Использование клеточных технологий при лечении детей с врожденными расщелинами неба

Полный текст

Введение

Стволовые клетки — недифференцированные клетки, которые способны самообновляться, делиться посредством митоза и дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях. Они широко используются для разработки новых клеточных биомедицинских технологий.

Ученые А.А. Максимов и А.Я. Фриденштейн открыли два вида стволовых клеток: гемопоэтические стволовые клетки — предшественники клеток крови и мезенхимальные стволовые (или стромальные) клетки — долгоживущие и редко делящиеся стволовые клетки, которые постоянно циркулируют в кровотоке.

Мезенхимные стромальные клетки (МСК) успешно применяются при лечении и профилактике различных заболеваний [1]. Использование МСК — одно из самых перспективных направлений развития современной медицины. Значительное количество научных фактов свидетельствует об эффективности применения МСК при целом ряде тяжелых заболеваний, в том числе челюстно-лицевой области (ЧЛО) и опорно-двигательного аппарата. Остеогенная дифференцировка МСК предполагает способность данных клеток «развиваться» в остеобласты, что определяет перспективы их применения для обеспечения репаративной регенерации костной ткани, в том числе для лечения несовершенного остеогенеза. Для индукции остеогенной дифференцировки МСК в культуральную среду добавляют дексаметазон, аскорбиновую кислоту и β-глицерофосфат. Дифференцировка МСК в остеобласты подтверждается появлением мРНК остеокальцина, cdfa1, повышением активности щелочной фосфатазы, наличием внеклеточных преципитатов солей кальция [2–5].

Для получения МСК чаще всего используют следующие донорские зоны: костный мозг (основной источник) и жировую ткань, которая является наиболее доступным биологическим материалом. МСК, полученные из жировой ткани, эффективно дифференцируются в клетки костной ткани, стимулируют рост сосудов благодаря секреции фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), что обеспечивает большую их эффективность.

Твердое и мягкое небо — структуры, которые разделяют ротовую и носовую полость. Формирование неба происходит в эмбриональном периоде на 8–15-й неделе эмбрионального развития плода. При формировании врожденной расщелины неба возникают тяжелые анатомические и функциональные нарушения, связанные с сообщением ротовой и носовой полости, нарушением функции небно-глоточного кольца. Происходит нарушение жизненно важных функций дыхания, питания, речеобразования. Задачи хирургического лечения при врожденных расщелинах неба — разобщение ротовой и носовой полости.

Одна из проблем пациентов с полными односторонними и двусторонними расщелинами неба — отсутствие костной ткани и врожденное недоразвитие верхней челюсти в области щелей альвеолярного отростка. В настоящее время наиболее популярными способами альвеолопластики являются методики с использованием костных аутотрансплантатов из гребня подвздошной кости, реберных аутотрансплантатов. Однако результаты этих оперативных вмешательств не всегда удовлетворительные и могут привести к формированию изъянов переднего отдела неба, ороназальных фистул.

Для лечения детей с врожденной патологией ЧЛО (врожденными расщелинами губы и неба) применяются МСК при проведении операций по закрытию изъянов твердого неба, а также при закрытии щелей альвеолярного отростка верхней челюсти в условиях ее врожденного недоразвития [6]. Недостаток кости представляет собой проблему, с которой сталкивается врач если возникает необходимость восстановления зубного ряда или структур лица. Целостность альвеолярного отростка верхней челюсти играет огромную роль для имплантации и восстановления зубного ряда, а также сформированная кость служит опорой для основания крыла носа, что значительно улучшает эстетический результат лечения детей с врожденными расщелинами губы и неба.

Материалы и методы

Для изучения влияния МСК на формирование костной ткани у детей с различными формами расщелин неба были отобраны 6 пациентов (рис. 1, 2). Один пациент наблюдался с врожденной срединной расщелиной неба, 2 пациента — с врожденными полными односторонними расщелинами неба, 3 пациента — с полными врожденными двусторонними расщелинами неба. Возраст пациентов составил от 2 до 4 лет. Все дети наблюдались врачами клиники с рождения, им проводилось комплексное хирургическое и ортодонтическое лечение. Критериями выбора сроков хирургического лечения были общее соматическое здоровье пациентов, удовлетворительное состояние зубочелюстной системы, отсутствие деформации альвеолярной дуги.

