Антиоксидантная система и перекисное окисление липидов в эритроцитах крыс при низкодозовом воздействии ацетатом ртути

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Существенным фактором, влияющим на продолжительность и качество жизни человека, является воздействие на него химических соединений. Один из наиболее распространенных тяжелых металлов, влияющий на организм человека, — ртуть. Существуют разные химические формы ртути: элементарная, органическая и неорганическая [16]. Каждая форма ртути различна по степени своей токсичности и отличается механизмом воздействия и распределения в организме человека [17]. Основные источники поступления низких доз ртути в организм человека — это вода [18, 23], морепродукты [19], продукты питания из Юго-Восточной Азии, выращиваемые с использованием ртутьсодержащих фунгицидов. Множественные свойства ртути обеспечили ее обширное использование в самых разнообразных отраслях промышленности. Соединения ртути используются при изготовлении термометров, люминесцентных ламп, в металлургии, сельском хозяйстве и медицине при производстве лекарственных препаратов [20].

Представляемое как безопасное для организма человека низкодозовое воздействие ртутных соединений в течение продолжительного времени приводит к накоплению токсиканта в тканях, вызывая поражение центральной нервной системы, почек и печени. Плод и дети особенно восприимчивы к воздействию ртути из-за незрелости систем организма, а также быстрого роста и развития [24]. Показано, что неорганическая ртуть способна проникать через плацентарный барьер и вызывать изменения у плода [24]. Токсикант может передаваться от матери к ребенку не только через плаценту, но и через грудное молоко [21]. Сообщается о нарушениях когнитивных функций, проблемах с дыханием, сердечно-сосудистых заболеваниях у детей, подвергшихся предположительно безопасному воздействию ртути [12].

Биологическая активность ртути определяется ее высоким сродством к функциональным группам молекул органических соединений, в особенности белков. Так, связываясь с сульфгидрильными группами, ртуть способна инактивировать многочисленные ферментативные реакции [9]. Снижение активности ферментов влечет за собой нарушение белкового, липидного и углеводного обмена, угнетение дыхательной цепи и утечку с нее активных форм кислорода (АФК), что приводит к развитию оксидативного стресса [8, 28]. АФК активируют процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических мембранах благодаря высокому содержанию в них полиненасыщенных жирных кислот. Ртуть вызывает изменения мембраны эритроцитов, которые приводят к различным клеточным аномалиям и выходу гемоглобина в плазму крови (гемолизу) [22, 25].

Эритроциты часто используют в качестве модели для исследования окислительного стресса из-за высокой уязвимости к перекисному окислению их мембран [27]. Наличие высокого напряжения кислорода в эритроцитах и двухвалентного железа (Fe⁺⁺) определяет высокую скорость образования АФК, таких как супероксидный анион-радикал (О₂^–), пероксид водорода (Н₂О₂) и гидроксильный радикал (·ОН) [29]. Эритроциты защищены от действия активных метаболитов кислорода различными биологическими механизмами, включая низкомолекулярные антиоксиданты и ферментативное звено антиоксидантной системы.

Анализ литературных источников показал обширность исследований, связанных с изучением токсичности ртути по отношению к разным системам организма [10, 14, 15, 26]. Однако сведения о состоянии баланса между образованием продуктов ПОЛ и системой антиоксидантной защиты, который может быть нарушен при воздействии ртути, отрывочны и недостаточно однозначны.

В связи с этим проблема длительного низкодозового воздействия неорганических форм ртути на антиоксидантную систему остается актуальной.

Целью проведения данной экспериментальной работы стало изучение изменений показателей антиоксидантной системы в эритроцитах крыс линии Вистар при подостром отравлении ацетатом ртути.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование выполнено на половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 160–200 г из питомника «Рапполово» (Ленинградская обл.). Животные содержались в соответствии с требованиями ГОСТ ¹.

Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы с помощью метода рандомизации [13]. В течение всего эксперимента животных содержали в клетках по 10 особей в каждой при свободном доступе к корму и питьевой воде.

Подострое отравление моделировали путем перорального введения ежедневно в течение 30 дней водного раствора ацетата ртути в дозе 4 мг/кг. Схема эксперимента приведена на рисунке. За весь период введения токсиканта каждое животное опытных групп получило суммарно 120 мг/кг ацетата ртути, что соответствует 18 мг/кг ртути. Согласно паспорту токсичности ацетата ртути полулетальная доза при внутрижелудочном пути введения для лабораторных крыс составляет 40,9 мг/кг.

