Иммуногистохимическая диагностика макрофагов, ассоциированных с опухолью, у пациентов с мышечно-инвазивным раком мочевого пузыря после радикальной цистэктомии

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Злокачественные новообразования мочевыделительной системы занимают лидирующие позиции в структуре онкологических заболеваний во всем мире. Серьезной проблемой является рак мочевого пузыря (РМП). Согласно последним данным, во всем мире РМП ежегодно становится причиной около 213 000 смертей. Более того, прослеживается тенденция к ежегодному росту заболеваемости, а в настоящее время по данному показателю РМП находится на 10-м месте [1]. Такая ситуация обусловлена, с одной стороны, увеличением онконастороженности населения и качества диагностических процедур, а с другой — приобретением РМП статуса полиэтиологического заболевания с повышением заболеваемости у лиц разных возрастных категорий. РМП подразделяется на немышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (НМИРМП) и мышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (МИРМП), при этом критерием диагностики формы злокачественного процесса выступает отсутствие или наличие инвазии в мышечный слой мочевого пузыря. Данная классификация активно используется практикующими онкологами и урологами по причине кардинальных отличий в схемах лечения в зависимости от варианта РМП. Клиническая картина представленных форм также существенно различается. Для МИРМП, в отличие от НМИРМП, характерно быстрое прогрессирование, агрессивное течение с развитием регионарного и отдаленного метастазирования. В структуре РМП мышечно-инвазивная форма диагностируется примерно в 25 % случаев, а 5-летняя выживаемость составляет порядка 50 % [2].

Золотым стандартом лечения МИРМП и НМИРМП высокого риска выступает радикальная цистэктомия с тазовой лимфаденэктомией и предшествующей неоадъювантной химиотерапией на основе препаратов платины. Объем оперативного вмешательства у лиц мужского пола состоит в удалении единым блоком мочевого пузыря, паравезикальной клетчатки, предстательной железы и семенных пузырьков. Для женщин объем хирургического воздействия заключается в супралеваторной тазовой эвисцерации. Несмотря на радикальный принцип оперативного лечения и соблюдение принципов онкологической безопасности, рекомендуется применение неоадъювантной химиотерапии [3]. Для некоторых категорий пациентов при отсутствии эффекта от дооперативного лечения в последующем целесообразно назначение адъювантной химиотерапии [4]. К сожалению, эффективность радикальных методов лечения резко ограничена в долгосрочной перспективе и по данным мировой литературы не наблюдается существенного увеличения выживаемости за последние 30 лет [5]. По этой причине исследования в области прогнозирования выживаемости при МИРМП могут существенно улучшить отдаленные онкологические результаты. С этой целью оправдано применение биологических маркеров опухолевого процесса, напрямую влияющего на исход лечения. Стратификация пациентов по группам в зависимости от уровней биологических предикторов позволит персонифицированно подходить к лечению МИРМП.

За последние десятилетия накоплено много знаний в сфере молекулярной биологии злокачественных процессов. Определенный интерес в данной области представляет изучение микроокружения опухолей различных локализаций. Одно из ключевых мест в данной цитологической структуре занимают макрофаги, ассоциированные с опухолью (МАО). МАО, широко представленные в микроокружении солидных опухолей, обладают способностью менять свои функции в зависимости от поступающих к ним сигналов [6–8]. В связи с этим МАО могут иметь два различных функциональных состояния: M1-фенотип и M2-фенотип [9]. Согласно имеющимся на сегодняшний день данным, при инициации неопластического процесса макрофаги, окружающие патологический очаг, обладают М1-фенотипом. При этом они активируются за счет влияния интерферона гамма, интерлейкина-12, интерлейкина-23 [9] и запрограммированы на элиминацию опухолевых клеток, индукцию Th-1-иммунного ответа. Приобретая провоспалительный и противоопухолевый фенотип, макрофаги М1 участвуют в местных иммунных реакциях в ответ на неопластический процесс [10]. По мере прогрессии злокачественной опухоли происходит трансформация макрофагов М1 в макрофаги М2, имеющих альтернативный путь активации за счет онкогенных сигналов [11]. Такие макрофаги обладают противовоспалительной и проопухолевой активностью, индуцируют Th-2-иммунный ответ, оказывают иммуносупрессивное действие. Таким образом макрофаги М2 способствуют уклонению опухоли от иммунного надзора и обеспечивают дальнейшее распространение неопластического процесса [12]. Активация множества сигнальных путей в микроокружении опухолей оказывает влияние и на МАО, в связи с чем происходит постоянная трансформация фенотипа М1 в М2. По этой причине макрофаги М2 являются самыми распространенными представителями МАО в микроокружении опухолей. Смена фенотипов характеризует МАО как динамически меняющийся компонент микроокружения опухолей, что можно использовать для оценивания и прогнозирования злокачественного процесса [13]. МАО постоянно секретируют различные цитокины, хемокины (PD-L1, Arg-1, интерлейкин-10 и TGF-β) и экспрессируют на своей поверхности специфические рецепторы — CD68, CD163 [14–18]. Наиболее достоверным методом диагностики МАО выступает определение уровней поверхностных антигенов (CD68, CD163) с помощью иммуногистохимического анализа [19, 20].