 

Рис. 1. Пециентка Х., 6 мес., диагноз: «Врожденная двусторонняя расщелина верхней губы и неба»

 

Рис. 2. Пациентка Х., 2 года 6 мес. После первого этапа хирургического лечения — операции хейлоринопластики

 

Всем пациентам (n = 6) проводили щадящую одномоментную уранопластику с мезофарингоконстрикцией. Мы использовали методику щадящей уранопластики, которая позволяет в один этап сформировать анатомически правильное полноценное в функциональном отношении небо при лечении расщелины любой формы (патент на изобретение № 2202965). Детям с полными односторонними и двусторонними расщелинами неба (n = 5) одновременно выполняли закрытие щели альвеолярного отростка верхней челюсти.

Необходимым условием получения биологического материала было наличие информированного согласия доноров и пациентов. Все пациенты дали согласие на участие в исследовании и обработку персональных данных. Для проведения исследования было получено разрешение локального этического комитета.

Мы использовали аутологичные стромальные клетки, полученные из собственной жировой ткани у 4 пациентов, и аллогенные МСК из пупочного канатика доноров у 2 пациентов. МСК выделяли из жировой ткани и пупочного канатика.

Аллогенные МСК периваскулярного пространства пупочной вены (Покровский банк стволовых клеток, СПб, Россия) были получены при неосложненных родах. Транспортировку из родильных домов Санкт-Петербурга осуществляли в стерильном контейнере с 1 % раствором смеси пенициллина, стрептомицина и фунгизона в физиологическом растворе. Пупочную вену канатика промывали раствором Версена, заполняли 0,2 % раствором коллагеназ I и IV типов в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), клеммировали с двух сторон и инкубировали в течение 1 ч при 37 °C. Полученную взвесь клеток отмывали от фермента центрифугированием (400 g, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100–400 тыс. кл/см2. Далее просвет вены повторно заполняли раствором коллагеназ, клеммировали и повторяли описанные выше шаги (патент РФ № 2620981). Селекцию МСК осуществляли на основе их способности к адгезии и пролиферации. Все образцы тестировали на отсутствие ВИЧ 1, 2, гепатиты B, C; сифилис, CMV вне зависимости от данных обследования матери. Также проводили анализ на бактериальную и грибковую контаминацию биологического материала и кариотипирование исходного образца.

МСК первичных культур выращивали в питательной среде AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell media (HyClone, США), содержащей 10 % заменитель сыворотки AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell Supplement (HyClone), 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, при 37 °C в атмосфере 5 % СО2 и 5 % (условия гипоксии) О2 с использованием мультигазовых инкубаторов (BBD 6220, Thermo Scientific, США). Смену среды проводили через 3 суток после эксплантации. По достижении 70–80 % конфлюентности монослоя МСК пересевали (пассировали) при плотности 1000 кл/см2 и культивировали далее. Всего в процессе культивирования допускалось не более 4 пересевов (пассажей). За три дня до введения клеток пациенту культуральную среду в первичной культуре заменяли на так называемую xeno-free, no animal components (без ксеногенных материалов, без животных компонентов) среду StemPro® MSC SFM XenoFree Kit (Life Technologies, США). Перед выдачей пациенту материал повторно тестировали на инфекционные агенты, кариотипировали и иммунофенотипировали методом проточной цитометрии — определяли процентное содержание МСК в образце. Использовали только образцы с содержанием МСК не менее 98 %. В день введения клетки (25 млн) снимали с подложки xeno-free, no animal components заменителем животного трипсина — рекомбинантным трипсином Trypsin recombinant (BioInd, Израиль), инактивировали трипсин 1 % раствором альбумина (Baxter) в изотоническом растворе NaCl, отмывали центрифугированием и ресуспендировали в 3 мл изотонического раствора NaCl.

При использовании аутологичных МСК за 3–4 недели до предполагаемой операции у пациентов проводили забор подкожно-жировой клетчатки из ягодичной области в количестве 3 см3 (рис. 3, 4). Ткань механически измельчали, затем инкубировали при 37 °C в 0,2 % растворе коллагеназ (тип I, IV, Sigma-Aldrich, США) в ФСБ. Диссоциированные клетки отмывали от фермента центрифугированием (400 g, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100–400 тыс. кл/см2. Образцы культивировали и анализировали так же, как описано выше для аллогенного материала.

