Значение антиангиогенных веществ эндоглина и sFLT-1, а также эндогенного дигиталис-подобного фактора маринобуфагенина в патогенезе преэклампсии

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Среди важнейших инициирующих факторов, способствующих формированию преэклампсии, рассматриваются нарушения процессов инвазии трофобласта в материнские сосуды. Это приводит к отсутствию полноценного ремоделирования последних и создает условия для развития ишемической плацентарной недостаточности [3]. Весомая роль в этих процессах отводится нарушению соотношения проангиогенных и антиангиогенных факторов [13, 14]. Активность ангиогенных веществ в существенной степени определяется антиангиогенными факторами, такими как рецептор l сосудисто-эндотелиального фактора роста (sVEGF-Rl), известный также как sFLT-1 [2, 4, 6–8]. Кроме того, к важнейшим антиангиогенным факторам относится мембранный протеин эндоглин. В качестве его функций рассматриваются способность оказывать влияние на формирование капилляров, регулировать проницаемость сосудистой стенки и участвовать в поддержании сосудистого тонуса [3]. При формировании преэклампсии возникает избыточная экспрессия антиангиогенных факторов, ведущая к запуску ишемического каскада. Также ключевую роль в развитии преэклампсии играют эндогенные дигиталис-подобные факторы, блокирующие работу Na⁺/K⁺-ATФаза и способствующие формированию патологического спазма сосудов [1]. Одним из основных представителей данной группы является маринобуфагенин (МБГ).

Цель нашего исследования заключалась в установлении взаимосвязи действия антиангиогенных факторов sFLT-1 и эндоглина, а также МБГ в формировании симптомов преэклампсии в клинике и эксперименте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование состояло из двух фаз. В первой (экспериментальной) были использованы 36 беременных крыс линии Sprague-Dawley, весом от 225 до 250 г. Все животные случайным образом были разделены на 3 группы. Первая группа (контрольная) состояла из 12 животных и получала обычную диету. У 24 крыс посредством введения в рацион 1,8 % раствора NaCl с 12-го по 19-й дни беременности моделировали формирование преэклампсия-подобного состояния. Затем 12 животным, составившим вторую группу, однократно внутрибрюшинно вводили преиммунную кроличью сыворотку в дозировке 50 мкг/кг. Еще 12 животным (третья группа) также однократно внутрибрюшинно применяли поликлональные антиМБГ антитела в дозировке 50 мкг/кг. Во всех группах с помощью хвостовой манжеты оценивали систолическое артериальное давление, уровень протеинурии, исследовали уровень МБГ в плазме крови. После проведения эвтаназии посредством обескровливания животных, находящихся под воздействием кетамина, вводимого в дозировке 100 мг/кг [5], оценивали уровень эндоглина в плаценте, а также sFlt-1 в плаценте и кольцах грудной аорты.

На второй фазе (клинической) изучены изменения содержания sFlt-1 и эндоглина-1 в тканях плаценты, а также МБГ в плазме крови у беременных женщин с преэклампсией. Нами были отобраны 16 пациенток с преэклампсией (первая группа) в возрасте 29 ± 2 года и сроком гестации 36 ± 1 нед. В группу сравнения (вторая группа) входили 14 женщин с физиологической беременностью в возрасте 26 ± 1 год и гестацией 37 ± 1 нед. Перед забором биологических образцов в обеих группах проводили оценку уровня систолического и диастолического артериального давления, кроме того, изучали уровень выделения белка с мочой. Затем в аликвотах плазмы крови определяли значения МБГ и активность Na⁺/K⁺-ATФазы эритроцитов. После родоразрешения приготовленные гомогенаты плаценты, полученные от женщин обеих групп, подвергались заморозке и использовались для определения ангиогенных факторов — эндоглина и sFlt-1 — методом Вестерн-блоттинга. Подготовка образцов тканей плаценты как в первой, так и во второй фазе, а также колец грудной аорты проводили по ранее отработанной методике [11]. С целью оценки количества МБГ в плазме крови были использованы моноклональные анти-МБГ антитела 4G4. Для определения количества эндоглина и sFlt-1 применяли вестерн-блоттинг с использованием коммерческих наборов специфических антител. Статистическая обработка данных проводилась методами непараметрического анализа с использованием прикладных пакетов программ GraphPad Instat and GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., США) и MS Office 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ

У животных на фоне введения в течение 1 недели 1,8 % раствора натрия хлорида (вторая и третья группы) отмечено статистически достоверное увеличение уровня систолического артериального давления. При этом в группе контроля (первая) на фоне обычной диеты оно составило 107 ± 2 мм рт. ст. Во второй группе при формировании экспериментального преэклампсия-подобного состояния его уровень увеличился и составил 117 ± 2 мм рт. ст. (p < 0,05). Установлено, что введение антител к МБГ (третья группа) обеспечивало значимое уменьшение систолического артериального давления до значения 93 ± 3 мм рт. ст., что достоверно отличалось от его уровня как у крыс первой группы (p < 0,05), так и второй (p < 0,01).