 

Рисунок. Схема моделирования подострого отравления ацетатом ртути

Figure. Simulation diagram of chronic mercury acetate poisoning

 

Через 30 и 44 дня животных контрольных и опытных групп подвергали эвтаназии в соответствии с Федеральным законом Российской Федерации ² «О защите животных от жестокого обращения» методом декапитации в условиях СО₂-анестезии. Забор крови для биохимических исследований проводили в пластиковые гепаринизированные пробирки Vacuette (Австрия).

Для получения гемолизата эритроцитов кровь отстаивали в течение 30 мин при температуре 4 °C, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. После отделения плазмы эритроцитарную взвесь отмывали холодным физиологическим раствором из расчета 1 : 2, а затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Повторяли процедуру три раза. Гемолиз эритроцитов осуществляли добавлением эритроцитарной взвеси в 5 мМ Трис-HCl-буфер с pH 7,6 в соотношении 1 : 9.

В полученном гемолизате эритроцитов определяли показатели антиоксидантной системы (АОС) и ПОЛ [1, 4, 7]. Концентрацию восстановленного глутатиона (ВГ), малонового диальдегида (МДА), диеновых конъюгатов (ДК), активность глутатион-S-трансферазы (ГТ) определяли на спектрофотометре UV-2400 фирмы Shimadzu [7]. Концентрацию гемоглобина, активность ферментов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ), супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) определяли на биохимическом анализаторе «А-25». Для определения активности ферментов антиоксидантной системы (СОД, ГП, Г-6-ФДГ) использовали наборы фирмы Randox (Великобритания). Концентрацию исследуемых субстратов и активность ферментов в гемолизате пересчитывали на 1 г гемоглобина, концентрацию которого определяли с помощью набора фирмы BioSystems S.A. (Испания).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения Microsoft Excel с добавлением пакета AtteStat. Вычислены средние значения и ошибки среднего (М ± m), оценку достоверности различий средних данных осуществляли с использованием U-критерия Манна – Уитни при уровне значимости 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное исследование позволило установить, что 30-дневное введение ацетата ртути в дозе 120 мг/кг сопровождается существенными нарушениями состояния системы глутатиона в эритроцитах отравленных животных (табл. 1).

 

Таблица 1. Показатели антиоксидантной системы и перекисного окисления липидов в гемолизате эритроцитов крыс через 30 дней после подострого отравления ацетатом ртути

Table 1. Parameters of the antioxidant system and lipid peroxidation in the rat erythrocytes hemolysate after 30 days subacute poisoning with mercury acetate

Исследованные параметры / Investigated parameters	Группы животных / Groups of animals
	контрольная № 1 / control No. 1	опытная № 1 / experimental No. 1
ВГ, мкмоль/gHb / GSH, µmol/gHb	11,50 ± 0,50	11,80 ± 0,30
СОД, U/gHb / SOD, U/gHb	399,1 ± 38,0	559,8 ± 51,6*
ГТ, U/gHb / GT, U/gHb	80,3 ± 5,8	61,4 ± 4,4*
ГП, U/gHb / GPX, U/gHb	44,6 ± 1,0	49,4 ± 1,9*
Г-6-ФДГ, U/gHb / G6PD, U/gHb	7,97 ± 0,48	8,52 ± 0,62
МДА, нмоль/gHb / MDA, nmol/gHb	11,79 ± 2,30	12,42 ± 1,84
ДК, нмоль/gHb / CD, nmol/gHb	1,81 ± 0,09	2,62 ± 0,25*

*Достоверно по сравнению с контрольной группой (при р ≤ 0,05; критерий Манна – Уитни). Примечание. Здесь и в табл. 2. ВГ — восстановленный глутатион, СОД — супероксиддисмутаза, ГТ — глутатион-S-трансфераза, ГП — глутатионпероксидаза, Г-6-ФДГ — глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, МДА — малоновый диальдегид, ДК — диеновые конъюгаты.

*Significantly compared with the control group (at р ≤ 0.05; Mann–Whitney criterion). Note. GSH — reduced glutathione, SOD — superoxide dismutase, GT — glutathione-S-transferase, GPX — glutathione peroxidase, G6PD — glucose-6-phosphate dehydrogenase, MDA — malondialdehyde, CD — diene conjugates.

 

В проведенном исследовании в опытной группе животных после введения ацетата ртути в дозе 4 мг/кг через 30 дней отмечалось увеличение активности СОД на 40,3 % (p < 0,05). Повышение активности СОД связано с увеличением генерации одной из активных форм кислорода — супероксидного анион-радикала. Полученные данные об изменении активности СОД при отравлении низкими дозами ацетата ртути согласуются с результатами других исследований при отравлении иными токсикантами [2, 6].