 

Рис. 3. Этап забора жировой ткани из ягодичной складки

 

Рис. 4. Жировая ткань помещена в контейнер для транспортировки в банк стволовых клеток

 

В случае аутологичных трансплантаций использовали смесь МСК и полученных из них преостеоцитов (1 : 4,5 : 20 млн). Для получения преостеоцитов к культуре МСК (80–90 % конфлюентности) добавляли остеогенную среду, не содержащую животных компонентов (BioInd, Израиль), и культивировали без дополнительных пересевов 10 дней, сменяя среду каждые 3 дня. Ход дифференцировки контролировали методом ПЦР по появлению в образцах мРНК остеокальцина и сbfa1 и окрашиванием контрольных образцов на кальцификаты 2 % ализарином. В день трансплантации МСК и преостеоциты снимали с подложки, как описано выше, для аллогенного материала.

В качестве остеогенного матрикса, который заполняли стволовыми клетками, была выбрана мембрана «Биоматрикс» — декальцинированный материал: 100 % коллаген и костные сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) не менее 1,5 мг/см3. Это коллагеновый, полностью резорбируемый материал.

Остеогенный матрикс пропитывали мезенхимными стволовыми клетками и помещали в область костного дефекта (рис. 5, 6). Предварительно с помощью бор-машины удаляли компактную пластинку концевых отделов кости в области фрагментов альвеолярного отростка верхней челюсти или в области небных отростков верхней челюсти.

 

Рис. 5. Пропитывание остеогенного матрикса стволовыми клетками

 

Рис. 6. Матрикс, пропитанный стволовыми клетками, помещен в область дефекта альвеолярного отростка верхней челюсти

 

Контрольная группа пациентов составила 40 человек в возрасте 2–4 лет с такой же патологией. Оперативное лечение проводилось по аналогичной методике, но без применения МСК.

Обсуждение и результаты

Результаты лечения оценивались по трехбалльной шкале: хороший, удовлетворительный и неудовлетворительный. Критериями оценки были наличие послеоперационных осложнений, восстановление функции небно-глоточного кольца, разобщение ротовой и носовой полости, рентгенологические признаки формирования костной ткани в области дефекта верхней челюсти.

Хорошим результатом считалось отсутствие послеоперационных осложнений, восстановление функции небно-глоточного кольца, разобщение ротовой и носовой полости, рентгенологические признаки формирования костной ткани в области дефекта верхней челюсти.

Удовлетворительный результат — отсутствие послеоперационных осложнений, восстановление функции небно-глоточного кольца, разобщение ротовой и носовой полости.

Неудовлетворительный результат — формирование оростомы и отсутствие замыкания небно-глоточного кольца.

Для оценки формирования костной ткани в области диастаза применялась мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ) черепа. При использовании метода компьютерной томографии для визуального и количественного определения плотности структур применяется шкала ослабления рентгеновского излучения, получившая название шкалы Хаунсфилда (черно-белый спектр изображения). Диапазон единиц шкалы (денситометрических показателей, англ. Hounsfieldunits) составляет в среднем от –1024 до +1024. 0 HU — средний показатель в шкале Хаунсфилда соответствует плотности воды, отрицательные величины шкалы соответствуют воздуху и жировой ткани, положительные — мягким тканям и более плотной костной ткани (рис. 7).

 

Рис. 7. Шкала Хаунсфилда

 

У 6 пациентов, при лечении которых применялись МСК, был получен хороший результат. Было достигнуто полное разобщение ротовой и носовой полости. Восстановлена функция небно-глоточного кольца. При лечении детей с односторонними и двусторонними расщелинами неба восстановлена непрерывность альвеолярного отростка верхней челюсти (устранена щель преддверия полости рта). При рентгенологическом обследовании в отдаленные сроки после операции в области костного дефекта после применения клеточных технологий обнаружена ткань, по плотности соответствующая костной ткани (рис. 8, 9). Плотность по шкале Хаунсфилда колебалась от 65 до 110 HU.