При изучении уровня протеинурии выявлено, что ее наименьшие показатели определяются у животных контрольной группы с обычной беременностью на фоне стандартной диеты. При этом она составила 15 ± 2 мг/сут. Во второй группе при использовании гиперсолевой диеты отмечалось существенное повышение уровня протеинурии до 24 ± 1,5 мг/сут (p < 0,05). Использование антител к МБГ (третья группа) не оказывает влияния на суточное выделение белка с мочой, которое достигает в данном случае 27 ± 2 мг/сут (p < 0,05).

Во второй группе при формировании экспериментального преэклампсия-подобного состояния уровень МБГ в плазме крови существенно увеличивался. Так, у животных первой контрольной группы на фоне потребления обычного количества соли он соответствовал 0,49 ± 0,11 нмоль/л, а во второй выборке с преэклампсия-подобным состоянием он увеличивался до 1,54 ± 0,34 нмоль/л (p < 0,05). При этом, проведенные нами ранее исследования указывают, что введение специфических антител к МБГ способно понизить этот показатель [10]. Общие данные исследованных показателей отображены на рис. 1.

 

Рис. 1. Уровень систолического артериального давления (а), суточной протеинурии (b) и МБГ в плазме крови (c) в экспериментальных группах. К — группа крыс с обычной диетой (первая, контроль); ППСAb(–) — группа крыс с преэклампсия-подобным состоянием (вторая), которым не вводили антитела к МБГ; ППСAb(+) — группа крыс с преэклампсия-подобным состоянием, которым вводили антитела к МБГ (третья)

Fig. 1. The level of systolic blood pressure (a), daily proteinuria (b) and MBG in blood plasma (c) in the experimental groups. C – group of rats with a normal diet (first, control); PLSAb(–) – group of rats with preeclampsia-like condition (second), which were not injected with antibodies to MBG; PLCAb(+) – group of rats with preeclampsia-like condition, which were injected with antibodies to MBG (third)

 

При изучении выделенных образцов тканей плаценты было установлено, что при формировании преэклампсия-подобного состояния в них наблюдается значительное увеличение содержания антиангиогенных факторов эндоглина и sFlt-1. В частности, в первой (контрольной) группе концентрация эндоглина составила 1,0 ± 0,15 у. е. Во второй группе в условиях гиперсолевой диеты его значение увеличивалось до 6,1 ± 0,4 у. е. (p < 0,01), а в третьей группе при введении антител к МБГ — до 6,4 ± 0,3 у. е. (p < 0,01). Изучение количества sFlt-1 позволило установить, что в контрольной (первой) группе его содержание составляет 1,0 ± 0,15 у. е. При индукции преэклампсия-подобного состояния оно увеличивается до 2,8 ± 0,3 у. е. (p < 0,05). Введение антител к МБГ также не оказывает влияния на данный показатель. Величина содержания sFlt-1 в третьей группе составила при этом 2,7 ± 0,3 у. е. (p < 0,05). Похожие данные были получены при исследовании образцов колец грудной аорты. Так, установлено, что уровень sFlt-1 в них в контрольной группе составил 1,0 ± 0,15 у. е. В группах на фоне развития экспериментального преэклампсия-подобного состояния он был значительно выше и соответствовал 3,5 ± 0,3 у. е. во второй группе (p < 0,05) и 3,6 ± 0,4 у. е. в третьей (p < 0,05). Общие данные представлены на рис. 2.

 

Рис. 2. Уровень биологических факторов в плаценте и грудной аорте: a — содержание эндоглина в плаценте; b — содержание sFlt-1 в плаценте; c — содержание sFlt-1 в грудной аорте. К — группа крыс с обычной диетой (контроль); ППСAb(–) — группа крыс с преэклампсия-подобным состоянием, которым не вводили антитела к МБГ; ППСAb(+) — группа крыс с преэклампсия-подобным состоянием, которым вводили антитела к МБГ

Fig. 2. The level of biological factors in the placenta and thoracic aorta: a – the content of endoglin in the placenta; b – the content of sFlt-1 in the placenta; c – the content of sFlt-1 in the thoracic aorta. C – group of rats with a normal diet (control); PLCAb(–) – group of rats with a preeclampsia-like condition that was not injected with antibodies to MBG; PLCAb(+) – group of rats with a preeclampsia-like condition that was injected with antibodies to MBG