Основной вклад в нейтрализацию образовавшегося в ходе супероксиддисмутазной реакции пероксида водорода вносят глутатионпероксидаза и каталаза. Активность ГП в опытной группе повышалась на 10,8 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Несмотря на повышение активности ГП, уровень ВГ, который расходуется для нейтрализации перекисей, был изменен незначительно [3]. Причинами функционально приемлемого уровня ВГ может быть как поддержание его пула за счет эффективного процесса рециклинга, так и высокой активности каталазы, которая разлагает пероксид водорода на воду и кислород. Сохранение уровня ВГ при увеличении активности ГП можно рассматривать как адаптивную реакцию на ртуть-индуцированный оксидативный стресс.

Проведенное исследование показало снижение активности ГТ в опытной группе крыс после 30-дневного введения токсиканта на 23,5 % по сравнению с контрольной группой (p < 0,05). Выраженное снижение активности ГТ можно объяснить наличием в активном центре фермента аминокислоты цистеина и высоким сродством ртути к сульфгидрильным группам белков. Связываясь с SH-группами ферментов, ртуть способна ингибировать их активность [9].

Накопление в гемолизате эритроцитов начальных продуктов ПОЛ после введения в течение одного месяца ацетата ртути свидетельствует о значимых повреждениях липидов по свободнорадикальному механизму. Так, концентрация диеновых конъюгатов через один месяц после интоксикации ацетатом ртути достоверно возрастала на 44,8 % в сравнении с контрольной группой. Концентрация МДА в опытной группе животных повышалась незначительно по сравнению с контрольной группой животных. Выявленная активация процессов липопероксидации может привести к изменению биологических функций мембран, включая снижение текучести, изменение проницаемости, инактивацию связанных с мембраной ферментов и рецепторов [11].

Полученные данные демонстрируют нарушение антиоксидантного равновесия в эритроцитах после 30-дневного введения ацетата ртути в дозе 4 мг/кг. Дисбаланс подтверждается увеличением активности СОД на 40,3 %, увеличением активности ГП на 10,8 % и увеличением концентрации ДК на 44,8 %, при этом активность ГТ снизилась на 23,5 %.

На втором этапе были исследованы показатели АОС и процессов ПОЛ у животных через 14 дней после окончания подострого введения ацетата ртути в дозе 4 мг/кг (табл. 2). Анализ результатов показал, что интенсивность оксидативного стресса в опытной группе животных не снижалась. Это обусловлено процессами кумуляции ртути, что подтверждается изменением активности ферментативного звена системы АОС, играющей ключевую роль в нейтрализации продуктов свободно-радикального окисления. Динамика изменения активности исследуемых ферментов не имела значимых отличий от 2-недельной давности. Так, в опытной группе животных через 14 дней после окончания введения ацетата ртути отмечалось повышение активности СОД на 42,8 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Такое повышение активности свидетельствует о продолжении избыточного образования супероксидного анион-радикала в отсроченный период после отравления. Повышение активности ГП в опытной группе крыс на 12,7 % (p < 0,05) в отсроченный период после отравления токсикантом по сравнению с контрольной группой также связано с увеличением образования пероксида водорода. Одновременно с увеличением активности СОД и ГП, через 14 дней после окончания введения токсиканта наблюдается значительное снижение активности ГТ в опытной группе животных на 27,7 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Концентрация ВГ и активность Г-6-ФДГ изменялась незначительно.

 

Таблица 2. Показатели антиоксидантной системы и перекисного окисления липидов в гемолизате эритроцитов крыс через 14 дней после окончания введения ацетата ртути в дозе 4 мг/кг

Table 2. Parameters of the antioxidant system and lipid peroxidation in the rat hemolysate of erythrocytes 14 days after the end mercury acetate administration at a dose of 4 mg/kg

Исследованные параметры / Investigated parameters	Группы животных / Groups of animals
	контрольная № 2 / control No. 2	опытная № 2 / experimental No. 2
ВГ, мкмоль/gHb / GSH, µmol/ gHb	11,02 ± 0,16	10,39 ± 0,21
СОД, U/gHb / SOD, U/gHb	445,00 ± 30,30	635,40 ± 46*
ГТ, U/gHb / GT, U/gHb	76,30 ± 2,80	55,20 ± 3,10*
ГП, U/gHb / GPX, U/gHb	47,30 ± 1,70	53,30 ± 0,70*
Г-6-ФДГ, U/gHb / G6PD, U/gHb	9,31 ± 0,42	9,89 ± 0,71
МДА, нмоль/gHb / MDA, nmol/ gHb	8,27 ± 0,91	12,18 ± 0,74*
ДК, нмоль/gHb / CD, nmol/ gHb	1,47 ± 0,05	1,82 ± 0,06*

*Достоверно по сравнению с контрольной группой (при р ≤ 0,05; критерий Манна – Уитни).