Цель исследования — изучение взаимосвязей между уровнями МАО у пациентов с установленным диагнозом МИРМП после радикальной цистэктомии с тазовой лимфаденэктомией и показателями послеоперационной выживаемости.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование было проведено на базе Клиники ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» в период с 01.05.2021 по 01.07.2023. Все пациенты, принимавшие участие в исследовании, были проинформированы и подписали добровольное согласие. Исследование было одобрено локальным независимым этическим комитетом ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России от 15.06.2021 № 4595–07. В исследовании принимали участие 66 пациентов с установленным на основании цистоскопии/ТУР-биопсии диагнозом МИРМП. Данных о наличии отдаленных метастазов не получено ни у одного пациента. Количество мужчин в опытной группе — 42 (63,6 %), женщин — 24 (36,4 %). Средний возраст пациентов — 68,3 ± 2,4 года. Стадии онкологического процесса и степени дифференцировки опухоли отражены в табл. 1.

 

Таблица 1. Характеристика опухолей мочевого пузыря у пациентов до радикальной цистэктомии (n = 66)

Table 1. Characteristics of bladder tumors in patients before radical cystectomy (n = 66)

Стадия заболевания	Количество пациентов, n
Клиническая стадия
сT2	36 (54,5 %)
сT3	18 (27,3 %)
сT4	12 (18,2 %)
Степень дифференцировки (биопсия)
G1	8 (12,1 %)
G2	32 (48,5 %)
G3	26 (39,4 %)

 

Неоадъювантная химиотерапия на основе цисплатина применена у 50 (75,8 %) пациентов. Всем пациентам была показана радикальная цистэктомия с обязательным этапом тазовой лимфаденэктомии. Границей лимфодиссекции выступала бифуркация аорты, а при выраженном поражении лимфатических узлов диссекцию производили до уровня отхождения нижней брыжеечной артерии. Операционный материал в дальнейшем отправляли на гистологическое исследование с целью определения стадии злокачественного новообразования в соответствии с классификацией pTNM и степени дифференцировки согласно классификации ВОЗ (1973). Материал фиксировали в 1 % растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм изготавливали на микротоме фирмы Leica (Германия) и окрашивали гематоксилином и эозином. В дальнейшем проводили обзорный морфологический анализ с заключением о стадии и степени дифференцировки опухоли. Иммуногистохимический анализ выполняли на аппарате Bond-maX (Австралия). С этой целью использовали серийные парафиновые срезы толщиной 5 мкм с применением стрептавидин-биотинового метода. Для исследования применяли коммерческие моноклональные антитела CD68 и CD163, являющиеся маркерами макрофагов. После проведения реакции с моноклональными антителами оцифровку изображений микропрепаратов производили на сканере фирмы Leica Aperio (Германия). Для оценки экспрессии использовали пакет программного обеспечения Digital Pathology. Интенсивность экспрессии оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3 с учетом выраженности окрашивания: 0 — отсутствие реакции; 1 — слабая реакция; 2 — умеренная реакция; 3 — сильная реакция.

После оперативного лечения по истечении 24 мес. проводили анализ выживаемости с определением уровней общей, опухолеспецифической и безрецидивной выживаемости и с построением графиков Каплана – Майера. Для статистического анализа использовано программное обеспечение Statistica 10.0 (StatSoft Inc., США). Сравнение опытных групп проводили с помощью U-критерия Манна – Уитни и t-критерия Стъюдента. Для сравнения кривых выживаемости использовали логарифмический ранговый критерий. Уровень значимости при обработке статистических данных считали критическим при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Операционный материал всех пациентов был подвергнут обзорному патоморфологическому исследованию. Стадии и степени дифференцировки опухолевого процесса отражены в табл. 2.