 

При выполнении второй фазы исследования у всех пациенток с преэклампсией было отмечено увеличение уровня артериального давления. При этом, в контрольной группе систолическое артериальное давление составило 112 ± 2 мм рт. ст. В то же время в основной выборке пациенток с преэклампсией этот показатель достигал 150 ± 4 мм рт. ст. Полученные различия были статистически достоверны (p < 0,001). Величина диастолического артериального давления при преэклампсии также повышалась и составила 99 ± 2 мм рт. ст. В контрольной группе женщин с нормальной беременностью его величина соответствовала 72 ± 2 мм рт. ст. Данные значения также имели достоверное различие (p < 0,001).

У пациенток с преэклампсией отмечен клинически значимый уровень протеинурии. Так, в данной группе средний уровень выделения белка с мочой в сутки составил 2,12 ± 0,46 г/л. В то же время в контрольной группе белок в моче у части пациенток не обнаруживался, либо его значения не достигали клинически значимых величин. Средний уровень протеинурии в выборке женщин с физиологической беременностью составил 0,08 ± 0,04 г/л (p < 0,01).

Повышение уровня артериального давления и выделение белка с мочой у пациенток с преэклампсией наблюдалось на фоне повышения концентрации МБГ в плазме крови. Так, его уровень у женщин с физиологической беременностью составил 0,9 ± 0,06 нмоль/л. В то же время при преэклампсии этот показатель был достоверно выше и достигал 1,7 ± 0,07 нмоль/л (p < 0,001).

Повышение количества МБГ сопровождалось закономерным уменьшением активности Na⁺/K⁺-ATФазы эритроцитов. Так, в случае физиологической беременности ее уровень составил 3,11 ± 0,1 мкмоль Фн/мл в час, а при развитии преэклампсии это значение соответствовало 1,44 ± 0,08 мкмоль Фн/мл в час или 46,3 % величины в группе контроля (p < 0,001). При этом обработка образцов плазмы крови, полученных от женщин с преэклампсией, антителами к МБГ 3E9 mAbs приводила к существенному повышению уровня активности Na⁺/K⁺-ATФазы до 2,31 ± 0,19 мкмоль Фн/мл в час или 74,3 % контрольного показателя. Это значение достоверно отличалось от величины, полученной из образцов плазмы пациенток, при отсутствии антител к МБГ (p < 0,01).

Корреляционный анализ, проведенный с применением непараметрического коэффициента Спирмена, позволил установить наличие сильной прямой достоверной связи между повышением уровня МБГ в плазме крови и увеличением уровня систолического артериального давления (r_s = 0,84, p < 0,05). Аналогичная корреляция установлена при сравнении изменения уровня диастолического артериального давления и уровня МБГ (r_s = 0,84, p < 0,05). Увеличение как систолического, так и диастолического артериального давления коррелировало с изменением активности Na⁺/K⁺-ATФазы эритроцитов (r_s = –0,60, p < 0,05). Между повышением уровня МБГ в плазме крови и падением активности Na⁺/K⁺-ATФазы эритроцитов также существует сильная достоверная обратная корреляционная связь (r_s = –0,72, p < 0,05). Общие сведения исследованных показателей клинического исследования представлены в таблице.

 

Изменение уровня исследованных клинико-лабораторных показателей в обследованных группах пациенток, M ± S Changes in the level of clinical and laboratory parameters studied in the examined groups of patients, M ± S
Показатели / Indicators	Физиологическая беременность (n = 14) / Physiological pregnancy (n = 14)	Преэклампсия (n = 16) / Preeclampsia (n = 16)
Систолическое артериальное давление, мм рт. ст. / Systolic blood pressure, mm Hg	112 ± 2	150 ± 4
Диастолическое артериальное давление мм рт. ст. / Diastolic blood pressure, mm Hg	72 ± 2	99 ± 2
Уровень суточной протеинурии, г/л / The level of daily proteinuria, g/l	0,08 ± 0,04	2,12 ± 0,46
Уровень МБГ в плазме крови, нмоль/л / MBG level in blood plasma, nmol/l	0,9 ± 0,06	1,7 ± 0,07
Активности Na+/K+-ATФазы эритроцитов мкмоль Фн/мл в час (% контрольной величины) / Activity of Na+/K+-ATPase of erythrocytes mmol Fn/ml per hour (% control value)	3,11 ± 0,1	Без 3E9 mAbs / Without 3E9 mAbs	С 3E9 mAbs / With 3E9 mAbs
		1,44 ± 0,08 (46,3)	2,31 ± 0,19 (74,3)
Примечание. МБГ — маринобуфагенин. Note. MBG – marinobufagenin

 

Исследование содержания в плаценте двух антиангиогенных факторов — эндоглина-1 и sFLT-1 позволило установить существенное нарастание содержания обоих веществ в исследованных образцах при формировании преэклампсии. В частности, при физиологической беременности концентрация эндоглина-1 составила 1,0 ± 0,07 у. е., а в группе с преэклампсией данный показатель был достоверно статистически выше и достигал 2,1 ± 0,15 у. е. (p < 0,001).

