CYTOKINES PROFILE BRONCHOALVEOLAR LAVAGE PATIENTS WIHT BRONCHIAL ASTHMA

Full Text

Введение. В настоящее время бронхиальная астма (БА) является одним из наиболее значимых и часто встречающихся заболеваний в мире. Современная концепция патогенеза БА констатирует, что в её основе лежит хронический иммуновоспалительный процесс в стенке бронха [8, 9]. В развитии такого воспаления участвуют мононуклеары, а также посредники межклеточной кооперации - цитокины и хемокины [10, 11]. Изучение системы цитокинов у больных БА может быть полезным в оценке тяжести процесса и прогноза заболевания в целом. Вместе с тем, определение содержания цитокинов непосредственно в стенке бронха представляет большие трудности. В этой связи перспективным направлением изучения активности воспалительного процесса в бронхоальвеолярной ткани может стать оценка содержания цитокинов в бронхоальвеолярном лаваже, получаемая при проведении лечебной санации бронхов [12]. Выделение двух основных вариантов БА - атопического и эндогенного - позволяет эффективнее контролировать течение заболевания и проводить патогенетическую терапию. Для диагностики атопического варианта БА широко используются лабораторные показатели, включающие общий и специфический иммуноглобулин Е (IgE), эозинофильный катионный протеин (ECP), триптазу и др. [4, 5, 6, 7]. Сочетанное применение методов оценки выраженности иммунного и аллергического воспаления является одним из необходимых условий верификации патогенетического варианта БА и выбора тактики ведения таких больных. Цель исследования: изучить взаимосвязи между маркёрами атопии в крови, клиническим течением БА и цитокиновым спектром бронхоальвеолярной жидкости у больных с различными клинико-патогенетическими вариантами бронхиальной астмы. Материалы и методы Под наблюдением находилось 80 больных БА, из них 48 женщин и 32 мужчины. Средний возраст больных составил 51,3±7лет. У всех больных была диагностирована частично контролируемая БА средней степени тяжести. Верификация клинического варианта и тяжести БА проводилась в соответствии с GINA (2014). Больные были разделены на 2 группы: 1-я группа - 40 больных с атопичским вариантом БА, 2-ая группа - 40 больных со смешанным вариантом БА. Длительность заболевания в 1-й группе составила 8,7±3,7 лет, во 2-й - 15,6±5,1 лет. Группа сравнения была представлена 20 пациентами терапевтического отделения в возрасте 43,2±7 лет без бронхолёгочных заболеваний. Параметры функции внешнего дыхания (ФВД) у больных БА при поступлении в стационар и выписке оценивали на электронном спироанализаторе «ДИАМАНТ» (Россия) в соответствии с рекомендациями GINA (2014)[12]: объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1), форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), ОФВ1/ФЖЕЛ. Аллергологическое обследование включало сбор анамнеза, кожные скарификационные пробы с неинфекционными аллергенами (вне обострения заболевания). Также использовались методы определение уровня эозинофилов в периферической крови, общего IgЕ и катионного белка эозинофилов. При сборе аллергологического анамнеза учитывались атопические заболевания, семейный анамнез, влияние климата и физических факторов. Определение уровня общего IgE проводили с использованием диагностических наборов «IgE общий» производства компании «Hoffmann La Roche Ltd» (Германия) в соответствии с инструкцией производителя методом электрохемилюминесценции на приборе «Cobas e 411» (Япония). Определение уровня катионного белка эозинофилов (ECP) в сыворотке крови проводили иммунохемилюминесцентным методом с применением реагентов для определения ECP, согласно инструкции производителя, на приборе «UniCAP 100» фирмы «Phadia» (Швеция). Уровень ECP в сыворотке крови позволял оценить выраженность эозинофильного воспаления. Материалом для иммунологического и цитологического исследований служила бронхоальвеолярная жидкость, полученная на 2-3 сутки госпитализации после стойкого купирования бронхоспазма и стабилизации клинического состояния. Повторный забор бронхоальвеолярной жидкости проводили перед выпиской, обычно на 16-е сутки после поступления в стационар. Для получения смыва из участка лёгкого бронхоскоп продвигали до «заклинивания» в сегментарный или субсегментарный бронх. Бронхоальвеолярную жидкость получали с помощью бронхоскопа цитологической щёткой. Содержание в бронхоальвеолярной жидкости цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, IFN-γ,GM-CSF) определяли на анализаторе Bio-Plex (Фирма “Bio-Red” USA). Чувствительность тест-системы для различных цитокинов находилась в диапазоне 0,27-0,5 пг/мл. Лечение в стационаре проводили согласно рекомендациям ВОЗ (1998) и GINA (2014) β2-агонистами быстрого действия через небулайзер по одной дозе беродуала (1мл) каждые 20 мин в течение одного часа в сочетании с ингаляцией кислорода. При отсутствии эффекта добавляли парентерально глюкокортикостероиды (преднизолон 1 мг/кг с интервалом 2 ч). При сохранении ПСВ (пиковая скорость выдоха) ниже 60% от должного или от наилучшего значения в течение 3 ч приступ расценивали как тяжёлый. К лечению добавляли метилксантины. Насыщающую дозу вводили из расчёта 5-6 мг/кг массы тела; поддерживающую дозу - в виде длительной инфузии по 0,5-0,6 мг/кг массы тела. Одновременно увеличивали дозу парентеральных глюкокортикостероидов: 250 мг гидрокортизона сукцината или 90-120 мг преднизолона каждые 6 ч. Эффективность лечения оценивали по приросту ОФВ1 на 15% и более. Статистическая обработка результатов клинических и инструментальных исследований проводилась с использованием пакета прикладных программ SPSS 13.0 for Windows. Рассчитывались: средняя арифметическая (М), стандартное отклонение (SD). Вариационный анализ учитывал расчёт медиан Ме и межквартильного интервала Q25-Q75. Результаты считались достоверными при достижении уровня значимости различий при р<0,05, р<0,01, р<0,001 [13]. Результаты и их обсуждение На первом этапе исследования были выделены следующие группы больных: 1-я группа (40 человек) включала больных атопической бронхиальной астмой (АБА), 2-я группа (40 человек) включала больных смешанной бронхиальной астмой (СБА), 3-я группа (20 человек) - контрольная, без бронхолёгочных заболеваний. Клиническая характеристика больных по группам представлена в табл.1. Таблица 1 Клиническая характеристика больных БА Группы Клинические варианты БА Возраст, лет Пол Длительность БА, годы муж жен 1 Атопическая БА 39,7±6,5 13 (32,5%) 27 (67,5%) 9,7±3,5 2 Смешанная БА 53,3±6,5 17 (42,5%) 23 (57,5%) 16,7±5,4 3 Контрольная группа 43,3±7,9 7 (35%) 13 (65%) - У больных всех групп при поступлении и перед выпиской после курса лечения проводилось определение параметров ФВД (табл. 2), а также лабораторных показателей в сыворотке крови: количества эозинофилов, содержания общего IgE и катионного белка эозинофилов. Таблица 2 Показатели ФВД у больных БА в группах (Ме (25‰-75‰)). Показатель Атопическая БА Смешанная БА Контроль Р 1-я группа 2-я группа До лечения После лечения До лечения После лечения 1 2 3 4 5 ОФВ1 (%) 58,5 (43,4-67,2) 79,5 (69,4-95,3) 43,5 (34,6-58,7) 73,3 (57,6-89,2) 86,3 (70,4-104,7) Р1,2<0,05 Р1,5<0,05 Р3,5<0,05 ЖЁЛ (%) 65,6 (49,7-79,1) 84,3 (74,9-91,5) 62,9 (48,8-78,6) 78,4 (59,9-97,8) 96,2 (79,5-110,2) Р1,5<0,05 Р3,5<0,05 ПОСвыд. (%) 63,3 (48,5-79,9) 79,4 (61,9-98,8) 61,1(47,5-77,6) 77,1 (61,4-92,9) 90,5 (81,5-109,4) Р1,5<0,05 Р3,5<0,05 Примечание: ОФВ1 - объём форсированного выдоха за 1 секунду (%), ЖЁЛ - жизненная ёмкость лёгких (%) ПОСвыд. - пиковая объёмная скорость выдоха (%). При анализе показателей ФВД установлено, что при поступлении во всех группах больных средние значения ОФВ1 и ПОСвыд. указывали на наличие бронхиальной обструкции. Во 2-й группе больных СБА установлена тенденция к более выраженной обструкции по сравнению с 1-й группой больных АБА: 2-я группа: ОФВ1-43,5 % (34,6-58,7), ПОС выд. - 61,1 % (47,5-77,6); 1-я группа: ОФВ1-58,5 % (43,4-67,2), ПОС выд. -63,3 % (48,5-79,9). Лекарственная терапия, проводившаяся в течение 10-14 суток, привела к регрессу бронхиальной обструкции. При этом, достоверное повышение ОФВ1 на фоне проведённой терапии отмечено только в 1-ой группе больных АБА: 58,5% (43,4-67,2) и 79,5% (69,4-95,3) соответственно (р<0,05), по сравнению со 2-ой группой СБА: 43,5% (34,6-58,7) и 73,3% (57,6-89,2). Специфичным лабораторным маркером аллергических заболеваний является IgE к определенному аллергену. В реальной клинической практике в сыворотке крови чаще определяют уровень общего IgE, который хотя и является менее специфическим маркером атопии, но позволяет дифференцировать группу аллергических заболеваний от другой соматической патологии. По усредненным статистическим данным у 70% взрослых больных атопической бронхиальной астмой уровень общего IgE превышает референтные значения, более чем на два стандартных отклонения. В нашем исследовании содержание общего IgE в группе больных атопической БА существенно превышало значения, характерные для смешанного варианта БА (табл.3). Таблица 3 Содержание общего IgE в сыворотке крови больных БА (Ме (25‰-75‰)) Показатель Атопическая БА Смешанная БА Контрольная группа Р 1-ая группа 2-ая группа До лечения После лечения До лечения После лечения 1 2 3 4 5 IgE общ., kЕ/L 587(494-689) 125(106-143) 205 (161-249) 104(71-139) 82(50-117) Р1,2<0,05 Р1,3<0,05 Р3,4<0,05 Р1,5<0,05 Р2,5<0,05 До лечения содержание общего IgE было достоверно выше у больных атопической БА по сравнению с СБА (587 kЕ/L (494-689) и 205 kЕ/L(148-249) соответственно (Р<0,05). По мере санации содержание общего IgE понизилось в обеих группах: у больных АБА 4-кратно, у больных СБА - двукратно. Следующим этапом исследования стала оценка содержания ЕСР в сыворотке крови наблюдаемых пациентов. ЕСР является специфичным маркером активности эозинофилов. Он секретируется в кровь сенсибилизированными эозинофилами при аллергических и воспалительных реакциях. Его содержание в крови коррелирует с выраженностью аллергических реакций. Результаты исследования приведены в табл. 4. Таблица 4. Содержание ЕСР в периферической крови в больных БА (Ме (25‰-75‰)) Показатель Атопическая БА Смешанная БА Контрольная группа Р 1-ая группа 3-ая группа До лечения После лечения До лечения После лечения 1 2 3 4 5 ЕСР, нг/мл 50,1 (39,2-63,4) 18,6 (12,9-20,1) 29,7 (21,4-37,3) 16,6 (11,7-20,5) 12,8 (7,2-16,1) Р1,2<0,05 Р1,3<0,05 Р3,4<0,05 Р1,5<0,05 Согласно полученным данным максимальное содержание ECP исходно отмечено в группе больных атопической БА по сравнению с СБА: 50,1 нг/мл (39,2-63,4) и 29,7 нг/мл (21,4-37,3), причём выявленные различия были достоверными: (р<0,05) соответственно. На фоне проводимого лечения содержание ECP снижалось: в 1-й группе больных с 50,1 нг/мл (39,2-63,4) до 18,6 нг/мл (12,9-20,1) (р<0,05); во 2-й группе с 29,7 нг/мл (21,4-37,3) до 16,6 нг/мл (11,7-20,5) (р<0,05). При этом снижение показателя у больных АБА понизилось более чем в три раза, а в группе больных СБА - менее, чем в 2 раза. Уровень содержания в группах больных БА эозинофилов представлен в табл. 5. Таблица 5 Содержание эозинофилов в периферической крови больных БА (Ме (25‰-75‰)) Показатель Атопическая БА Смешанная БА Контрольная группа Р 1-я группа 3-я группа До лечения После лечения До лечения После лечения 1 2 3 4 5 Эозинофилы, (%) 9,8 (7,8-11,9) 4,8 (3,2-5,7) 5,9 (4,5-6,5) 4,1 (2,9-4,7) 2 (1,5-3) Р1,2<0,05 Р1,5<0,01 Р2,5<0,05 Р3,5<0,05 Р1,3<0,05 До начала лечения содержание эозинофильной фракции лейкоцитов в крови больных АБА и СБА имело существенное различие. При атопическом варианте БА их уровень составлял 9,8% (7,8-11,9), а при смешанном варианте - 5,9 % (4,5-6,5). Различия в группах атопической и смешанной БА по уровню эозинофилов были достоверны (р<0,05). После курса лечения достоверное снижение этого показателя произошло в группе АБА: с 9,8% (7,8-11,9) до 4,8% (3,2-5,7), (р<0,05). В группе больных СБА также отмечалось снижение количества эозинофилов, однако оно не было достоверно значимо: с 5,9 % (4,5-6,5) до 4,1 % (2,9-4,7). Таким образом, оценка содержания общего IgE, ECP и количества эозинофилов позволяет проводить дифференцировку патогенетических варианта БА. Для атопической БА в период обострения характерным явилось почти двукратное увеличение ECP и количества эозинофилов, а также почти трехкратное увеличение общего IgE по сравнению со смешанной формой БА. Выявленная закономерность между вариантом течения БА и лабораторными показателями атопии может иметь существенное значение при выборе тактики ведения таких больных. Проведенное лечение снижало указанные показатели атопии независимо от патогенетического варианта БА, но более значимое снижение удалось достичь у больных с атопическим вариантом заболевания. При изучении цитокиновой активности в бронхоальвеолярной жидкости выявлено существенное увеличение содержания ряда интерлейкинов (IL-4, IL-6, IL-8), а также фактора некроза опухоли (TNF-α) и колониестимулирующего фактора (GM-CSF) в обеих группах больных (табл. 6). Таблица 6 Показатели содержания цитокинов в бронхоальвеолярной жидкости в группах (Ме (25‰-75‰)) Цитокины, пг/мл Атопическая БА Смешанная БА Контрольная группа Р 1-я группа 2-я группа До лечения После лечения До лечения После лечения 1 2 3 4 5 IL-2 1,5 (1,1-1,9) 1,3 (1,0-1,6) 1,8 (1,3-2,3) 0,86 (0,6-1,0) 1,09 (0,8-1,4) - IL-4 136,0 (107,1-164,2) 45,0 (38,6-58,3) 91,3 (70,7-106,5) 33,6 (20,9-42,7) 5,9 (4,4-7,5) Р1,2<0,05 Р1,5<0,01 Р1,3<0,05 Р3,4<0,05 Р3,5<0,01 Р4,5<0,05 IL-6 134,2 (90,6-143,5) 34,2 (20,6-43,5) 43,7 (20,5-57,2) 6,4 (3,5-8,7) 2,7 (2-3,4) Р1,2<0,05 Р1,5<0,01 Р1,3<0,05 Р3,4<0,05 Р3,5<0,01 Р4,5<0,05 IL-8 5574 (4054-6012) 867 (745-1047) 2193 (1588-2604) 472 (348-645) 159 (123-198) Р1,2<0,01 Р1,5<0,01 Р1,3<0,05 Р3,4<0,05 Р3,5<0,01 Р4,5<0,05 IL-10 3,1 (2,3-4,0) 1,5 (1,2-2,4) 4,0 (3,1-4,9) 1,8 (1,4-2,2) 1,0 (0,7-1,3) Р1,2<0,05 Р1,5<0,05 Р3,4<0,05 Р3,5<0,05 Р4,5<0,05 GM-CSF 6,1 (4,6-7,6) 2,5 (2,0-3,1) 3,4 (2,2-4,4) 1,7 (1,3-2,2) 1,3 (0,9-1,6) Р1,2<0,05 Р1,5<0,01 Р1,3<0,05 Р3,4<0,05 Р3,5<0,01 Р4,5<0,05 IFN-γ 2,9 (2,1-3,9) 8,7 (5,4-12,1) 2,2 (1,4-3,1) 12,6 (8,9-16,3) 2,3 (1,7-2,9) Р1,2<0,05 Р3,4<0,05 Р4,5<0,01 TNF-α 2,9 (2,2-3,5) 1,8 (0,6-1,2) 1,9 (1,4-2,4) 1,2 (0,8-1,7) 0,7 (0,5-0,9) Р1,2<0,05 Р1,5<0,05 Р3,5<0,05 IL-4/ IFN-γ 51,0 (39,5-69,5) 7,5 (4,1-10,9) 41,2 (34,1-53,7) 2,9 (1,6-3,4) 2,6 (1,9-3,3) Р1,2<0,05 Р1,5<0,01 Р1,3<0,05 Р3,4<0,01 Р3,5<0,01 Установлено, что различные патогенетические варианты БА характеризовались индивидуальными цитокиновыми профилями. Так, для атопической формы в фазу обострения более характерно повышение содержания IL-4, IL-6, IL-8 и GM-CSF, значения которых были достоверно выше, чем у больных СБА. Также необходимо отметить, что содержание в бронхоальвеолярной жидкости всех изученных цитокинов, за исключением IL-2, многократно (от 2 до 70 раз) превышало уровни контрольной группы. Статистически достоверное снижение уровня TNF-α на фоне лечения отмечалось только в группе с АБА: 2,9 пг/мл (2,2-3,5) и 1,8 пг/мл (0,6-1,2) соответственно (р<0,05). Проводимая терапия влияла на содержание цитокинов в промывной жидкости: достоверно понизилось содержание IL-6 и IL-8 у больных как атопической, так СБА. Для IL-10 достоверное снижение отмечено лишь в группе СБА (4,0 пг/мл (3,1-4,9) и 1,8 пг/мл (1,4-2,2) соответственно (р<0,05)). Снижение уровней IL-4 и GM-CSF также отмечалось в обеих группах. По мере санации в обеих группах отмечалось статистически значимое повышение уровня IFN-γ, но во 2-й группе больных с СБА отмечалось более существенное его повышение. Достоверное снижение коэффициента IFN-γ/IL-4 после лечения также отмечалось в обеих группах больных. Для больных АБА с 51,0 пг/мл (39,5-69,5) до 7,5 пг/мл (4,1-10,9) (р<0,05), для группы СБА - с 41,2 пг/мл (34,1-53,7) до 2,9 пг/мл (1,6-3,4) (р<0,01). Вместе с тем, уровень IL-2 в бронхоальвеолярной жидкости не отличался от группы контроля и не изменялся под влиянием лечения как в группе АБА, так и СБА. Таким образом, результаты исследования показали, что лабораторные маркеры атопической БА - общий IgE и катионный белок эозинофилов, отражают тяжесть обострения заболевания и могут служить показателем эффективности проводимого лечения. Иммунологическое исследование бронхоальвеолярной жидкости подтвердило наличие выраженного воспаления в лёгочной ткани больных БА. В процессе изучения содержания цитокинов в промывной жидкости выявлены отличия двух патогенетических вариантов БА, заключающееся в большей выраженности иммунного воспаления в лёгочной ткани у больных АБА по сравнению СБА. В большей мере это относится к таким маркёрам воспаления, как IL-4, IL-6 и IL-8. Полученные в исследовании данные позволяют говорить о различных механизмах развития обострения БА у больных при атопической и смешанной формах заболевания. При первом варианте БА иммунологическая активность существенно выше, чем у больных СБА. Оценка содержания цитокинов в бронхоальвеолярной жидкости, проведенная по окончании курса этиотропной терапии, может служить методом контроля эффективности лечения больных БА. Выводы: 1. Лабораторные маркеры атопической БА - общий IgE и катионный белок эозинофилов отражают тяжесть обострения заболевания и могут служить показателем эффективности проводимого лечения. 2. Исследование содержания цитокинов в бронхоальвеолярной жидкости позволяет проводить дифференциальную диагностику различных форм БА. Специфическими маркерами атопической БА являются многократно повышенные уровни IL-4, IL-6 и IL-8. 3. Патогенетическая терапия БА снижает содержание IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF и повышает IFN-γ. Оценка содержания цитокинов в бронхоальвеолярной жидкости может служить показателем эффективности лечения заболевания.

About the authors

E G Murasov

Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov

S V Stolov

Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov

A A Totolian

St. Petersburg Research Institute of epidemiology and microbiology named after Pasteur

References

Supplementary files