 

Таблица 2. Характеристика опухолей мочевого пузыря у пациентов после патоморфологического исследования (n = 66)

Table 2. Characteristics of bladder tumors in patients after pathomorphological examination (n = 66)

Показатель	Количество пациентов, n
Стадия рака мочевого пузыря по результатам гистологии
pT1	8 (12,1 %)
pT2	30 (45,5 %)
pT3	16 (24,2 %)
pT4	12 (18,2 %)
Степень дифференцировки (операционный материал)
pG1	12 (18,2 %)
pG2	28 (42,4 %)
pG3	26 (39,4 %)
Регионарные лимфатические узлы
pN0	22 (33,3 %)
pN+/pNx	44 (66,7 %)

 

После иммуногистохимического исследования у пациентов определен уровень экспрессии мембранных антител. По результатам пациентов распределили на две группы по интенсивности окрашивания для CD68 и для CD163: 1-я группа — отсутствие/низкий уровень экспрессии; 2-я группа — умеренный/высокий уровень экспрессии. Полученные данные отражены в табл. 3. Пациенты с высоким уровнем экспрессии CD163 также имели высокий уровень экспрессии CD68 (p < 0,05), но 2 пациента с высоким уровнем экспрессии CD68 имели низкий уровень CD163.

 

Таблица 3. Уровень экспрессии мембранных антител CD68 и CD163

Table 3. Expression levels of membrane antibodies CD68 and CD163

Параметр	1-я группа	2-я группа	p-значение
CD68
Количество пациентов, n	30 (42,4 %)	36 (57,6 %)	<0,05
Интенсивность экспрессии	0,7 ± 0,3	2,4 ± 0,6	<0,05
Неоадъювантная химиотерапия, n	16 (32 %)	34 (68 %)	<0,05
CD163
Количество пациентов, n	32 (45,5 %)	34 (54,5 %)	<0,05
Интенсивность экспрессии	0,6 ± 0,4	2,3 ± 0,7	<0,05
Неоадъювантная химиотерапия, n	18 (36 %)	32 (64 %)	<0,05

 

По истечении 24 мес. после проведенных радикальных операций анализировали показатели общей, опухолеспецифической и безрецидивной выживаемости с построением кривых Каплана – Майера в исследуемых группах. Результаты выживаемости отражены на рис. 1–6.

 

Рис. 1. Общая выживаемость и уровни экспрессии CD68, p = 0,0096

 

Рис. 2. Общая выживаемость и уровни экспрессии CD163, p = 0,0033

 

Рис. 3. Опухолеспецифическая выживаемость и уровни экспрессии CD68, p = 0,028

 

Рис. 4. Опухолеспецифическая выживаемость и уровни экспрессии CD163, p = 0,022

 

Рис. 5. Безрецидивная выживаемость и уровни экспрессии CD68, p = 0,025

 

Рис. 6. Безрецидивная выживаемость и уровни экспрессии CD163, p = 0,037

 

По результатам анализа выявлено достоверное снижение выживаемости в группах с высокими показателями экспрессии CD68 и CD163 (p < 0,05). Два пациента, имевших высокие уровни CD68 и низкие уровни CD163, не имели рецидивов и выбыли из под наблюдения по причине смерти. В исследуемых группах наблюдается достоверно значимая корреляция между высокими уровнями CD68 и CD163 (p < 0,05). Таким образом, CD68 и CD163 могут выступать в качестве независимых маркеров прогнозируемой выживаемости у пациентов с МИРМП после радикальной цистэктомии. Полученные данные свидетельствуют о ценности применения маркеров макрофагов, ассоциированных с опухолью, для оценивания ожидаемой послеоперационной выживаемости. Стоит также учитывать, что на показатели выживаемости могут влиять сопутствующие заболевания, диагностированные до оперативного лечения, и проведенная в послеоперационном периоде адъювантная химиотерапия. В исследуемых группах не было пациентов, получавших адъювантную химиотерапию. С другой стороны, неоадъювантную химиотерапию получили 50 (75,8 %) пациентов, и она также существенно влияет на показатели выживаемости. Распределение пациентов, получавших неоадъювантную химиотерапию, между группами не имело статистических значимых различий (p < 0,05), по этой причине влияние данного фактора на результаты анализа было незначительным. По результатам исследования наблюдается преобладание МАО у пациентов с худшей выживаемостью, что может быть обусловлено повышенным потенциалом макрофагов М2 и увеличенной проопухолевой активностью.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на серьезные достижения последних лет в методах хирургического лечения МИРМП прогноз для пациентов после радикальной цистэктомии остается практически неизменным [21]. Стратификация пациентов по группам риска необходима для определения вектора последующих лечебных и диагностических мероприятий. Перспектива использования биологических предикторов заключается также в прогнозировании ответа на неоадъювантную химиотерапию и определении показаний к адъювантному лечению [22]. Оценка прогнозируемой выживаемости может позволить более персонифицированно подходить к выбору методов последующего лечения, что улучшит отдаленные онкологические результаты.