*Significantly compared with the control group (at р ≤ 0.05; Mann–Whitney criterion).

 

Таким образом, направленность нарушений ферментного звена АОС через 14 дней после окончания 30-дневного введения ацетата ртути в дозе 4 мг/кг сохраняется. Однако более выраженное накопление продуктов ПОЛ свидетельствует о снижении функциональных резервов ферментного звена АОС. Так, в результате исследования установлено, что через 14 дней после окончания 30-дневного введения ацетата ртути у животных опытной группы концентрация ДК достоверно возрастала на 23,8 %, а концентрация МДА на 47,3 % по сравнению с контрольной группой. Известно, что повышение уровня АФК приводит к распаду комплекса ГТ и киназы JNK1. Последняя запускает каскад событий, начинающихся с фосфорилирования Jun-c, что приводит к усилению процессов апоптоза [5]. Усиленная перекисная деградация липидов мембран в отсроченный период после подострого отравления ацетатом ртути вызвана персистированием токсиканта в организме и напряжением адаптивных реакций системы АОС.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Низкодозовое воздействие ацетатом ртути в дозе 4 мг/кг в условиях подострого отравления приводило к нарушению гомеостаза системы антиоксидантной защиты. Это сопровождалось достоверным увеличением активности СОД и ГП, вызванным увеличением генерации АФК. Наблюдаемое снижение активности ГТ, вследствие ингибирования в ее активном центре SH-групп ацетатом ртути, приводит не только к дефициту Se-независимой глутатионпероксидазной активности, но и к активации апоптоза. Установлена интенсификация процессов ПОЛ мембран эритроцитов, что проявилось в увеличении концентрации ДК. В отсроченный период после отравления сохраняется направленность нарушений ферментативного звена АОС эритроцитов, а также отмечается увеличение активности процессов ПОЛ.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Наибольший вклад распределен следующим образом: В.А. Кашуро, Е.Г. Батоцыренова — руководство исследованием, концепция и дизайн исследования, редактирование текста, утверждение рукописи для публикации; К.М. Щепеткова — сбор материала, обработка материала, статистическая обработка данных, сбор и анализ литературных источников, написание текста, редактирование текста; Л.А. Литвиненко, Н.П. Раменская — редактирование текста.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Этический комитет. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава России (№ 03/03 от 20.10.2021).

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. The largest contribution is distributed as follows: V.A. Kashuro, E.G. Batotsyrenova — research management, research concept and design, text editing, manuscript approval for publication; K.M. Shchepetkova — material collection, material processing, statistical data processing, collection and analysis of literary sources, text writing, text editing; L.A. Litvinenko, N.P. Ramenskaya — text editing.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Ethics approval. The protocol of the study was approved by the Local Ethics Committee of the St. Petersburg State Pediatric Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (10/20/2021, No. 03/03).

 

¹ Межгосударственный стандарт ГОСТ 33044–2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики» (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 20 ноября 2014 г. № 1700-ст; дата введения 01.08.2015)

² Федеральный закон от 27.12.2018 № 498-ФЗ (ред. от 27.12.2019) «Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации».

Об авторах

Кристина Михайловна Щепеткова

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: tesh_07@inbox.ru

аспирант кафедры биологической химии

Россия, Санкт-Петербург

Екатерина Геннадьевна Батоцыренова

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет; Научно-клинический центр токсикологии им. акад. С.Н. Голикова Федерального медико-биологического агентства

Email: bkaterina2009@yandex.ru

канд. биол. наук, доцент кафедры биологической химии; ведущий научный сотрудник лаборатории биохимической токсикологии и фармакологии

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Любовь Александровна Литвиненко

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: lyublitvin@inbox.ru

канд. мед. наук, доцент кафедры биологической химии

Россия, Санкт-Петербург

Наталья Петровна Раменская

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Email: n_ramenskaia@mail.ru

канд. биол. наук, доцент кафедры биологической химии

Россия, Санкт-Петербург

Вадим Анатольевич Кашуро

Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет; Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена; Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: kashuro@yandex.ru

д-р мед. наук, доцент, заведующий кафедрой биологической химии; профессор кафедры анатомии и физиологии животных и человека; профессор кафедры челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы