POSSIBLE ROLE OF GENETIC POLYMORPHISMS FOR INDIVIDUALSENSITIVITY TO SIMVASTATIN IN INITIAL THERAPEUTIC DOSE

Full Text

Введение Международные и национальные рекомендации содержат список лекарственных средств (ЛС), которые убедительно улучшают прогноз у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС). Согласно имеющимся данным, статины улучшают прогноз с уровнем доказательности А [1]. Тем не менее, они не способны одинаково улучшить прогноз у 100% получающих их пациентов, с другой стороны, многие пациенты страдают от неблагоприятных побочных реакций (НПР). Причины такой вариабельной эффективности терапии, как правило, лежат в генетических особенностях метаболизма и транспорта ЛС, их фармакокинетике. Имеющаяся экспериментальная информация до настоящего времени не вошла в клиническую практику в виде алгоритмов подбора терапии. Создание таких алгоритмов в отношении статинов представляется сложной задачей, поскольку имеется целый ряд известных генетических полиморфизмов, изменяющих транспорт, распределение, метаболизм или чувствительность мишеней. Помимо этого, не до конца известно, насколько значимую в практическом отношении роль играют лекарственные взаимодействия статинов. Целью наших исследований являлось изучение влияния генетических факторов на эффективность и безопасность симвастатина в терапевтической дозе. Материал и методы В исследование включали всех пациентов, поступающих в больницу им. Петра Великого, при наличии у них медицинских показаний к назначению липидоснижающей терапии (дислипидемия при наличии факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет) и отсутствии противопоказаний к назначению статинов. Стандартное обследование включало клинический анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови для оценки функционального состояния печени, почек, белкового статуса, а также липидограмму. После разъяснения цели исследования пациентам и получения информированного согласия у них брали 5 мл крови на фармакогенетический анализ и назначали симвастатин в начальной дозе 20 мг в сутки. У всех пациентов из цельной крови, взятой из периферической вены в пробирку с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) в условиях вакуумного забора, была выделена ДНК с использованием сорбционного метода («Проба ГС-генетика», ДНК-технология). Для выявления аллельных вариантов CYP3A5 *1 и *3 была использована модификация метода Smith et al. [2]. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали праймеры, фланкирующие область однонуклетидной замены G6986A: 5’-ATGGAGAGTGGCATAGGAGATACC -3’ 5’-TGTGGTCCAAACAGGGAACAGATA -3’ Амплификацию проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Tris-HCl pH8.8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,1% тритон X-100, 2,5 мM MgCl2, 0,25 мкМ каждого праймера, 200 мкМ dNTP, 1 ед. Taq ДНК полимеразы и 1 мкг геномной ДНК. После первоначальной денатурации при +95˚ С в течении 7 мин 35 циклов амплификации вели в следующем температурно-временном режиме: денатурация +94˚С - 60 сек, отжиг праймеров: +60˚С - 60 сек, синтез: +72˚С - 60 сек. После завершения 35 циклов амплификации проводили заключительный синтез при +72˚С в течении 7 мин. В результате ПЦР получали фрагмент размером 110 п.н. Для проведения рестрикционного анализа ПЦР продукт инкубировали с 0,5 ед. эндонуклеазы Cai I в 1x буфере в буфере Y+ (33 мМ Tris-acetate pH7.9, 10 мМ Mg-acetate, 66 мМ K-acetate, 0,1 мг/мл BSA, pH7.9 при +37˚С) при +37˚С в течении 24 часов. После рестрикции фрагменты ДНК подвергали электрофоретическому разделению в 6% ПААГ. С целью стандартизации анализа эффективности липидоснижающей терапии проводили изучение пищевого статуса пациентов методикой НИИ питания РАМН [3], оценивали поступление холестерина с пищей. Контроль показателей эффективности (изменения липидограммы, С-реактивный белок) и безопасности (жалобы на миалгию, показатели аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), креатинфосфокиназы (КФК)) проводили через 2 и 4 недели после начала терапии. Для оценки данных использовались следующие методы: описательная статистика - среднее ± стандартное отклонение (минимум-максимум), проценты от общего (округлены до целых чисел); тест ранговой корреляции Спирмена (для непараметрических данных); ANOVA. Анализ проведен с помощью программы статистического анализа GraphPad Prizm 5. Результаты и их обсуждение В исследование были включены 60 пациентов - 22 (37%) мужчин, 38 (63%) женщин. Средний возраст 63±14 (минимальный - 27, максимальный - 85). В 81% случаев показаниями к назначению статинов была подтвержденная ишемическая болезнь сердца (вторичная профилактика сердечно-сосудистых событий), в 19% - дислипидемия с факторами риска (первичная профилактика сердечно-сосудистых событий). У всех пациентов на момент включения в исследование уровень общего белка был выше 60 г/л, показатели креатинина, АЛТ, АСТ, билирубина, КФК не превышали нормальных значений. По результатам анализа питания пациентов среднее потребление холестерина у них составило 331,8±170 мг в сутки, что в среднем соответствует допустимому в норме потреблению холестерина. По результатам повторных анализов питания по окончании периода наблюдения не было отмечено значимого изменения потребления холестерина, что позволило нам сделать вывод о том, что питание не повлияло на наблюдавшиеся нами изменения содержания холестерина в крови. Динамика наблюдаемых показателей за весь период наблюдения представлена в таблице (табл. 1). Таблица 1. Изменения средних величин показателей общего холестерина, КФК, АЛТ и АСТ на фоне терапии симвастатином Общий холестерин КФК АЛТ АСТ Исходно 5,9±1,3 81,3±94,8 26±15 29±24 2я неделя 4,9±0,9 74,23±82,7 33±37 23±8 4я неделя 4,7±1,1 87,9±102 28±17 24±11 Значимость (ANOVA) р<0.0001 незначимо незначимо незначимо Снижение общего холестерина и липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) наблюдались в разной степени у всех пациентов. Однако при сопоставлении изменений холестерина и КФК было обнаружено, что между ними существует значимая обратно пропорциональная зависимость (Spearman r 0.6, p<0.0001) (рис.1). Эти данные могут являться отражением нарушения транспорта симвастатина к месту оказания эффекта посредством белка-переносчика органических анионов (OATP1B1), субстратом для которого является симвастатин наряду с другими статинами. В целом ряде крупных клинических исследований было показано, что эффективность статинов генетически детерминирована активностью этого белка-переносчика, отвечающего за транспорт статинов к месту действия - в гепатоцит. Впервые эта информация была опубликована для азиатской популяции в исследовании Tachibana-Limori [4], где было показано, что гетерозиготное носительство мутации в гене, кодирующем этот переносчик ЛС, в виде замены тимина на цитозин в положении 521 (521 ТС) приводит к меньшему снижению ЛПНП на фоне применения статинов, чем в отсутствие этой нуклеотидной замены (16,5% и 22,3% соответственно, р<0,05). Наиболее значительные результаты были получены на материале исследования, опубликованного в журнале Lancet в 2004 г. На популяции численностью 16600 пациентов было показано, что при применении симвастатина в дозе 40 мг в сутки в течение 4-6 недель снижение ЛПНП на 1,28% меньше среднего с каждой копией гена, несущего нуклеотидную замену 521Т/С [5]. В то же время доказана связь генетических полиморфизмов в гене, кодирующем этот белок-переносчик, с развитием рабдомиолиза - тем выше, чем больше копий гена OATP1B1, несущего нуклеотидную замену 521С/Т [6]. Полученные нами данные косвенным образом свидетельствуют о том, что логично следует из указанного генетического дефекта, - о снижении эффекта симвастатина на синтез холестерина у тех пациентов, у которых повышена вероятность побочных эффектов терапии - нарастания КФК в связи с накоплением препарата во внеклеточном пространстве, а не внутриклеточном. В целом повышение КФК любой степени выраженности на фоне терапии и при отсутствии других причин мы наблюдали в 22 (37%) случаях. Отмена препарата в связи с повышением КФК потребовалась в 2 (3%) случаях. У этих пациентов содержание КФК было в 3 и 5 раз выше нормальных значений. Метаболизм большинства статинов в печени осуществляется посредством ферментов семейства цитохрома Р450 подсемейства 3А4 (CYP3A4), при этом одновременное применение ингибиторов этого фермента (макролиды, верапамил, дилтиазем, кетоконазол, амиодарон) приводит к увеличению концентраций статинов. Существуют данные о повышение числа статин-индуцированных миопатий при их одновременном применении с верапамилом и противогрибковыми препаратами группы азолов [7]. Около 20 лет назад был выявлен генетический полиморфизм в гене белка, кодирующего фермент CYP3A5, имеющий общие с CYP3A4 субстраты. Оказалось, что только около 20% европейской популяции экспрессируют этот белок. Такая мутация была названа CYP3A5*1. В нашей группе пациентов частота встречаемости «редкого» аллеля *1, характеризующегося выраженной активностью фермента метаболизма симвастатина, составила 15%, что соответствует известной, по данным литературы, частоте в европейской популяции [8]. Мы не наблюдали гомозиготных носителей аллеля *1, что допустимо исходя из менделевского распределения генотипов. Мы проанализировали степень снижения холестерина у пациентов - носителей двух аллелей *3 и носителей хотя бы одного аллеля *1. В группе пацинтов с генетической предрасположенностью к более высокой скорости метаболизма симвастатина отмечалась тенденция к менее значимому изменению содержания холестерина в крови на фоне терапии (1,2 vs 2,9 мкмоль/л), что, однако, не достигло статистической значимости ввиду большого разброса величин в группе сравнения (рис.2). Выводы Несмотря на то, что статины входят в перечень препаратов, назначаемых всем пациентам с ИБС с уровнем доказательности А, существуют данные о том, что должного эффекта достигают только 18% пациентов [9]. В то же время актуальной проблемой являются НПР при применении статинов, в частности миопатия, встречающаяся у 10-15% пациентов [10], наиболее тяжелые случаи которой (рабдомиолиз) сопряжены с высокой вероятностью летального исхода и встречаются у 1,6 на 100 000 пациент-лет [11]. По нашим данным, представляется вероятным, что выраженность эффектов и безопасность симвастатина определяются неодинаковыми генетическими параметрами. Генетический полиморфизм переносчика органических анионов OATP1B1 скорее всего определяет безопасность и связан с меньшей эффективностью, тогда как полиморфизм в метаболизирующем ферменте CYP3A5 в большей степени может быть связан с индивидуальными различиями в выраженности липидоснижающего эффекта. Для построения практических алгоритмов назначения статинов требуются более развернутые исследования, затрагивающие эти и другие генетические полиморфизмы, а также лекарственные взаимодействия. Необходимость максимально эффективного лечения и профилактики ИБС делает изучение этих факторов и разработку таких алгоритмов высокозначимым. Исследование выполнено при поддержке гранта президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых - кандидатов наук МК-5049.2011.7. Список сокращений АЛТ - аланинаминотрансфераза АСТ - аспартатаминотрансфераза ИБС - ишемическая болезнь сердца КФК - креатинфосфокиназа ЛПНП - липопротеиды низкой плотности ЛС - лекарственные средства НПР - неблагоприятные побочные реакции ПЦР - полимеразная цепная реакция ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

About the authors

K A Zagorodnikova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

A A Topanova

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

M A Natas

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

V A Shumkov

North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov

References

Supplementary files