Такие же изменения были установлены и при исследовании содержания sFLT-1. При этом в группе женщин, имеющих физиологическую беременность, его содержание в плаценте составило 1,0 ± 0,11 у. е. В то же время при преэклампсии данный фактор наблюдался в более высокой концентрации — 2,3 ± 0,15 у. е. Полученные отличия имели статистически достоверный характер (p < 0,001). Сведения о характере изменений антиангиогенных факторов представлены на рис. 3.

 

Рис. 3. Уровень содержания эндоглина-1 (a) и sFLT-1 (b) в плаценте обследованных групп пациенток. К — группа контроля, физиологическая беременность; ПЭ — основная группа, преэклампсия. ** Достоверные различия между группой К и ПЭ, р < 0,001

Fig. 3. The level of endothelin-1 (a) and sFLT-1 (b) in the placenta of the examined groups of patients. С – control group, physiological pregnancy; PE – main group, preeclampsia. ** Significant differences between group K and PE, р < 0.001

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Таким образом, при проведении экспериментальных исследований установлено, что формирование преэклампсия-подобного состояния сопровождается повышением уровня антиангиогенных факторов эндоглина-1 и sFLT-1 в тканях плаценты и в грудной аорте. Эти изменения возникают на фоне существенного повышения концентрации МБГ в плазме крови и сопровождаются развитием классических клинических проявлений этого синдрома, таких как повышение артериального давления и возникновение значимой протеинурии. Данные нарушения находят свое подтверждение и при проведении клинических исследований. В частности, у пациенток с преэклампсией выявлено значимое повышение содержания эндоглина-1 и sFLT-1 в плаценте. Уровень МБГ плазмы крови также существенно повышался. При этом установлены значимые корреляции между его изменением и повышением артериального давления. Повышение количества антиангиогенных факторов провоцирует развитие ишемической плацентарной недостаточности вследствие нарушения процесса инвазии трофобласта в материнские сосуды и невозможности полноценного ремоделирования последних в этих условиях. Эти нарушения усугубляются значимым повышением содержания в плазме крови МБГ, что приводит к снижению активности Na⁺/K⁺-ATФазы. Такой механизм подтвержден нами в клиническом исследовании. В результате наблюдается увеличение внутриклеточного содержания натрия и, как следствие, — активация Na⁺-Ca⁺⁺-обмена и последующее усугубление вазоконстрикции с нарастанием ишемизации тканей [9, 12]. По нашим данным, формирующиеся нарушения носят комплексный характер патогенеза, предусматривающий участие нескольких биохимических каскадов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На фоне развития преэклампсии наблюдается сочетанное повышение содержания МБГ в плазме крови и антиангиогенных факторов эндоглина-1 и sFLT-1 в плаценте, что свидетельствует о комплексном характере патогенеза наблюдающихся симптомов. Полученные при клинических наблюдениях результаты полностью подтверждаются данными, установленными в ходе экспериментального исследования при моделировании преэклампся-подобного состояния.

Работа была поддержана грантом № 18-15-00222 «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Авторы благодарят за методологическую поддержку исследования А.Я. Багрова и Н.И. Агалакову.

Об авторах

Виталий Анатольевич Резник

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автор, ответственный за переписку.
Email: vitaliy-reznik@mail.ru

канд. мед. наук, доцент, главный врач по акушерству и гинекологии

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Олегович Иванов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: doivanov@yandex.ru

д-р мед. наук, профессор, ректор

Россия, Санкт-Петербург

Николай Николаевич Рухляда

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: nicolasr@mail.ru

д-р. мед. наук, профессор, зав. кафедрой акушерства и гинекологии

Россия, Санкт-Петербург

Наталья Игоревна Тапильская

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: tapnatalia@yandex.ru

д-р. мед. наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии

Россия, Санкт-Петербург

Иван Александрович Ершов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: ershov@yandex.ru

клинический ординатор кафедры акушерства и гинекологии

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы