Куриный эмбрион как объект эксперимента для изучения развития сердечно-сосудистой системы

Полный текст

Использование куриных эмбрионов заложило основу для экспериментального изучения физиологии и патологии сердечно-сосудистой системы (ССС). В связи с доступностью, крупными размерами, простотой манипуляций и культивирования куриные эмбрионы служат моделью для изучения закладки, развития и васкуляризации сердца. При этом, ввиду высокой консервативности многих ключевых механизмов раннего онтогенеза, полученные данные могут быть экстраполированы на человека. Этому способствовала разработка методик для in ovo, ex ovo, in vitro исследований биохимии, генетики, физиологии и патологии различных аспектов морфогенеза сердца [1, 2]. Именно на куриных эмбрионах изучались роль клеток эндокарда в закладке коронарных сосудов во время трабекуляции миокарда и механизм образования аорты, а также формирование проэпикарда и эпикарда [3].

Роль проэпикарда в формировании коронарного русла

Современные данные о роли проэпикарда (ПЭ) в формировании коронарного русла основаны на исследованиях, проведенных на куриных эмбрионах. Развитие коронарных сосудов начинается, когда мезотелиальные клетки ПЭ перемещаются из зачатка печени к поверхности сердца, где они дифференцируются в клеточные линии, составляющие различные отделы сердца. У цыплят ПЭ возникает из мезотелиальных клеток, расположенных вдоль каудальной границы перикардиальной полости, которые легко выявляются методами световой микроскопии и хорошо поддаются экспериментальным манипуляциям [4].

Клетки ПЭ, связанные с процессом инициирования трабекуляции мигрируют к сердцу, формируя его внешний слой – эпикард, который интегрируется в стенку миокарда, что приводит к началу формирования коронарной сосудистой сети и увеличению числа фибробластов в стенке миокарда [5]. Неудачное слияние ПЭ с сердцем приводит к формированию дефектов коронарного кровообращения и истончению миокарда [6].

Эксперименты с мечением клеток ПЭ флуоресцентными белками и β-галактози-дазой выявляют окрашенные соответствующим способом гладкие миоциты и эндотелиоциты коронарных артерий у зрелых эмбрионов, что подтверждает гипотезу о формировании коронарных артерий непосредственно из ПЭ [3]. Предотвращение прикрепления клеток ПЭ к сердцу у цыплят препятствует развитию коронарных сосудов. Это также подтверждает необходимость клеток ПЭ для образования коронарных сосудов [7]. Достигнутые успехи в понимании механизмов развития коронарных сосудов, происхождения эндотелиальных клеток сердца, а также уникальные свойства куриных эмбрионов делают их полезной экспериментальной моделью. Когда меченные перепелиные клетки ПЭ пересаживаются в развивающийся куриный эмбрион, они приводят к развитию в сердце цыпленка-реципиента гладкомышечных клеток и фибробластов, при этом, в их коронарных артериях и эндокарде отсутствуют эндотелиальные клетки. Для развития эндотелиоцитов эмбриону-реципиенту требуется, помимо ПЭ клеток, еще и трансплантация печени перепела [8].

При исследовании культур клеток ПЭ, полученных от куриных эмбрионов, выявлен ряд регуляторных механизмов, приводящих эпикардиальный эпителий к эпителиальному мезенхимальному переходу (ЭМП) и клеточной дифференциации, которая необходима для развития коронарных сосудов [9]. В процессе своего развития клетки подвергаются ЭМП, что приводит к изменениям морфологии, полярности и подвижности клетки. Эксперименты на куриных эмбрионах помогли определить функцию хемокинов во время ЭМП в сердце [10].

Эксперименты на эмбрионах способствовали пониманию ключевых механизмов развития сердечного клапана на ранних стадиях морфогенеза и выявили гетерогенность эндокардиальных клеток в эмбриональном сердце. Структурный анализ эмбрионального сердца выявил трансформацию эндокардиальных клеток в богатых матриксом клапанообразующих областях сердца – эндокардиальных подушках [11]. Разработка системы культивирования in vitro для оценки эмбриональной клапанообразующей ткани [12] предоставила возможность четкого описания процесса трансформации эндокардиальных клеток, на основе чего разработана система скрининга и идентификации морфогенов, которые регулируют клеточную трансформацию. В ходе культивирования на коллагеновом геле при использовании определенных областей сердечной трубки, стало возможным выделить заинтересованные типы клеток и изучить механизмы их трансформации в ходе развития клапанов сердца. В большинстве исследований используется область сердечной трубки, которая лежит между общим предсердием и желудочком, так называемая атриовентрикулярная подушка (АВП), где образуются приточные клапаны. Трансформация имплантированной АВП широко изучалась в экспериментах на эмбрионах птиц [13, 14]. Данные эксперименты показали, что эндокард подушек функционально отличается от эндокарда, перекрывающего желудочек [14]. Описание гетерогенности эндокардиальных клеток, при использовании эмбриона, имеет решающее значение для понимания ранних этапов развития клапанов и разработки аналогичных экспериментальных методик у других организмов.

Использование метода эксплантатов in vitro привело к идентификации ключевых регуляторов трансформации эндокардиальных клеток. Классическим примером является идентификация роли трансформирующего фактора роста β (TGFβ) в развитии сердца. Добавление лигандов, нейтрализующих антисывороток или антисмысловых олигонуклеотидов к культуре экспланта позволило выявить специфические лиганды TGFβ и рецепторы, которые регулируют трансформацию эндокардиальных клеток [15]. Значительное совершенствование метода эксплантатов достигнуто благодаря технологии использования вирусных векторов для введения генов в АВП или эндокардиальные клетки желудочка. В первоначальных экспериментах использовали инкубацию эксплантов с культуральной жидкостью, содержащей вирусный вектор для введения генов в эндокардиальные клетки, что зачастую приводило к неэффективному заражению эндокардиальных клеток. Первоначально этот подход был использован для идентификации роли атипичного рецептора TGFβ типа III (TGFβR3) при трансформации эндокардиальных клеток. Более поздние ex ovo модификации этого метода, за счет использования новых способов культивирования [16], позволили проводить манипуляции на эмбрионе вне яйца, благодаря этому раствор, содержащий вирус, мог быть введен непосредственно в просвет сердечной трубки на этапе ее развития до присоединения к сосудистой сети [17]. Инъекция раствора, содержащего аденовирус, приводит к высокоэффективному инфицированию эндокардиальных клеток по всей трубке сердца. Впоследствии в АВП или эксплантах желудочков проводится подсчет количества инфицированных эндокардиальных клеток, которые подверглись трансформации. В экспериментах использовался перенос аденовирусного гена для исследования функции TGFβR3 в эндокардиальных клетках. Сверхэкспрессия этого рецептора в желудочковых эндокардиальных клетках, которые обычно не имеют TGFβR3, приводит к их трансформации после добавления TGFβ-лиганда. Эти исследования на курином эмбрионе идентифицировали ключевые сигнальные молекулы, которые регулировали трансформацию эндокардиальных клеток и способствовали разработке подобной системы для in vitro исследования у мыши, что позволило дополнить данные полученные на куриных эмбрионах [18]. Постоянный интерес к трансформации эндокардиальных и эндотелиальных клеток, как при развитии клапанов, так и в выявлении механизмов, лежащих в основе трансформации эндокардиальных клеток, свидетельствует о том, что исследования на куриных эмбрионах по-прежнему актуальны.

Сердечный нейральный гребень

Сердечный нейральный гребень необходим для нормального развития и дальнейшего функционирования ССС. Клетки нейрального гребня могут быть получены из нервных складок, расположенных между серединами отических плакод и каудальной частью 3-го сомита. Особенностью клеток данного вида является возможность дифференцировки в различные типы мезенхимальных клеток, которые участвуют в развитии ССС, в дополнение к нейрогенным клеткам.

Удаление первичного сердечного нейрального гребня приводит к ряду сердечно-сосудистых аномалий. К ним относят: общий артериальный ствол, двойное отхождение магистральных сосудов от правого желудочка, двуприточный левый желудочек [19]. Не кардиальные аномалии могут приводить к аплазии или гипоплазии тимуса, щитовидной железы и паращитовидных желез [20].

Эксперименты с использованием эмбрионов птиц, особенно куриных химер, позволили провести анализ миграции и дифференцировки клеток нейрального гребня [21]. Этот подход показал важную роль клеток нейрального гребня в развитии сердца. В частности, данные клетки вносят вклад в развитие аорто-легочной и конотрункальной перегородки.