 

Рис. 8. Компьютерная томография пациентов с двусторонними расщелинами альвеолярного отростка верхней челюсти до и после лечения с использованием мезенхимных стромальных клеток с двух сторон, после лечения плотность указывает на формирование костной ткани

 

Рис. 9. Компьютерная томография пациентов с двусторонними расщелинами альвеолярного отростка верхней челюсти до и после лечения с использованием мезенхимных стромальных клеток только справа. Слева сохраняется дефект между расщепленными участками альвеолярного отростка, а справа, где применялись мезенхимные стромальные клетки, дефект заполнен костной тканью

 

В контрольной группе (n = 40) формирования костной ткани в области дефекта не наблюдалось ни в одном случае, что позволило расценить результат лечения как удовлетворительный (были получены удовлетворительные результаты потому, что в области дефекта ткань по плотности не приближалась к костной) (рис. 10).

 

Рис. 10. Компьютерная томография пациента из контрольной группы после операции. Костная ткань не формируется

 

Мы оценивали как непосредственные, так и отдаленные результаты лечения детей с врожденными расщелинами неба.

Достоверных различий в сроках заживления раны и течении послеоперационного периода не было.

Заключение

Тканевая инженерия помогает в лечении наиболее тяжелой патологии челюстно-лицевой хирургии — врожденной патологии ЧЛО. Открываются хорошие перспективы использования МСК для оперативного лечения обширных дефектов лицевого скелета. Эти возможности связаны с высокой регенеративной активностью трансплантируемых стволовых клеток за счет стимулирующих воздействий на ангиогенез и способности дифференцироваться в остеобласты и хондробласты для восстановления костной и хрящевой ткани.

Для достоверного изучения регенераторных способностей тканевой инженерии с целью восстановления костных дефектов необходимо последовательно проводить доклинические и клинические испытания под контролем лабораторных и морфологических методов исследования, позволяющих в динамике оценивать степень выраженности и направленность регенераторных процессов.

Информация о финансировании и конфликте интересов

Исследование осуществлено в рамках НИР при поддержке ФГБУ «НИДОИ им. Г.И. Турнера» Минздрава России.

Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Об авторах

Юлия Владимировна Степанова

ФГБУ «НИДОИ им. Г.И. Турнера» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: travmaortoped@mail.ru

канд. мед. наук, доцент, заведующая челюстно-лицевым отделением

Россия, 196603, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, ул. Парковая, дом 64-68

Маргарита Сергеевна Цыплакова

ФГБУ «НИДОИ им. Г.И. Турнера» Минздрава России

Email: travmaortoped@mail.ru

канд. мед. наук, доцент, старший научный сотрудник челюстно-лицевого отделения

Россия, 196603, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, ул. Парковая, дом 64-68

Анна Сергеевна Усольцева

ФГБУ «НИДОИ им. Г.И. Турнера» Минздрава России

Email: travmaortoped@mail.ru

врач челюстно-лицевого отделения

Россия, 196603, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, ул. Парковая, дом 64-68

Натэла Иосифовна Енукашвили

Покровский банк стволовых клеток; ФГБУ «Институт цитологии РАН»

Email: travmaortoped@mail.ru

канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории морфологии клетки Института цитологии РАН; руководитель отдела научных исследований и разработок, Покровский банк стволовых клеток

Россия, Санкт-Петербург; 194064, г. Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4

Варвара Владимировна Багаева

Покровский банк стволовых клеток

Email: travmaortoped@mail.ru

специалист отдела научных исследований и разработок

Россия, Санкт-Петербург

Михаил Георгиевич Семенов

ФГБОУ ВО «СЗГМУ им. И.И. Мечникова» Минздрава России

Email: travmaortoped@mail.ru

д-р мед. наук, профессор, зав. кафедрой челюстно-лицевой хирургии и хирургической стоматологии им. А.А. Лимберга

Россия, 195015, г. Санкт-Петербург, Кирочная ул., 41

Татьяна Валерьевна Мурашко

ФГБУ «НИДОИ им. Г.И. Турнера» Минздрава России

Email: travmaortoped@mail.ru

врач-рентгенолог

Россия, 196603, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, ул. Парковая, дом 64-68

Карина Геннадьевна Понамарева

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: travmaortoped@mail.ru

канд. мед. наук, доцент кафедры стоматологии факультета стоматологии и медицинских технологии

Россия, 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9

Список литературы

Дополнительные файлы