STUDY OF REINNERVATION PROCESS IN PATIENTS WITH 2 TYPEOF SPINAL MUSCULAR ATROPHY: CLINICAL EXPERIMENTAL STUDY

Abstract


Spinal muscle atrophy (SMA) of type 2 is an autosomal-recessive disease defined by a degenerative change in alpha-motor neurons of anterior horns. The disease is manifested in weakness of proximal muscles, pareses, respiratory disturbance and early death. Study of reinnervation process in patients with 2nd type of SMA can provide valuable information on a condition of adaptive mechanisms within the limits of neuron plasticity. According to electroneuromyography study in patients with 2nd type SMA reinnervation process is low intense. It was found out that concentration NGF (nerve growth factor) in serum of patients with 2nd type SMA is considerably higher than in control group. We studied the influence of blood serum of patients with 2 type SMA on growth neurites of sensory ganglia of 10-12 days old chicken embryos in organotypic culture. For the first time it was shown that blood serum of patients with 2nd type SMA dose-dependent inhibits of growth neurites of sensory ganglia. Apparently, neurite-inhibitory effect is caused by high concentration of neurotrophins in patient serum, due to that the reinnervation mechanisms in 2 type SMA patients are not so efficient.

Введение Спинальная мышечная атрофия (СМА) 2 типа - аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующееся дегенеративным изменением альфа-мотонейронов передних рогов спинного мозга. Заболевание проявляется слабостью проксимальной мускулатуры, парезами, дыхательной недостаточностью и ранней смертностью. Это заболевание относится к болезням двигательного неврона, при прогрессировании которых кроме денервационного процесса запускается механизм реиннервации денервированных мышечных волокон [1]. Восстановление утраченной функции может идти за счёт сохранившихся нервных волокон, причём последние начинают интенсивно ветвиться, направляясь к денервированным мышечным волокнам. Процесс реиннервации регулируется нейротрофическими пептидами, среди которых основную роль играет фактор роста нерва (ФРН) [2, 3]. Малочисленность нейрофизиологических и морфологических исследований реиннервационного процесса у больных со СМА диктует необходимость изучения механизмов реиннервации и раскрытия роли нейротрофических факторов в функционировании приспособительно-компенсаторного процесса. В настоящее время оценить активность денервационно-реиннервационных процессов возможно с помощью электронейромиографического исследования. Использование метода органотипической культуры ткани имеет ряд преимуществ: появляется возможность строго дозировать исследуемые воздействия, сохраняя при этом морфофункциональные связи, присущие целой ткани. Органные культуры являются более простыми, по сравнению с целым организмом, модельными системами, в которых становится возможным изучение роста и дифференцировки клеток в так называемом «чистом виде», т.е. исключив нервные и гуморальные влияния [4]. Таким образом, исследование действия тестируемых веществ в органотипической культуре ткани открывает перспективы выявления тонких молекулярных механизмов воздействия на клетки исследуемой ткани. Сенсорные нейроны спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов характеризуются высоким уровнем экспрессии высокоаффинных рецепторов к ФРН [5]. Именно в этот период эмбриогенеза сенсорные нейроны отвечают ростом нейритов на введение ФРН в питательную среду. ФРН в сенсорных нейронах увеличивает анаболическую активность, синтез нейротрансмиттеров, рост нейритов [6,7]. Изучение механизма нейротрофической регуляции денервационно-реиннервационного процесса в органотипической культуре ткани у больных СМА 2 типа может уточнить патогенез этого заболевания, и, возможно, откроет клиницистам новые дифференцированные подходы в лечении. Цель исследования - изучение денервационно-реиннервационного процесса у больных СМА 2 типа с помощью комплексного клинико-нейрофизиологического и лабораторно-экспериментального исследования в органотипической культуре ткани. Материалы и методы Проведено клинико-неврологическое и нейрофизиологическое (ЭНМГ, ЭМГ) обследование 10 больных СМА 2 типа. Электрофизиологическое исследование включало стимуляционную электронейромиографию и игольчатую электромиографию. Исследования