IN VITRO EFFECT OF L-CARNITINE ON THE ACTIVITY OF LYSOSOMAL CYSTEINE PROTEASES AND THE STATE OF LYSOSOMAL MEMBRANE
- 作者: Fomina MA.1, Kudlaeva AM.1, Ryabkov AN.1
-
隶属关系:
- Ryazan State Medical University
- 期: 卷 25, 编号 1 (2017)
- 页面: 14-20
- 栏目: Biochemistry, physiology, biophysics, pathological physiology
- ##submission.dateSubmitted##: 31.03.2017
- ##submission.dateAccepted##: 31.03.2017
- ##submission.datePublished##: 31.03.2017
- URL: https://journals.eco-vector.com/pavlovj/article/view/6128
- DOI: https://doi.org/10.23888/PAVLOVJ2017114-20
- ID: 6128
如何引用文章
全文:
详细
The influence of L-carnitine in vitro on the lysosomal cysteine proteinase activity and stability of the lysosomal membrane of the liver homogenates of intact sexually Mature female rats of Wistar line weighing 280-330 g were studied. In the experimental groups isolated lysosomes were incubated in vitro in a solution of L-carnitine during 1, 2 and 4 hours, in the control groups in vitro incubation was carried out in a medium of isolating solution. The activity of ca-thepsins B, L and H was investigated by spectrofluorimetric method of Barrett & Kirschke in two fractions - lysosomal and outside of lysosomes. The activity of acid phosphatase was used as the main marker of a membrane labilization. In vitro incubation of lysosomes showed that carnitine at a concentration of 5 mM increases the total activity of cathepsin B in a one-hour incubation at 73,2% (p=0,008), cathepsin L in a two- and four-hour incubation - at 77,7% (p=0,005) and 42,3% (p=0,013) respectively, and reduces the overall activity of the cathepsin H in a one-hour incubation at 200,0% (p=0,008), in a two-hour - by 67,9% (p=0,05), in a four-hour -27,1% (p=0,02). In addition, incubation in 5 mM L-carnitine solution leads to an increase of unsedimentable activity and fall sedimentaries activity for cathepsin L in a two-hour, and for acid phosphatase - in a two - and four-hour exposure. 5 mM L-carnitine in one - and two-hour incubation stabilizes lysosomal membrane (whereas increase in incubation time up to 4 hours leads to its damage) and increases the selective permeability of the lysosomal membrane for the studied cathepsins, to the greatest extent - for cathepsin H.
全文:
Лизосомальные цистеиновые протеиназы (ЛЦП) относятся к семейству папаиноподобных протеолитических ферментов, характеризуются уникальной направленностью действия и неравномерной выработкой различными тканями. В живых организмах активность тиоловых катепсинов представляет собой тонкий баланс между их экспрессией, направленностью действия, активацией проферментов, подавлением их выработки ингибиторами и дальнейшим распадом. Локализуются ЛЦП преимущественно в лизосомах и поздних эндосомах клетки, однако, могут локализоваться в ядре, цитоплазме и плазматической мембране. Тиоловые катепсины являются важными регуляторами и сигнальными молекулами в неограниченном числе биологических процессов, таких как иммунный ответ, ремоделирование костной ткани, активация предшественников многих белков, дифференцирование кератиноцитов и др. Известна роль катепсинов в развитии мышечной дистрофии, ревматоидного артрита, болезни Альцгеймера, атеросклероза [1-3]. ЛЦП принимают участие в процессах, связанных с раковой прогрессией, таких как апоптоз, метастазирование, опухолевый рост, инвазия и ангиогенез. В тканях многих опухолей показано увеличение активности и содержания цистеиновых протеиназ. Так, в клеточных культурах опухоли простаты наблюдается высокий уровень катепсинов В, L, H и увеличение отношения катепси-ны/ингибиторы по сравнению с культурой нормальных клеток [4]. Активно изучается участие ЛЦП в процессах опосредуемой клеточной гибели. Так, была обнаружена ранняя утечка катепсинов B, D и L в цитозоль, где они активируют каспазы 3 и 9, запуская апоптоз. Также имеются данные о каспазонезависимом пути клеточной гибели, сигналом которого служит пермеабили-зация лизосомальной мембраны (ПЛМ). Наряду с достижением избирательной проницаемости лизосомальной мембраны одним из факторов выхода катепсинов в цитозоль является лабилизация мембраны [5].
В связи с этим важен поиск соединений, способных стабилизировать лизосо-мальную мембрану. Особый интерес представляет L-карнитин, способный в концентрации 5 мМ повышать стабильность лизосомальной мембраны гепатоцитов крысы при часовой in vitro-инкубации [6]. На клетках Jurkat было показано, что 5 мМ L-карнитин оказывает защитное действие при апоптозе, что обусловлено ингибированием синтеза церамидов и активности каспаз 3, 7 и 8 [7]. Однако, в ходе исследований, проведенных на клетках карциномы человека, было обнаружено апоптогенное действие 10 мМ карнитина в сочетании с бутиратом [8]. Также было показано, что на фоне гиперго-моцистеинемии L-карнитин приводит к снижению активности катепсинов L и Н и оказывает стабилизирующее влияние на ли-зосомальные мембраны клеток сердечной мышцы [9]. Таким образом, актуальным является изучение влияния L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз и состояние лизосомальной мембраны.
Целью данного исследования стало изучение прямого влияния L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз in vitro.
Материалы и методы
Выделение лизосом. За 12 часов до забоя половозрелых интактных крыс-самок линии Wistar массой 280-330 г лишали пищи для стандартизации условий опытов. Эвтаназия животных осуществлялась методом обескровливания под эфирным рауш-наркозом при сохраненном дыхании и сердцебиении. Печень извлекали немедленно после обескровливания, помещая орган в охлажденный 0,25 М раствор сахарозы (среда выделения). Далее печень промывали от остатков крови средой выделения, после чего готовили точные навески участков печени в пределах 740-760 мг на электронных весах (AJH-220 CE, Япония). Полученный материал измельчали ножницами и помещали в стеклянный стакан гомогенизатора «Potter S» (Sartorius, Германия), добавляя холодный 0,25 М раствор сахарозы в соотношении 1:9 и гомогенизировали в течение 35 с тефлоновым пестиком 900 об./мин и зазоре в пределах 0,16-0,24 мм. Описанные процедуры проводили при температуре не выше 4°С. Полученные гомо-генаты центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин (центрифуга CM-6M ELMI, Латвия) для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Надосадочную жидкость отбирали пипеткой в отдельные гильзы и центрифугировали 15 мин при 13000 об./мин для удаления митохондрий, а затем полученный супернатант - дополнительно при 15500 об./мин в течение 30 мин (центрифуга рефрижераторная К 24 Д, ГДР). Осадок, представляющий собой грубую фракцию лизосом, ресуспендировали в 2 мл 0,25 М сахарозы и использовали для in vitro исследования.
Инкубация. Полученные суспензии лизосом печени в 0,25 М сахарозе разделили на две серии по 6 проб в каждой: серию 1 (серия сравнения, 2 мл 0,25 М сахарозы) и серию 2 (1,9 мл 0,25 М сахарозы с добавлением раствора 0,1 мл карнитина с конечной концентрацией 5 мМ). Каждая серия воспроизводилась трижды; инкубация осуществлялась при температуре 37°С на водяной бане в течение 1-го, 2-х и 4-х часов. После инкубации лизосомы повторно осаждали центрифугированием при 15500 об./мин в течение 30 мин. Затем отбирали надосадоч-ную жидкость (неседиментируемая фракция, НСФ), а осадок (седиментируемая фракция, СФ) ресуспендировали в 0,25 М сахарозе с добавлением Тритона Х-100 в конечной концентрации 0,1%. Полученные аликвоты замораживали и хранили до момента исследования при температуре -20°С не более 1 месяца.
Определение активности лизосомальных цистеиновых протеиназ. Активность катепсинов В, L и Н изучалась спектроф-луориметрическим методом (System 3 Scanning Spectrofluorometr, Optical technology devices, inc. Elmstord, New York, 10523) по Barrett & Kirschke [10]. Удельную активность катепсинов выражали в нкат/г белка. Содержание белка определяли по методу Лоури коммерческим набором Научно-практического центра «Эко-сервис» (Санкт-Петербург, Россия). Описанное измерение активности ферментов осуществлялось раздельно для СФ и НСФ и обозначалось для каждого катепсина как седимен-тируемая активность (СА) и неседиментируемая активность (НСА) соответственно.
Оценка стабильности лизосомальной мембраны. Для оценки стабильности лизо-сомальной мембраны традиционно используется коэффициент лабильности (Клаб), рассчитываемый как соотношение активности лизосомального фермента во внелизо-сомальной (неседиментируемой) фракции к общей активности (ОА), представляющей собой сумму НСА и СА для данного фермента [11]. Поскольку для лизосомальных-цистеиновых протеиназ описан механизм секреции [12], в качестве основного маркера лабилизации мембран использовали активность кислой фосфатазы [13]. Активность фермента измеряли унифицированным методом по «конечной точке», используя коммерческий набор «Витал Диагно-стикс СПб» (Санкт-Петербург, Россия).
Для каждой выборки определяли значение медианы ^е), верхнего и нижнего квартилей. Результаты представлены в формате Me [Q1; Q3]. Для проверки статистической значимости отличий в контрольной и опытной группе использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты и их обсуждение
Обнаружено, что прямое воздействие карнитина в конечной концентрации 5 ммоль/л приводит к отчетливым изменениям как активности ЛЦП, так и стабильности ли-зосомальной мембраны. Оценка стабильности лизосомальной мембраны по показателю Клаб кислой фосфатазы продемонстрировала, что одно- и двухчасовая инкубация в среде, содержащей 5 мМ L-карнитин, приводит к падению Клаб на 59,6% (р=0,022) и 33,4% (р=0,005) соответственно относительно серий сравнения, что свидетельствует о стабилизации мембраны. Данный вывод совпадает с результатами других авторов [6, 9]. При этом, увеличение времени инкубации до 4-х часов привело к возрастанию Клаб кислой фосфатазы на 33,2% (р=0,005), что можно трактовать как повреждение лизосомальной мембраны (табл. 1).
Таблица 1. Влияние 5 мМ L-карнитина на значение показателя Клаб, %
Фермент | Продолжительность инкубации | |||||
1 час | 2 часа | 4 часа | ||||
Сахароза | Карнитин | Сахароза | Карнитин | Сахароза | Карнитин | |
37,26 | 74,87 | 64,09 | 84,12 | 10,83 | 62,45* | |
Катепсин В | [0; | [70,76; | [13,74; | [76,18; | [6,69; | [45,19; |
75,64] | 78,00] | 78,81] | 91,42] | 13,25] | 91,46] | |
33,34 | 37,13 | 42,85 | 79,38° | 16,85 | 55,43* | |
Катепсин L | [32,98; | [30,88; | [14,65; | [75,36; | [11,6; | [53,34; |
39,09] | 40,20] | 82,17] | 83,19] | 20,56] | 62,10] | |
37,35 | 86,24* | 59,07 | 68,44* | 50,56 | 94,75*х | |
Катепсин H | [22,20; | [79,46; | [55,16; | [65,76; | [38,27; | [92,45; |
37,38] | 97,45] | 62,58] | 70,42] | 54,43] | 96,97] | |
Кислая фосфатаза | 23,54 [16,23; 27,02] | 9,52* [7,18; 12,03] | 27,12 [26,35; 28,80] | 18,06*° [16,95; 19,26] | 27,62 [24,13; 30,22] | 41,35*х° [38,64; 42,71] |
Примечание: * - статистически значимые (р<0,05) отличия от групп контроля с соответствующей продолжительностью инкубации, - статистически значимые (р< 0,05) отличия от 1 часа инкубации, х - статистически значимые (р<0,05) отличия от 2-х часов инкубации.
При исследовании воздействия карнитина на активность ЛЦП in vitro обнаружен рост ОА на 73,2% (р=0,008) катепсина B за счет роста активности в НСФ на 76,8% (р=0,008) в течение одного часа инкубации (табл. 2). Аналогичные изменения наблюдались в ОА катепсина L при двух- и четырехчасовой инкубации: на 77,7% (р=0,005) и 42,3% (р=0,013) соответственно. Можно предположить, что L-карнитин способствует активации катепсинов из их предшественников или высвобождению их из комплекса с ингибиторами. В литературе имеются сведения о проапоптогенном действии карнитина [8]. Одним из возможных механизмов развития данного явления может оказаться способность карнитина повышать активность катепсинов В и L, для которых описано участие в запуске опосредованной клеточной гибели [5]. При этом, при одно-и двухчасовой инкубации исследуемые ферменты переходят во внелизосомальную фракцию не за счет повреждения мембраны, а видимо, за счет повышения её избирательной проницаемости.
В отношении катепсина Н наблюдалась другая картина: прямое воздействие 5 мМ карнитина приводило к снижению ОА: при одночасовой инкубации на 200,0% (р=0,008) за счет падения активности фермента в СФ на 87,0% (р=0,008), при двухчасовой инкубации - на 67,9% (р=0,05) за счет падения активности фермента в СФ на 79,0% (р=0,005) и при четырехчасовой инкубации - на 27,1% (р=0,02) за счет падения активности фермента в СФ на 95,1% (р=0,005) относительно соответствующих серий сравнения. Аналогичные изменения в отношении катепсина Н карнитин вызывал у крыс в in vivo эксперименте [9]. Также наблюдалось повышение избирательной проницаемости мембраны для данного фермента при одно- и двухчасовой инкубации.
Статистически значимое нарастание значение Клаб для всех изучаемых катеп-синов при четырехчасовой инкубации может объясняться повреждением лизосомальной мембраны.
При исследовании влияния карнитина на изучаемые показатели в зависимости от продолжительности воздействия обнаружено, что основные изменения касаются распределения ферментов между вне- и внутрилизосомальной фракциями. Так, после 2-х часов инкубации в среде, содержащей 5 мМ L-карнитин, наблюдалось статистически значимое увеличение НСА катепсина L на 43,2% (р=0,02) и снижение СА на 71,1% (р=0,02) относительно 1-го часа инкубации (рис. 1), однако удлинение времени воздействия до 4-х часов не приводило к усугублению описываемых эффектов. Для кислой фосфатазы по мере увеличения времени инкубации (1, 2 и 4 часа) наблюдался рост НСА фермента и падение СА (рис. 2). Также с течением времени наблюдалось увеличение Клаб по кислой фосфатазе (табл. 1). В отношении катепсинов В и Н статистически значимых изменений активности и распределения во временном аспекте выявлено не было.
Выводы
- Карнитин в концентрации 5 мМ вызывает статистически значимый рост общей активности катепсинов B и L и снижение общей активности катепсина Н при in vitro -инкубации лизосом печени крыс.
- Инкубация в 5 мМ растворе L-карнитина приводит к росту неседименти-руемой активности и падению седименти-руемой активности для катепсина L при двухчасовом, а для кислой фосфатазы - при двух- и четырехчасовом воздействии.
- При одно- и двухчасовой инкубации L-карнитин в концентрации 5 мМ стабилизирует лизосомальную мембрану, однако увеличение времени инкубации до 4-х часов приводит к её повреждению.
- 5 мМ L-карнитин повышает избирательную проницаемость лизосомальной мембраны для исследуемых катепсинов, в наибольшей степени - для катепсина Н.
Конфликт интересов отсутствует
作者简介
M Fomina
Ryazan State Medical University
编辑信件的主要联系方式.
Email: anyakudlaeva@mail.ru
Ph 俄罗斯联邦
A Kudlaeva
Ryazan State Medical University
Email: anyakudlaeva@mail.ru
ассистент кафедры биологической химии 俄罗斯联邦
A Ryabkov
Ryazan State Medical University
Email: anyakudlaeva@mail.ru
Ph 俄罗斯联邦
参考
- Turk V., Stoka V., Vasiljeva O., Ren-ko M., Sun T., Turk B. et al. Cysteincatep-sines: from structure, function and regulation to new frontiers // Biochimica et Biophysi-caActa. 2012. Vol. 1824, №1. P. 68-88. doi: 10.1016/j.bbapap.2011.10.002.
- Абаленихина Ю.В., Фомина М.А., Исаков С.А. Окислительная модификация белков и изменение активности катепсина L селезенки крыс в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2013. Т. 21, №1. С. 45-49.
- Арапова А.И., Фомина М.А. Аутокаталитические эффекты лизосомальных-цистеиновых протеиназ гладкой мышцы аорты крыс // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2015. №4. С. 27-32.
- Потеряева О.Н. Участие цистеино-выхпротеиназ и их ингибиторов в развитии злокачественных опухолей (обзор литературы) // Медицина и образование в Сибири. 2009. № 1. Available at: http://ngmu.ru/cozo/ mos/article/abauthors.php?id=327 (accessed 30 August 2016).
- Пупышев А.Б. Пермеабилизация лизосомных мембран как апоптогенный фактор // Цитология. 2011. Т. 53, №4. С. 313-324.
- Фомина М.А., Кудлаева А.М. Изучение in vitro-воздействия L-карнитина на лизосомальный цистеиновый протеолиз изолированно и на фоне оксидативного стресса // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2016. №1. С. 55-59.
- Mutomba M.C., Yuan H., Konyavko M., Adachi S., Yokoyama C.B., Esser V. et al. Regulation of the activity of caspases by L-carnitine and palmitoylcarnitine // FEBS Letters. 2000. Vol. 478, №1-2. P. 19-25.
- Roy M.J., Dionne S., Marx G., Qureshi I., Sarma D., Levy E. et al. In vitro studies on the inhibition of colon cancer by butyrate and carnitine // Nutrition. 2009. Vol. 25, №11-12. P. 11931201. doi: 10.1016/j.nut.2009.04.008.
- Ильичёва А.С., Фомина М.А. Влияние L-аргинина и карнитина на активность катепсинов L и H и проницаемость лизосомальной мембраны в сердечной мышце при выраженной гипергомоцистеинемии // Казанский медицинский журнал. 2015, №5. С. 819-824.
- Barrett A.J., Kirschke H. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L // Methods in En-zymol. 1981. Vol. 80. P. 535-561.
- Покровский А.А., Тутельян В.А. Лизосомы. М.: Наука, 1976. 378 с.
- Felbor U., Dreier L., Bryant R., Ploegh H., Olsen B., Mothes W. Secreted ca-thepsin L generates endostatin from collagen XVIII // EMBO J. 2000. Vol. 19, №6. P. 11871194. doi: 10.1093/emboj/19.6.1187.
- Terman A., Kurz T., Gustafsson B., Brunk U.T. Lysosomal Labilization // IUBMB Life. 2006. Vol. 58, №9. P. 531-539. doi: 10.1080/15216540600904885.