В исследовании M. Sun и соавт. [23] изучались уровни инфильтрации, поляризации МАО и их влияние на прогноз и ожидаемый ответ на адъювантную химиотерапию и терапию ингибиторами PD-L1 при МИРМП. Ученые обнаружили, что у пациентов с повышенным содержанием макрофагов M1 отмечался лучший ответ на иммунотерапию, в то время как инфильтрация макрофагами M2 потенциально способствовала иммунотерапевтической резистентности. Исследователи также отметили, что опухоли со значительной инфильтрацией МАО и М2-подобной конфигурацией характеризовались иммуносупрессией с обилием онкогенных иммунных клеток, иммуносупрессивных цитокинов. В другом крупном исследовании, проведенном H. Taubert и соавт. [24], изучалось прогностическое влияние уровней МАО с ответами на адъювантную химиотерапию и прогнозируемой выживаемостью у пациентов с МИРМП после радикальной цистэктомии. В работе для диагностики МАО применялись моноклональные антитела CD68, CD163 и CCL2. Авторы отметили высокую прогностическую значимость CD68 для стратификации пациентов по уровню ответов на химиотерапию с учетом стадии pT и pN. При этом высокие уровни МАО коррелировали с худшей выживаемостью, но лучшими ответами на адъювантную химиотерапию. F.J. Koll и соавт. [2] проанализировали взаимосвязи между уровнями МАО и инфильтрирующих опухоль иммунных клеток с выживаемостью и ответами на терапию у 101 пациента, оперированных в период с 2010 по 2020 г. В исследовании применялась мультиплексная иммуногистохимия и мультиспектральная визуализация. Для верификации МАО использовались антитела CD68 и CD163. Ученые отметили высокую корреляцию между уровнями CD68 и CD163, хотя некоторые клетки экспрессировали CD163 в отсутствие CD68. Повышенная инфильтрация МАО, высокие уровни CD68 и CD163 были связаны с худшей выживаемостью в исследуемых группах. Исследователи отметили перспективу использования МАО в качестве биологических предикторов, а также заявили о необходимости более точной характеристики МАО и поляризации М1/М2. Что касается рутинного применения иммуногистохимической диагностики MAO путем определения экспрессии CD68 и CD163 с помощью цифрового анализа, то авторы заявили о высокой надежности данного метода [2].

Полученные нами результаты соответствуют общемировой практике в данном направлении. У настоящего исследования имеется также ряд ограничений. Нами не были включены в опытную группу пациенты с имеющимися курсами адъювантной химиотерапии. По этой причине не оценивалось возможное прогностическое влияние уровней МАО на терапевтический ответ. Не учитывалось также распределение в опытных группах стадий по pTNM, наличии сопутствующих заболеваний, что могло повлиять на уровни МАО и выживаемость после оперативного лечения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное нами исследование свидетельствует о худших показателях выживаемости у пациентов с МИРМП после радикальной цистэктомии с высокими уровнями экспрессии CD68 и CD163. Наблюдается достоверная корреляция между данными маркерами МАО. Более подробная характеристика МАО позволит выявить подмножества макрофагов, которые имеют прогностическое значение и могут быть потенциальными мишенями при лечении РМП.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Личный вклад каждого автора: В.Н. Павлов — разработка дизайна исследования, редактирование текста рукописи; М.Ф. Урманцев — сбор материала, анализ полученных данных; М.Р. Бакеев — сбор материала, анализ полученных данных, написание текста рукописи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

Этический комитет. Протокол исследования был одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России (№ 4595-07 от 15.06.2021).

Информированное согласие на публикацию. Авторы получили письменное согласие пациентов на публикацию медицинских данных.

Об авторах

Валентин Николаевич Павлов

Башкирский государственный медицинский университет

Email: pavlov@bashgmu.ru
ORCID iD: 0000-0003-2125-4897
SPIN-код: 2799-6268

Академик РАН, д-р мед. наук, профессор, ректор, заведующий кафедрой урологии с курсом ИДПО

Россия, Уфа

Марат Фаязович Урманцев

Башкирский государственный медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: urmantsev85@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-4657-6625
SPIN-код: 3506-7753

канд. мед. наук, доцент кафедры урологии с курсом ИДПО, доцент кафедры онкологии с курсами онкологии и патологической анатомии

Россия, Уфа

Марат Радикович Бакеев

Башкирский государственный медицинский университет

Email: m.r.bakeev@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-4160-2820
Scopus Author ID: 57417396900

студент

Россия, Уфа

Список литературы

Дополнительные файлы