Дисфункция эндотелия и нарушение тромбоцитарного звена гемостаза при развитии фиброза печени у детей с аутоиммунным гепатитом

Полный текст

Проблема аутоиммунного гепатита (АИГ) является актуальной и социально-значимой в педиатрии. Его частота в популяции европейских стран составляет 0,1-0,9 случаев на 100 000 населения в год, распространённость – 2,2-17 больных на 100 000 жителей. В структуре хронических заболеваний гепатобилиарной системы на долю АИГ приходится 10-20%. При этом, в течение последних двух десятилетий наблюдается заметное увеличение числа аутоиммунных заболеваний печени, в т.ч. у детей [1].

АИГ характеризуется агрессивным течением, особенно в детском возрасте. При отсутствии терапии патологический процесс достаточно быстро трансформируется в цирроз печени, который на момент постановки диагноза регистрируется у 36-78% детей [2]. При 5-10-кратном повышении активности трансаминаз и 2-хкратном повышении уровня γ-глобулинов смертность у взрослых в течение 10 лет может составлять до 90% [3].

Поражение ткани печени влияет на процессы коагуляции, поскольку данный орган играет центральную роль в системе гемостаза, являясь местом синтеза множества факторов свертывания и их ингибиторов, компонентов системы фибринолиза и стимуляторов тромбоцитопоэза. В связи с этим, нарушения данной системы при патологии печени носят комплексный и разнонаправленный характер, часто непредсказуемы и касаются всех звеньев гемостаза, в т.ч. тромбоцитарного [4]. Большая роль в поддержании баланса системы гемостаза принадлежит функциональному состоянию эндотелия. По данным И.А. Кур-киной с соавт. (2014), при хронических заболеваниях печени локальная дисфункция эндотелия может вызвать развитие гиперкоагуляции топически, несмотря на лабораторные признаки системной гипокоагуляции [5]. Получены данные гистологических исследований, доказывающие, что нарушение кровообращения в органе приводит к вторичной печеночной деструкции, усилению фиброзирования и прогрессированию патологического процесса [6].

Эндотелий – активный эндокринный орган, представляющий собой однослойный пласт специализированных клеток, выстилающих изнутри все сердечнососудистое «дерево». Он выполняет барьерную, секреторную, гемостатическую, вазотоническую функции, играет важную роль в процессах воспаления и ремоделирования сосудистой стенки [7]. Прежде всего, нормальный эндотелий действует как мощная антикоагулянтная поверхность, которая не активирует белки свертывания крови и не привлекает к себе клеточные компоненты крови. Но после стимуляции или травмы эндотелий трансформируется в мощную прокоагулянтную поверхность. Это происходит за счет синтеза или выделения многих прокоагулянтных веществ, включая фактор Виллебранда (VWF) и эндотелин-1 [8].

Обнажение субэндотелиальных структур в результате повреждение эндотелиальных клеток приводит к изменению морфологии тромбоцитов и увеличению их адгезивной и агрегационной способности [9]. Тромбоциты выполняют различные функции: 1) запуск немедленного гемостаза за счет адгезии и агрегации, что приводит к формированию тромбоцитарной пробки, 2) местное выделение вазоконстрикторов для уменьшения кровотока в пораженном участке, 3) катализ реакций гуморальной системы свертывания с образованием, в конечном счете, фибринового сгустка, 4) инициирование репарации тканей, 5) регулирование местной воспалительной реакции и иммунитета [8, 10]. Таким образом, активация агрегации тромбоцитов с одной стороны поддерживает воспаление, а с другой – влияет на процессы тромбообразования в сосудистом русле, нарушая тем самым трофику органа и его функцию [11].

Исследования по изучению дисфункции эндотелия и агрегации тромбоцитов при патологии печени в большинстве своем посвящены взрослым пациентам с хроническими вирусным гепатитом и циррозом в их исходе. Научный и клинический интерес обусловлен отсутствием научных публикаций по данной теме у детей при АИГ и циррозе печени в исходе, а также роли этих нарушение в прогрессировании фиброза печени.

Целью работы явилось исследование клинического значения состояния эндотелия и агрегации тромбоцитов при развитии фиброза печени у детей с АИГ.