выполнялись по общепринятому протоколу. Исследовали уровень фактора роста нерва в сыворотке крови иммуноферментным методом с использованием коммерческих иммуноферментных наборов RayBiotech, Inc. Пороговые величины определения ФРН были на уровне 14 пк/мл. Влияние действия сыворотки крови больных СМА 2 типа на рост нейритов сенсорных ганглиев оценивали с помощью метода органотипической культуры ткани. Исследовано 600 эксплантатов сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов, культивируемых в СО2-инкубаторе (Sanyo) в течение 3-х суток на подложках из коллагена в чашках Петри при 36,5°С и 5% СО2. Питательная среда содержала 45% раствора Хенкса, 40% среды Игла с добавлением инсулина (0.5 ед/мл), глюкозы (0.6%), глютамина (2 мМ), гентомицина (100 ед/мл), 5% куриного эмбрионального экстракта и 10% фетальной сыворотки коровы [8]. Контрольные эксплантаты культивировали в условиях питательной среды стандартного содержания. В экспериментальных чашках в культуральную среду добавляли сыворотку крови больных СМА 2 типа в различном диапазоне разведений. Для визуализации объектов использовали микроскоп «Axiostar Plus» («Carl Zeiss», Германия). Полученные изображения анализировали с помощью программы ImageJ. Работа выполнена на оборудовании ЦКП "Конфокальная микроскопия" Института физиологии им. И.П. Павлова РАН. Для количественной оценки роста эксплантатов применяли морфометрический метод. Индекс площади (ИП) рассчитывали как отношение площади эксплантата к площади центральной зоны [9]. Контрольное значение ИП принимали за 100%. В ходе исследования применяли следующие процедуры и методы статистического анализа: определение числовых характеристик переменных; оценку соответствия эмпирического закона распределения количественных переменных теоретическому закону нормального распределения по критерию Шапиро-Уилка; оценку влияния качественного фактора на дисперсию количественного показателя с использованием дисперсионного метода ANOVA, оценку силы и направления линейной связи между количественными показателями с использованием параметрического коэффициента корреляции Пирсона, нелинейной связи - с использованием коэффициента корреляции Спирмена. Описание количественных признаков выполнено с использованием среднего арифметического значения и стандартного отклонения. Нулевая статистическая гипотеза отвергалась при уровне значимости p<0,05. Статистический анализ осуществлялся с использованием пакета STATISTICA 8.0 (StatSoft®, Inc., USA). РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Обследованы 10 больных со спинальной мышечной атрофией 2 типа, из них 4 девочки и 6 мальчиков в возрасте от 10 до 14 лет. Двигательный дефект проявлялся с рождения. Генетический дефект был выявлен на длинном плече 5-ой хромосомы (в интервале между D5S629 и D5S557). Клинико-неврологическая картина представлена вялыми парезами рук и ног, с преобладанием процесса в проксимальных отделах, активные движения сохранялись лишь в дистальных отделах рук, мышцах шеи, мимической и дыхательной мускулатуры. Наблюдались генерализованные фибриляции и фасцикуляции мышц, выраженная диффузная мышечная гипотония. У 85% детей были выражены атрофии межреберных мышц с дыхательной недостаточностью и негрубыми бульбарными расстройствами. Изменения в костно-суставной системе были представлены выраженными контрактурами крупных суставов конечностей и кифосколиозом. Функции тазовых органов были сохранны. Нарушений чувствительности и интеллекта не выявлено. Все больные СМА 2 типа наблюдались в течение 3 лет, за этот период времени заболевание прогрессировало. При ЭМГ-исследовании в мышцах больных СМА регистрировались множественные потенциалы фибрилляций, позитивные острые волны. Снижение рекрутирования двигательных единиц и увеличение частоты их импульсации указывали на снижение количества функционирующих мотонейронов передних рогов спинного мозга. При максимальном мышечном напряжении частота импульсации двигательных единиц (ДЕ) резко повышена до десятков Гц (до 40-50 Гц по отдельным мышцам). Отсутствовали нормальные потенциалы двигательных единиц (ПДЕ), зарегистрированы только потенциалы сниженной амплитуды и длительности. При стимуляционной электронейромиографии скорости проведения по моторным волокнам нервов находились в пределах нормы или были слегка снижены. Снижение амплитуд М-ответов у больных СМА от умеренного до грубого отражали степень снижения количества функционирующих двигательных единиц. Результаты исследования сенсорного проведения - амплитуды потенциала действия нервов и скорости проведения - были в пределах нормы. Как известно, параллельно с процессом утраты α-мотонейронов при СМА запускаются процессы реиннервации, которые приводят к изменению параметров ПДЕ: формируются потенциалы увеличенной длительности и амплитуды (реиннервационные ПДЕ) [10, 11]. У обследованных больных не были выявлены достоверные реиннервационные потенциалы - это позволило нам предположить, что у данных пациентов процесс реиннервации недостаточно активно функционирует. Была выдвинута гипотеза, что процесс реиннервации не выражен вследствие сниженного синтеза ФРН у пациентов с этой патологией. Известно, что ФРН необходим для выживания и дифференцировки нейрональных клеток, он стимулирует рост аксонов и способствует их ветвлению [12]. Данные иммуноферментного анализа свидетельствуют о том, что концентрация ФРН (5141±801 пг/мл) в сыворотке крови больных СМА 2 типа статистически значимо (р<0,001) выше, чем в контрольной группе (399±58 пг/мл). Оценки концентрации ФРН в сыворотке крови контрольной группы находятся в диапазоне от 327 пг/мл до 462 пг/мл. Тогда как, у больных СМА 2 типа - в интервале от 4352пг/мл до 6273 пг/мл. Нами выявлено, что у больных СМА 2 типа в сыворотке крови имеет место превышение ФРН, следовательно, слабая реиннервация не связана с дефицитом ФРН. Для уточнения механизмов препятствующих реиннервации было проведено исследование влияния сыворотки крови больных СМА 2 типа на рост нейритов сенсорных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов. Через трое суток культивирования в контрольных и экспериментальных эксплантатах сенсорных ганглиев формируются две зоны: центральная, состоящая из немигрирующих дифференцирующихся нейробластов, и периферическая, так называемая зона роста. В зоне роста эксплантатов сенсорных ганглиев преобладает рост нейритов (отростков нервных клеток), в меньшей степени мигрируют и пролиферируют фибробластоподобные клетки и глия. Сыворотка крови 5 больных СМА 2 типа была исследована в широком диапазоне разведений (1:100-1:2). Результаты оценки индекса площади для исследуемых разведений проанализированы с использованием дисперсионного анализа. Получено, что фактор разведения сыворотки крови статистически значимо (критерий Фишера F=489,2; p<0,001) влияет на значение ИП, регистрируемое в опыте. На рисунке 1 отмечается практически полное ингибирование роста нейритов сенсорных ганглиев при разведениях 1:2, 1:10, 1:50 сыворотки больных. Рис. 1. Оценка индекса площади при исследуемых разведениях сыворотки крови пациентов (приведены средние арифметические значения, планки погрешности - 95%-ый доверительный интервал математического ожидания показателя ИП). При добавлении в культуральную среду сыворотки крови в разведении 1:70 наблюдали достоверное нейрит-ингибирующее действие. ИП исследуемых эксплантатов был ниже контрольных значений в среднем на 25% и составил 75,5±7,4% (рис.2). При дальнейшем разведении сыворотки крови на рост нейритов она практически не влияла, ИП составил 95,2±6,4%. Проведенные исследования показали, что сыворотка крови больных СМА 2 типа дозозависимо ингибирует рост нейритов сенсорных нейронов спинальных ганглиев. Рис.2. Рис. Микрофотография эксплантата сенсорного ганглия 10-12-дневного куриного эмбриона (3-и сутки культивирования). (ув. 5) А - контроль; Б - после воздействия сыворотки крови больных СМА 2 в разведение (1:70). Ранее в аналогичных экспериментальных условиях проводились исследования нейротрофического влияния цереброспинальной жидкости при различных патологических состояниях ЦНС (эпилепсия, острая фаза энцефалита), наблюдалось нейрит-стимулирующее влияние ликвора на рост нейритов сенсорных ганглиев [13, 14]. Такую активность цереброспинальной жидкости больных авторы связывали с повышением уровня нейротрофических факторов. Однако в вышеописанных экспериментах исследователями не определялась концентрация ФРН в ликворе, поэтому мы не может сопоставить наши данные и определить какие концентрации ФРН в их эксперименте давали стимулирующий эффект. В целях предварительной оценки характера статистической связи между концентрацией ФРН в сыворотке