В экспериментах на куриных эмбрионах также было обнаружено, что хемокиновый стромальный клеточный фактор (SDF1) и его родственный рецептор Cxcr4 важны для миграции в сердце клеток сердечного нейрального гребня. Было показано, что SDF1 действует как хемоаттрактант. Нарушение сигнализации SDF1 вызывало сердечные аномалии, в т.ч. неполное септирование аорты, легочного ствола и дефекты межжелудочковой перегородки [22].

Камеры сердца

В ходе завершения процесса формирования сердечной петли, начинается дифференцировка отделов сердца на два предсердия и два желудочка. Появление предсердий начинается с появления перегородки с дорсокраниальной стенки предсердия на стадии 14 по Гамбургеру-Гамильтону. В экспериментах на куриных эмбрионах было выявлено, что миокардиально-эндокардиальные взаимодействия координируют формирование клапанов [23], которые регулируют кровоток в сердце. Кроме того, полимеразная цепная реакция микроРНК выявила профили их экспрессии в предсердных, желудочковых и атриовентрикулярных областях развивающегося сердца цыпленка. В частности, miR-23b, miR-199a и miR-15a имели повышенную экспрессию во время раннего развития атриовентрикулярного канала, а анализ генов-мишеней свидетельствует о том, что они участвуют в регуляции путей передачи ЭМП [24].

Стенки камер сердца также подвергаются морфологическим изменениям. Вначале миокардиальный слой стенок желудочков образует выпячивания, называемые трабекулами, которые выступают в просвет камеры и покрываются слоем эндокарда. Процесс образования трабекул начинается со стадии 16 по Гамбургеру-Гамильтону. На протяжении всех стадий эмбрионального развития, увеличенная площадь поверхности сердца, создаваемая трабекулами, играет важную роль в васкуляризации и процессе доставки кислорода к сердцу.

Гемодинамика и ангиогенез

Куриный эмбрион, благодаря доступности для наблюдения и различных манипуляций, играл важную роль в ранних описаниях сосудистой системы позвоночных, сделанных Уильямом Гарвеем и Марчелло Мальпиги. С современными неинвазивными системами визуализации куриный эмбрион служит надежной моделью для мониторинга сосудистой сети in vivo. Когда развивающийся куриный эмбрион освобождается из яйца и культивируется ex ovo, хориоаллантоисная оболочка естественным образом расширяется, обнажая его сосудистую сеть и обеспечивая удобный доступ для долгосрочных экспериментов по ее визуализации.

Характер кровотока в развивающемся сердце играет значительную роль в морфогенезе сердца. В ответ на воздействие силы тока крови, культивируемые сердечные эндотелиальные клетки, перестраивают свой цитоскелет и изменяют экспрессию генов [25]. Чтобы связать такого рода данные, полученные в условиях in vitro с интактным сердцем куриного эмбриона, применяется ряд методов количественного анализа внутрисердечных потоков in vivo. Используя визуализацию in vivo, было показано, что высокочастотные сдвиговые вихревые флуктуации в развивающемся сердце оказывают более существенные воздействия, чем это можно было бы ожидать в столь малых структурах при низких значениях числа Рейнольдса. Чтобы проверить значимость этих сдвиговых сил in vivo, проводились эксперименты с блокированием тока крови, что приводило к образованию сердец с аномальной третьей камерой, нарушением формирования сердечной петли и образования клапанов. Сходство этих дефектов с некоторыми врожденными пороками сердца свидетельствует о важности внутрисердечной гемодинамики как ключевого эпигенетического фактора в эмбриональном кардиогенезе [25].

Роль эпигеномной регуляции в формировании ССС куриного эмбриона

МикроРНК участвуют в регуляции таких биологических процессов как пролиферация клеток, дифференцировка, апоптоз и поддержание нормальной клеточной физиологии. Аберрантная экспрессия или делеция микроРНК связана с аномальной дифференцировкой кардиомиоцита, нарушением развития сердца и сердечной дисфункцией. Несколько микроРНК были обнаружены в сердечной мышце и клетках миотомов скелетных мышц куриных эмбрионов.

Последовательность miR-1 играет важную роль, регулируя процесс кардиогенеза и миогенеза; miR-1 транскрибируется генами miR-1-1 и miR-1-2 [26]. Обнаружить транскрипты miR-1 удавалось в формирующейся сердечной трубке, начиная с дифференцировки кардиомиоцитов с 9-10 вплоть до стадии 22 по Гамбургеру-Гамильтону [26].

Избыточная экспрессия miR-1 приводит к остановке формирования сердца, развитию тонкостенных желудочков и сердечной недостаточности, что обусловлено преждевременной дифференцировкой и пролиферацией дефектных кардиомиоцитов [27].

Дифференцировка клеток в сердце регулируется различными факторами транскрипции: bHLH, hand1 и hand2, экспрессия которых регулирует развитие левого и правого желудочка, соответственно. Экспрессия фактора транскрипции hand2 зависит от isl-1, а hand1 – от nkx2-5 [28]. nkx2-5 взаимодействует с семейством транскрипционных факторов t-box и является одним из элементов активации или подавлении экспрессии генов, необходимых для дифференциации структур сердца. Выраженность экспрессии фактора nkx2-5 не существенна для образования синусового узла [29]. Однако, взаимодействие nkx2-5 с tbx2 или tbx3 приводит к репрессии гена, регулирующего предсердный натрийуретический пептид и коннексина-40 во время дифференцировки проводящей системы сердца, в том числе синоатриального узла [30, 31].

Заключение

Таким образом, эксперименты, позволяющие изучать развитие сердечно-сосудистой системы на ранних этапах онтогенеза, представляются весьма перспективными источниками информации для создания теоретической основы знаний о врожденной патологии системы кровообращения.

Использование куриных эмбрионов заложило основу для экспериментального изучения физиологии и патологии развития сердечно-сосудистой системы. Благодаря накопленному теоретическому и экспериментальному материалу о закономерностях развития куриного эмбриона и его органов, стало возможным изучение этиологии и патогенеза многих сердечнососудистых заболеваний. Работа с куриными эмбрионами заложила основу для получения человеком знаний в области эмбриогенеза сердечно-сосудистой системы – о формировании миокарда, эпикарда, эндокарда, коронарного сосудистого русла, камер сердца и магистральных сосудов.

С развитием новых биомедицинских технологий, в первую очередь методик прижизненной визуализации, расширился круг возможных вмешательств на сердечно-сосудистую систему куриного эмбриона. С учетом указанных преимуществ и совершенствования экспериментальных методик, модели на основе куриных эмбрионов не теряют актуальность и по сегодняшний день.

Об авторах

Азамат Халидович Каде

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: vestnik@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-0694-9984
SPIN-код: 1415-7612
ResearcherId: R-6536-2017

д.м.н., профессор, заведующий кафедрой общей и клинической патологической физиологии

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. им. Митрофана Седина, 4

Артем Иванович Трофименко

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: artemtrofimenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7140-0739
SPIN-код: 8810-2264
ResearcherId: R-3176-2017

к.м.н., ассистент кафедры общей и клинической патологической физиологии

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. им. Митрофана Седина, 4

Алла Юрьевна Туровая

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: vestnik@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0001-5236-308X
SPIN-код: 7544-1897
ResearcherId: O-5297-2018

к.м.н., доцент кафедры общей и клинической патологической физиологии

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. им. Митрофана Седина, 4

Давид Аркадьевич Певзнер

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: vestnik@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0232-0334
SPIN-код: 8764-8719
ResearcherId: O-2206-2018

студент

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. им. Митрофана Седина, 4

Вениамин Викторович Лазарев

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: vestnik@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-8047-2707
SPIN-код: 8934-9330
ResearcherId: O-3173-2018

студент

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. им. Митрофана Седина, 4

Евгений Евгеньевич Лысов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: vestnik@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9743-0394
SPIN-код: 7922-2618
ResearcherId: O-2214-2018

студент

Россия, С 350063, г. Краснодар, ул. им. Митрофана Седина, 4

Светлана Армаисовна Погосян

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: vestnik@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-4922-8949
SPIN-код: 9142-4493
ResearcherId: O-2674-2018

студент

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. им. Митрофана Седина, 4

Яна Игоревна Минина

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Кубанский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: vestnik@rzgmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-2250-0105
SPIN-код: 4745-2972
ResearcherId: O-3409-2018

студент

Россия, 350063, г. Краснодар, ул. им. Митрофана Седина, 4

Список литературы

Дополнительные файлы