Материалы и методы

Функциональное состояние эндотелия и тромбоцитарное звено гемостаза было изучено у 35 пациентов 3-17 лет, из них 16 мальчиков, находившихся на лечении в отделении гастроэнтерологии и нарушений обмена веществ Института педиатрии ФГБОУ ВО ПИМУ Минздрава России и 15 условно здоровых детей. Работа выполнена в соответствии с Государственным заданием ФГБОУ ВО ПИМУ Минздрава России на 2017-2019 гг., тема «Разработка методов профилактики, диагностики и лечения заболеваний органов пищеварения у детей в условиях острой и хронической гипоксии».

Все участники исследования были обследованы согласно медицинскому Стандарту специализированной медицинской помощи детям при АИГ. Диагноз АИГ был поставлен после исключения вирусного гепатита, холестатических, аутоиммунных заболеваний печени, болезни Вильсона-Коновалова, гемохроматоза, дефицита α1-антитрипсина, токсических форм гепатита.

Забор крови для выполнения лабораторных тестов выполнялся утром, натощак, путем венепункции локтевой вены. В предшествующие исследованию 30 дней больные не получали препараты, влияющие на гемостаз. В качестве маркеров эндотелиальной дисфункции использовали эндотелин-1 и VWF. Определение концентрации эндотелина-1 в сыворотке крови осуществлялось методом иммуноферментного анализа, с использованием тест системы «Еndothelin 1-21», активности VWF – на анализаторе гемокоагуляции ACL-ТОР 500 (Instrumentation Laboratory Company, USA) с использованием набора фактора фон Виллебранда.

Количество тромбоцитов определяли с помощью гематологического анализатора Cell-Dyn 610 (Abbott Diagnostics, США), агрегационную активность кровяных пластинок – на анализаторе агрегации тромбоцитов, с использованием в качестве индуктора агрегации аденозинфосфата (АТФ) в концентрации 1,25 мг/мл и коллагена – 2,0 мк/мл. В процессе исследования оценивали степень и скорость агрегации тромбоцитов.

Участники исследования были разделены на группы в зависимости от степени выраженности фиброза печени, оценка которого проводилась методом непрямой эластометрии на аппарате «Fibroscan» (Echosens, Франция) с разграничением стадии фиброза по шкале Metavir от F0 до F4 методом магнитно-резонансной томографии (Siemens, 1,5 тесла), методом ультразвукового исследования (Prosond F 75). Шести пациентам была выполнена гепатобиопсия.

В 1-ую группу (n=17) вошли дети со степенью фиброза F 0-2 по Metavir по данным непрямой эластометрии печени на фоне АИГ. Возраст пациентов – 14,0 (11,0; 16,0) лет.

Во 2-ую группу (n=18) вошли дети со степенью фиброза F 3-4 по Metavir по данным непрямой эластометрии печени, у детей этой группы был диагностирован цирроз печени на фоне АИГ. Возраст пациентов – 13,5 (9,0; 15,0) лет.

Контрольную группу (n=15) составили дети, относящиеся к I или II группам здоровьям. Возраст детей контрольной группы – 13,0 (10,0; 15,5) лет. Изучаемые группы были сопоставимы по возрасту и полу.

Исследование одобрено Этическим комитетом ФГБОУ ВО ПИМУ Минздрава России, протокол №16 от 05.12.2017 г. Все участники исследования подписали Информированное согласие.

Для проверки статистических гипотез использовали: U-критерий Манна-Уитни, коэффициент корреляции Спирмена, критерий Фишера. Критическая величина уровня статистической значимости принята равной 0,05. Количественные данные представлены в виде медианы и первого, третьего квартиля (Ме (Q1; Q3)), частоты наблюдения (в %). В скобках указаны абсолютные значения (n). Статистическая обработка данных проводилась с помощью программы Statistica 10.0 (Stat Soft Inc., США).

Результаты и их обсуждение

Среди наблюдаемых детей с АИГ признаки формирования фиброза различной степени (F1-F4 по Metavir) по данным непрямой эластометрии печени были выявлены у ¾ обследованных: фиброз F1 – у 8 (23%) больных, F2 – у 1 (3%), F3 – у 7 (20%), F4 – у 11 (31%). Отсутствие фиброза (F0) было выявлено у 8 (23%) пациентов.

В 1-ую группу вошли пациенты без фиброза и с его начальными проявлениями (F0-F2 по Metavir). У 18 пациентов с фиброзом F3-F4 был диагностирован цирроз печени, у 6 пациентов он был подтвержден гистологически. На этом основании они были объединены во 2-ую группу.

Средний показатель эластичности печени по данным эластометрии в 1-ой группе (F0-F2 по Metavir) составил 6,05 кПа (4,6;7,0), во 2-ой группе (F3-F4 по Metavir) – 14,4 кПа (13,1;21,8 кПа, р<0,001). По данным анамнеза, длительность периода с момента первых клинических проявлений (астеноневротический синдром, синдром желтухи, субфебрилитет, боли в животе) и до постановки диагноза была сопоставимой между 1-ой и 2-ой группами: в 1-ой группе данный период составил 7 (3;15) месяцев, во 2-ой группе – 8 (4;15) месяцев. Важно отметить, что в дебюте заболевания у 16 из 18 (88,9%) детей 2-ой группы жалобы астеноневротического характера были наиболее выражены и характеризовались слабостью, повышенной утомляемостью, лабильностью настроения, беспокойным сном, в то время как в 1-ой группе большинство детей (14 из 17; 82,4%) беспокоила лишь слабость и повышенная утомляемость (р=0,021). Фактически у каждого второго пациента (41,2%) 2-ой группы в дебюте заболевания был выраженный синдром желтухи (сочетание иктеричности кожи, склер, слизистой полости рта, потемнение мочи, светлый стул), в то время как в 1-ой группе данное сочетание симптомов не было отмечено (р=0,014).

При клиническом осмотре «малые печеночные» знаки преобладали во 2-ой группе: пальмарная эритема зафиксирована у всех детей данной группы (100%), «сосудистые» звездочки и выраженная венозная сеть передней брюшной стенки – у 18 из 22 (81,8%) детей, в то время как в 1-ой группе эти изменения были зарегистрированы у 4 из 17 (23,5%) и у 3 из 17 (17,6%) пациентов соответственно (р=0,029 и р=0,025).

По данным лабораторно-инструмен-тального обследования, в 1-ой группе у большинства (11 из 17; 64,7%) детей преобладала минимальная степень биохимической активности (значения трансаминаз не превышали более чем в 3 раза верхнюю границу нормы), в то время как во 2-ой группе у 8 из 18 (44,4%) детей отмечалась умеренная степень активности (значения трансаминаз превышали верхнюю границу нормы в 4-5 раз), а у 4 из 18 (22,2%) пациентов регистрировалась высокая степень биохимической активности (трансаминазы были повышены более чем в 10 раз). Существенно реже в 1-ой группе по сравнению со 2-ой была диагностирована печеночно-клеточная недостаточность – у 4 из 17 (23,5%) и 17 из 18 (94,4%) обследованных соответственно (р=0,045).

Осложнения: гиперспленизм (снижение количества тромбоцитов, лейкоцитов и эритроцитов) и также варикозное расширение вен пищевода, – в 1-ой группе не были диагностированы ни в одном случае. Во 2-ой группе проявления гиперспленизма выявлены у 8 из 18 (44,4%) детей (р=0,014), а варикозное расширение вен пищевода от 1-2 до 3-4 степени – у 11 из 18 (61,1%, р=0,003).

У обследованных 1-ой и 2-ой групп наблюдалось возрастание концентрации маркера эндотелиальной дисфункции – эндотелина-1 – по сравнению с контрольной группой (р=0,04 и р<0,001, соответственно), при этом во 2-ой группе его содержание было достоверно выше, чем в 1-ой (р=0,03, табл. 1). Подобные изменения зафиксированы в отношении еще одного показателя функционального состояния эндотелиальных клеток – VWF: в обеих группах отмечалось возрастание его активности, превышающее значения физиологической нормы (р=0,01 и р<0,001, соответственно), но при этом у пациентов 2-ой группы по сравнению с 1-ой его активность также была значительно выше (р=0,005, табл. 1).

Таким образом, у детей с АИГ дисфункция эндотелия максимально выражена при развитии цирроза печени. Полученные данные были подтверждены положительной корреляционной связью средней степени выраженности между степенью фиброза печени и маркерами дисфункции эндотелия – эндотелином-1 (R=0,356, p=0,004) и VWF (R=0,605, p<0,001).