крови больных СМА и индексом площади построена диаграмма рассеяния для указанных признаков (рис. 3). Анализ диаграммы позволяет сделать вывод о наличии нелинейной отрицательной корреляционной связи между признаками. Рис. 3. Графическая оценка связи между концентрацией ФРН в сыворотке крови больных СМА и индексом площади. В целях изучения корреляционной связи между концентрацией ФРН в сыворотке крови больных СМА и индексом площади использован непараметрический корреляционный анализ с расчетом коэффициента корреляции Спирмена (Spearman Rank Order Correlations) и оценкой его статистической значимости. Оценка показала наличие статистически значимой (p<0,001) сильной обратной (Spearman R=˗0,90) корреляционной связи. Анализ диаграммы рассеяния также дал основания предположить наличие линейного участка зависимости между концентрацией ФРН в сыворотке крови больных СМА и индексом площади в интервале от 0 до 150 пг/мл. Построение дополнительной диаграммы рассеяния для данного интервала концентрации ФРН подтвердило гипотезу (рис. 4). Рис. 4. Графическая оценка связи между концентрацией ФРН в сыворотке крови больных СМА в интервале от 0 до 150 пг/мл и индексом площади. Количественная оценка линейной связи показала наличие статистически значимой (p<0,001) сильной обратной (коэффициент корреляции Пирсона r=˗0,81) корреляционной связи между концентрацией ФРН в сыворотке крови больных СМА и индексом площади в интервале от 0 до 150 пг/мл. Таким образом, доказано наличие выраженной связи между фактом ингибирования роста нейритов сенсорных ганглиев куриных эмбрионов и концентрацией ФРН в сыворотке больных СМА 2 типа. В настоящее время известны различные биологически активные вещества, которые могут приводить к торможению роста нейритов [15-18]. Большинство исследования последних лет направлены на изучение механизмов регенерации имеющего травматическое повреждение аксона [19, 20]. Установлено что олигодендроциты обладают ингибирующими свойствами, синтезируя такие белки, как миелина гликопротеин и миелин ассоциированный гликопротеин [21, 22]. Аналогичным образом клетки глиальных рубцов синтезируют целый ряд белков, тормозящих рост аксона [23, 24]. Сомнительно, что белки миелина участвуют в ингибировании роста нейритов сенсорных ганглиев в нашем случае, так как при СМА 2 типа не происходит повреждение нервных волокон, что подтверждается данными ЭНМГ: скорость сенсорного проведения по нервным волокнам у больных СМА 2 типа в норме. По-видимому, нейрит-ингибирующий эффект сыворотки крови больных СМА 2 типа обусловлен высокой концентрацией ФРН в плазме. Известно, что белок ФРН может взаимодействовать с рецептором р75, который участвует в процессах физиологического ингибирования роста конуса нейрита [25-27]. Но р75 относится к низкоаффинным рецепторам, а сенсорные нейроны спинальных ганглиев 10-12-дневных куриных эмбрионов характеризуются высоким уровнем экспрессии высокоаффинных рецепторов к ФРН. Возможно, что ингибирующий эффект сыворотки больных in vitro связан с активацией как высокоаффинного рецептора р140, так и низкоаффинного рецептора р75. Вследствие повышенной концентрации, ФРН становится более конкурентноспособным для одновременного взаимодействия с этими рецепторами, что возможно и приводит к торможению ветвления терминальной зоны аксона. Однако механизм ингибирования нейритов сенсорных ганглиев куриных эмбрионов вызванный присутствием сыворотки больных СМА 2 типа требует дальнейшего изучения и, безусловно, наше предположение носит гипотетический характер. Выводы. 1. По данным клинико-нейрофизиологического исследования больных СМА 2 типа, выявлено, что компенсаторные механизмы, направленные на активацию аксональной реиннервации, работают недостаточно эффективно. 2. Впервые показано, что уровень фактора роста нерва в сыворотке крови у больных СМА 2 типа достоверно выше, чем в контрольной группе. 3. Выявлено, что сыворотка крови больных СМА 2 типа дозозависимо ингибирует рост нейритов спинальных ганглиев 10-12 суточных эмбрионов. 4. Выявлена сильная корреляционная связь между ингибированием роста нейритов сенсорных ганглиев куриных эмбрионов и концентрацией ФРН в сыворотке больных СМА 2 типа. 5. Установлено, что одним из факторов, препятствующих аксональной реиннервации, может являться повышенный уровень ФРН в крови у больных СМА 2 типа.

