенов и распространение штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

Объективная оценка эффективности мероприятий, направленных на снижение угрозы здоровью общества, возможна при разработке стратегий подробного генетического и геномного анализа резистентных возбудителей, совершенствование мер по осуществлению контроля за применением лекарственных препаратов и распространением антибиотиков в окружающей среде. Помимо этого, детальные исследования молекулярно-генетической природы устойчивости микроорганизмов к антибиотикам позволят минимизировать возможный риск появления резистентности к новым антибактериальным средствам.

ДОПОЛНИТЕЛЬНО

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства здравоохранения РФ № 056-00113-21-00 в части проведения НИР по теме «Разработка методов диагностики и лечения лепрозной инфекции на основе принципов персонифицированной медицины».

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов: Луценко А. В. — сбор материала, написание текста; Ясенявская А. Л., Самотруева М. А. — редактирование. Авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией).

Об авторах

Анна Викторовна Луценко

Астраханский государственный медицинский университет; Астраханский государственный технический университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: ahrapova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8423-3351
SPIN-код: 3292-9049

к.б.н.

Россия, Астрахань; Астрахань

Анна Леонидовна Ясенявская

Астраханский государственный медицинский университет

Email: yasen_9@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2998-2864
SPIN-код: 5809-5856

д.м.н., доцент

Россия, Астрахань

Марина Александровна Самотруева

Астраханский государственный медицинский университет

Email: ms1506@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5336-4455
SPIN-код: 5918-1341

д.м.н., профессор

Россия, Астрахань

Список литературы

Дополнительные файлы