 

Таблица 1.Показатели функционального состояния эндотелия и агрегации тромбоцитову обследованных детей с аутоиммунным гепатитом

 

У всех пациентов с АИГ выявлено снижение количества тромбоцитов по сравнению с контролем (группа 1 – р=0,002, группа 2 – p<0,001). При этом, содержание мелких кровяных пластинок во 2-ой группе достоверно ниже, чем 1-ой (р=0,003, табл.1). Важно отметить, что снижение содержания тромбоцитов сопровождается увеличением плотности печени по данным непрямой фиброэластометрии (R=-0,5, p=0,003) и повышением маркеров эндотелиальной дисфункции – эндотелина-1 (R=-0,528, p<0,001) VWF(R=-0,501, p<0,001).

Определены положительные корреляционные взаимосвязи умеренной степени между маркерами эндотелиальной дисфункции, тромбоцитами и клиническими особенностями заболевания. Так, значения эндотелина-1 прямо взаимосвязаны с выраженностью в дебюте заболевания астеноневротического синдрома (R=0,362, р=0,03), желтушности кожи (R=0,437, р=0,008) и склер (R=0,385, р=0,02). VWF прямо, а количество тромбоцитов обратно коррелируют с выраженностью сосудистых изменений, возникающих при хронических заболеваниях печени – «сосудистых звездочек» на лице в сочетании с расширением венозной сети на передней брюшной стенке (R=0,486, р=0,004 и R=-0,576, р=0,031 соответственно). Помимо этого, количество тромбоцитов обратно коррелирует с выраженностью таких осложнений патологического процесса, как гиперспленизм (R=-0,567, р=0,001) и варикозное расширение вен пищевода (R=0,363, р=0,048).

Исследование данных агрегации тромбоцитов с АДФ и коллагеном показало, что у детей с АИГ отмечалось увеличение как степени, так и скорости агрегации не зависимо от стадии фиброза печени. Степень агрегации тромбоцитов при индукции АДФ у больных 1-ой и 2-ой групп значимо превышала аналогичный показатель у здоровых детей (р=0,003 и р=0,004 соответственно). Наряду с этим при индукции АДФ была увеличена и скорость агрегации кровяных пластинок в обеих группах по сравнению с контрольными значениями (р=0,008 и р=0,016 соответственно). При использовании в качестве индуктора агрегации тромбоцитов коллагена у пациентов 1-ой и 2-ой групп по сравнению с контролем зарегистрировано аналогичное возрастание и степени (p<0,001 и р=0,021 соответственно), и скорости агрегации (р=0,021 и р=0,04 соответственно, табл. 1). Выраженность агрегации тромбоцитов с АДФ и коллагеном напрямую зависит от активности VWF (табл. 2).

 

Таблица 2.Анализ сопряженности между активностью фактора Виллебранда (VWF)  и показателями агрегации тромбоцитов у обследованных детей (коэффициент Спирмена)

 

Таким образом, согласно результатам проведенного исследования, АИГ у детей характеризуется агрессивным течением. Первые жалобы и клинические проявления зачастую появляются уже на фоне глубокого поражения печени. Достаточно быстро, в среднем за 7-8 месяцев с момента первых клинических проявлений, формируются выраженные нарушения структуры печени, обусловленные разрастанием большого количества соединительной ткани. Лишь у 23% детей отсутствовали признаки фиброза печени, у остальной части пациентов – 77% зафиксированы различные степени фиброза от 1 до 4 по шкале Metavir.

У пациентов с АИГ были установлены лабораторные признаки поражения эндотелия – выявлено повышение в крови высокоспецифичных маркеров эндотелиальной дисфункции – эндотелина-1 и VWF.

Одна из основных функций эндотелия состоит в сбалансированном выделении регуляторных субстанций, определяющих целостную работу системы кровообращения. При «нормальной» функции эндотелия баланс всегда сдвинут в сторону поддержания вазодилатации, ингибиции ангиогенеза, антитромботического, противовоспалительного и антиоксидантного эффекта. При нарушении функции или структуры эндотелия резко меняется спектр выделяемых им биологический активных веществ в виде избыточного синтеза прокоагулянтов: эндотелина-1 и VWF [7, 8]. Высокие концентрации эндотелина-1 способствуют развитию стойкой вазоконстрикции, приводя к развитию ишемии, некрозу тканей, поддержанию воспалительного процесса в органе. В эксперименте доказано, что эндотелин-1 участвует в активации звездчатых клеток, способствуя тем самым повышенному отложению основных компонентов внеклеточного матрикса [12-14]. Согласно литературным данным у взрослых людей с хроническим вирусным гепатитом и декомпенсированным циррозом вирусной этиологии отмечаются повышение значений эндотелина-1 и VWF [15]. Показано, что плазменный уровень VWF может быть повышен более чем в 10 раз при тяжелом циррозе печени у взрослых [16, 17]. Полученные нами данные не противоречат литературным: у детей со сформированным циррозом печени в исходе АИГ, сопровождающегося умеренной и высокой степенью биохимической активности, печеночно-клеточной недостаточностью, гиперспленизмом, варикозным расширением вен пищевода значения маркеров нарушения функции эндотелия были повышены максимально.