M G Sokolova

North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia

V A Penniyaynen

Pavlov Institute of Physiology RAS, Saint-Petersburg, Russia

M V Rezvantsev

Military Medical Academy named after S.M. Kirov, Saint-Petersburg, Russia

S V Lobzin

North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia

N Yu Aleksandrov

North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia

  1. Cuppini, R. Time course of sprouting during muscle reinnervation / R. Cuppini, [et al.] // Muscle & Nerve. - 1990. - Vol.13. - Р. 1027-1031.
  2. Huang, E. J. Neurotrophins. Roles in neuronal development and function / E. J. Huang [et al.] // Annu. Rev. Neurosci. - 2001. - Vol.24. - Р. 677-736.
  3. Levi-Montalchini, R. The nerve growth factor. 35 years later / R. Levi-Montalchini // Science. - 1987. - Vol.237. - P. 1154-1162.
  4. Гаврилюк, Б.К. Органотипическое культивирование тканей / Б.К. Гаврилюк, В.Л. Сафронов // М.: Наука - 1983. -128 с.
  5. Rohrer, H. Presence and disappearance of nerve growth factor receptors on sensory neurons in culture / H. Rohrer [et al.] // Dev. Biol. - 1982. - Vol.89. - P. 309-315.
  6. Акоев, Г.Н. Нейротрофическая регуляция нервной ткани / Г.Н. Акоев // СПб. - Наука. - 1997. - 149 с.
  7. Rydel, R.E. cAMP analogs promote survival and neurite outgrowth in cultures of rat sympathetic and sensory neurons independently of nerve growth factor / R.E. Rydel, [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1988. - Vol.85. - Р.1257-1261.
  8. Пеннияйнен, В.А. Влияние оуабаина на рост нейритов чувствительных нейронов в органотипической культуре ткани / В.А. Пеннияйнен [и др.] // Цитология. - 2003. - Т. 45, №4. - С. 377-379.
  9. Lopatina, E.V. Modulation of signal-transducing function of neuronal membrane Na+,K+-ATPase by endogenous ouabain and low-power infrared radiation leads to pain relief / E.V. Lopatina [et al.] // Med. Chem. - 2012. - Vol.8, №1. - P. 33-39.
  10. Команцев, В.Н. Алгоритмы клинико-электромиографической диагностики повреждений периферических нервов для неврологов и миографистов / В.Н. Команцев // СПб. - Изд-во Система. - 2007.- 64 с.
  11. Соколова, М.Г. Спинальная мышечная атрофия у детей: этиология, патогенез, диагностика и принципы лечения / М.Г. Соколова [и др.] // Вестн. СЗГМУ им. И.И. Мечникова. - 2013. - Т. 5, № 4. - С. 108-114.
  12. Yamashita T. Molecular mechanism and regulation of axon growth inhibition / Т.Yamashita [et al.] // J. Biol. -2007. -Vol.59, №12. - Р.1347-1353.
  13. Акоева, Г.Н. Стимулирующее влияние цереброспинальной жидкости больных эпилепсией на рост нейритов чувствительных нейронов в культуре ткани/ Г.Н. Акоева [и др.] // Физиология человека. - 1995. - Т. 21, №4. - С. 156-162.
  14. Давыдовская, М.В. Влияние цереброспинальной жидкости больных нейроинфекциями на экспланты спиномозговых ганглиев / М.В. Давыдовская [и др.] // Физиология человека. - 1995. - Т. 21, №4. - С. 150-155.
  15. Yongwoo, J. Axonal Neuropathy-associated TRPV4 Regulates Neurotrophic Factor-derived Axonal Growth / J. Yongwoo [et al.] // J. Biol. Chem. - 2012. - Vol. 287, № 8. - Р. 6014-6024.
  16. Benson M.D. Ephrin-B3 is a myelin-based inhibitor of neurite outgrowth / M.D. Benson [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2005. - Vol.102. - Р.10694-10699.
  17. Williams, G. Ganglioside Inhibition of Neurite Outgrowth Requires Nogo Receptor Function: Identification of Interaction Sites and Development of Novel Antagonists / G.Williams [et al.] // J. Biol. Chem. - 2008. - Vol.283. - P. 16641-16652.
  18. Goldberg, J.L. An oligodendrocyte lineage-specific semaphorin, Sema5A, inhibits axon growth by retinal ganglion cells / J.L. Goldberg [et al.]//J. Neurosci. - 2004. - Vol.24. - Р. 4989-4999.
  19. Hannila, S.S. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury/S.S. Hannila [et al.] // Exp. Neurol. - 2008. - Vol.209. - Р.321-332.
  20. Miyashita, T. Signaling Mediates Axon Growth Inhibition and Limits Functional Recovery after Spinal Cord Injury / Т.Miyashita [et al.] // J. Neurotrauma. - 2009. - Vol.233. - Р. 43-47
  21. Li, S. Blockade of Nogo-66, myelin-associated glycoprotein, and oligodendrocyte myelin glycoprotein by soluble Nogo-66 receptor promotes axonal sprouting and recovery after spinal injury / S. Li [et al.] // J. Neurosci. -2004. - Vol.24. - Р. 10511-10520.
  22. Shen, Y. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration / Y. Shen, [et al.] // Science. - 2009. - Vol.326. - Р. 592-596.
  23. Monnier, P.P. The Rho/ROCK pathway mediates neurite growth-inhibitory activity associated with the chondroitin sulfate proteoglycans of the CNS glial scar/ P.P. Monnier [et al.] // Mol. Cell. Neurosci. - 2003. - Vol.22. - Р. 319-330.
  24. Wanner, I.B. A new in vitro model of the glial scar inhibits axon growth / I.B. Wanner [et al.] // Glia. - 2008. - Vol.56. - Р. 1691-1709.
  25. Meakin, S.O. Molecular investigations on the high-affinity nerve growth factor receptor / S.O. Meakin [et al.] // Neuron. - 1991. - Vol.6(1) - Р.153-63.
  26. Lee, X. LINGO-1 is a component of the Nogo-66 receptor/p75 signaling complex / X. Lee [et al.] // Nat. Neurosci. - 2004. - Vol.7. - Р. 221-228.
  27. Li, S. Differential actions of nerve growth factor receptors TrkA and p75NTR in a rat model of epileptogenesis /S. Li [et al.]//Mol Cell Neurosci.- 2005.- №29(2). - Р.162-172.

Views

Abstract - 102

PDF (Russian) - 82

PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2014 Sokolova M.G., Penniyaynen V.A., Rezvantsev M.V., Lobzin S.V., Aleksandrov N.Y.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.