Увеличение активности VWF способствует усилению адгезивно-агрегаци-онных свойств тромбоцитов. Он относится к группе ранних тромборегуляторов, т.к. влияет на процесс тромбообразования еще до образования тромбина [18]. Полученные нами положительные корреляционные связи между активностью VWF и показателями агрегации тромбоцитов это подтверждают. У всех обследованных имеет место повышение степени и скорости агрегации при индукции АДФ и коллагеном. Однако, достоверно значимых различий между исследуемыми группами не получено. По-видимому, это связано с тенденцией к снижению количества тромбоцитов в обеих группах. Известно, что образование малых агрегатов при тромбоцитопении может не сказываться на светопропускании суспензии тромбоцитов при исследовании их агрегации, то есть приводит к занижению результатов исследования [19]. Как на начальных стадиях фиброза, так и при сформированном циррозе у детей с аутоиммунным поражением печени количество тромбоцитов имеет тенденцию к снижению по сравнению с контрольной группой. Однако содержание тромбоцитов в нашем исследовании в обеих группах остается в коридоре физиологической нормы. В исследованиях, участниками которых являлись взрослые пациенты с гепатитом и циррозом печени вирусной этиологии, получены аналогичные данные в нарушении сосудисто-тромбоци-тарного гемостаза в виде увеличения агрегации и активации тромбоцитов [20].

Важно отметить, что концентрация эндотелина-1, уровень тромбоцитов, активность VWF имеют важное клиническое значение при АИГ у детей. Согласно результатам нашего исследования, дети, у которых в дебюте заболевания имел место более выраженный астеноневротический синдром и синдром желтухи, в дальнейшем имеют более выраженную дисфункцию эндотелия и более тяжелую форму заболевания, характеризующуюся формированием цирроза печени, гиперспленизмом и варикозным расширением вен пищевода.

Выводы

1. Тяжелая форма аутоиммунного гепатита характеризуется в дебюте заболевания выраженным синдромом желтухи, комплексом жалоб астеноневротического характера, умеренно высокой степенью биохимической активности, печеночно-клеточной недостаточностью, быстрым формированием цирроза печени и осложнений (варикозное расширение вен пищевода, гиперспленизм) на фоне выраженной дисфункции эндотелия.
2. Дисфункция эндотелия (повышение концентрации эндотелина-1 и активности фактора фон Виллебранда) регистрируется у всех детей с аутоиммунным гепатитом и зависит от степени фиброза печени.
3. Изменение функционального состояния тромбоцитарного звена гемостаза (повышение агрегации тромбоцитов) регистрируется у всех детей с аутоиммунным гепатитом и не зависит от степени фиброза печени.

Определение показателей функционального состояния эндотелия (эндотелина-1, фактора фон Виллебранда) и количество тромбоцитов могут быть рекомендованы для оценки тяжести поражения печени при аутоиммунном гепатите у детей.

Об авторах

Екатерина Юрьевна Коновалова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: ekaterinapashkina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1059-6293
SPIN-код: 4437-3176
ResearcherId: H-1099-2018

младший научный сотрудник отдела "клиника гастроэнтерологии и нарушений обмена веществ"

Россия, 603950, БОКС-470, г. Нижний Новгород , пл. Минина и Пожарского, д.10/1

Алла Евгеньевна Лаврова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: lavrova26@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0447-214X
SPIN-код: 1040-2836

доктор медицинских наук, главный научный сотрудник отдела «Клиника гастроэнтерологии и нарушений обмена веществ»

Россия, 603950, БОКС-470, г. Нижний Новгород , пл. Минина и Пожарского, д.10/1

Марина Владимировна Преснякова

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Приволжский исследовательский медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: Presnyakova@list.ru
ORCID iD: 0000-0002-3951-9403
SPIN-код: 2188-3549

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биохимии

Россия, 603950, БОКС-470, г. Нижний Новгород , пл. Минина и Пожарского, д.10/1

Список литературы

Дополнительные файлы