CLINICAL ANd IMMuNOLOGICAL CHARACTERISTICS POSTOPERATIVE PERIOd AT HEMIFACIAL ALLOGRAFTS AVASCuLAR SKIN FLAP

Full Text

Несмотря на широкое распространение ал- логенной трансплантации органов и тканей, требуется постоянное совершенствование прак- тического опыта по пересадке структур лица. В настоящее время проводится большое количе- ство научно-исследовательских работ по опти- мизации схем отбора реципиентов и доноров, методов хирургической тактики, иммуносу- прессивной терапии, а также разрабатываются стратегии использования большего объема ал- логенной ткани с целью максимального восста- новления функционально-эстетических харак- теристик лица [11-14]. Как известно, активация иммунокомпетент- ных клеток в ответ на внедрение чужеродного антигена является физиологическим процессом, направленным на поддержание внутреннего го- меостаза организма, при этом выраженность иммунного ответа коррелирует с особенностя- ми антигена и состоянием иммунной системы реципиента. Активация иммунных реакций в ответ на пересадку аллогенных тканей разви- вается уже в первые минуты после трансплан- тации, а наиболее значимые иммунологические изменения у реципиента происходят в первые четыре недели после операции. В этой связи анализ и интерпретация клинико-иммунологи- ческих показателей у реципиентов в различные сроки после пересадки кожи фациальной обла- сти являются очень важным и как для определе- ния этапов формирования посттрансплантаци- онного иммунитета, так и ранней диагностики процесса отторжения тканей [15, 17]. В коже представленны все типы клеток уча- ствующих в формировании иммунного ответа (нейтрофилы, клетки Лангерганса, тучные клет- ки, кератиноциты, эозинофилы), кожу можно считать высоко иммуногенным органом [4, 7]. Материалы и методы исследования Объект исследования. для исследования были выбраны крысы-самцы семейств Wistar и dark Agouti в возрасте 4-х месяцев и весом более 300 граммов, которые были выведены в питом- нике Рапполово (г. Санкт-Петербург). Крысы в качестве модельных животных использовались- ввиду доступности получения противокрыси- ных антител для распознавания поверхностных эпитопов иммуноцитов реципиента. В исследуемую группу были включены кры- сы-реципиенты (n=14) с фациальным транс- плантатом, состоящим из кожи головы и шеи животного, из них 10 были с полнослойным кожным аллотрансплантатом от белошерст- ных крыс-доноров линии Wistar и 4 с таким же аллотрансплантатом от черношерстных крыс линейки dark Agouti. Клинико-лабораторный мониторинг включал оценку общего состояния реципиентов и ряда иммунологических пока- зателей в предоперационном периоде, а также на 3-и, 15-е и 45-е сутки после трансплантации. Контрольную группу (n=14) составили живот- ные с аналогичным полнослойным кожным гемифациальным аллотрансплантатами отсут- ствием иммуносупрессивной поддержки, из них шесть крыс-реципиентов были с васкуляризи- рованными гемифациальными аллотрансплан- татами, остальные восемь лоскутов методом свободной пересадки. Хирургический этап эксперимента был про- веден в операционной кафедры оперативной хи- 28 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ рургии СЗГМУ им. И.И. Мечникова, который выполняли сотрудники университета, имеющие соответствующую подготовку и квалификацию в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» [18]. Все манипуляции с животными проводи- лись в помещении при температурном режиме 18-23°C с использованием инструментов, про- шедших стерилизацию автоклавированием. Со- гласно протоколу хирургического вмешатель- ства, каждое животное было идентифицировано разноцветной маркировкой несмываемыми чер- нилами на ухе, фиксировалось время введения наркоза донору и реципиенту, количество вве- денной анестезирующей смеси, время начала и окончания операции, продолжительность опе- рации трансплантации, а также время выхода реципиента из наркоза. Анестезиологическое пособие. Экспери- ментальным животным проводилась комбини- рованная анестезия с подкожным введением препаратов домитор («Orionpharma») в дозе 2 мг/100 г и кетамин (ФГУП «Московский эндо- кринный завод») - 3 мг/100 г соответственно. Протокол операции После введения анестезирующей смеси и фиксации крысыпроводилась трехкратная об- работка кожи 0,05% раствором хлоргексидина. По предоперационной разметке у крысы-доно- ра выполнялся разрез одноразовым стерильным скальпелем по средней носолобной линии, за- тем периназально к краю губы, далее над мыш- цей поднимающей верхнюю губу с переходом на область шеи и в направлении от плеча к уху (рис. 1). Ушная раковина при этом оставалась интактной, как и двухмиллиметровый край в окологлазничной и околоротовой области. В лоскут включаласьтолько кожа, отслоенная от подлежащих тканей после гидропрепаровки 0,9% физиологическим раствором. Забранный неваскуляризированный трансплантат погру- жался в раствор гепарина. Аналогично произ- водилась отслойка фациальной кожи у крысы- реципиента. Полнослойный кожный лоскут укладывалсяна раневую поверхность, фиксиро- вался узловыми швами с использованием шов- ного материала Пролен 5.0. При трансплантации васкуляризированного кожного лоскута на переднебоковой поверхно- сти шеи донора через подкожную мышцу был осуществлен доступ к кивательной мышце, ви- зуализирована общая сонная артерия и ее ветви: наружная и внутренняя. После перевязки вет- Рис. 1. Зона отслойки полнослойного кожного гемифациального лоскута у экспериментального животного (выделено черным цветом) вей наружной сонной артерии у крысы-донора была выполнена эксплантация гемифациально- го кожного лоскута согласно предоперационной разметке. После подготовки при 24-кратном увеличении операционного микроскопа Carl Zeiss с использованием пролена 10/0 был нало- жен артерио-артериальный анастомоз «конец в бок» между общей сонной артерией реципиента и наружной сонной артерией донора. Венозный анастомоз выполнен «конец в конец». Рис. 2. Вид общей сонной артерии донора Зона вибриссов остается интактной, так как играет важную сенсорную (обычно осязатель- ную, механочувствительную) функцию. Это один из основных органов чувств. Крысиные вибриссы колеблются с частотой около 8 Гц. Ка- саясь «усами» окружающих предметов, крыса оценивает своё внешнюю среду. В мозге крысы каждому вибриссу соответствует определённая зона. Одновременно с ритмической пальпацией вибриссами крыса совершает вдохи и выдохи, обнюхивая окружающие предметы. Том 9 № 2 2017 29 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 3. Вид крысы-реципиента исследуемой группы сразу после операции. донор- белошерстная крыса семейства Wistar Протокол иммуносупрессивной терапии После выполнения полнослойной кожной аллотрансплантации крысам-реципиентам с первых по 7-е сутки проводилась иммуносу- прессивная терапия циклоспориномв дозе 12 мг/кг (препарат сандиммуннеорал, «Novartis», раствор для приема внутрь), которая коррек- тировалась в зависимости от показателей кле- точного иммунитета. Циклоспорин - препарат из группы селективных иммунодепрессантов, представляющий собой циклический полипеп- тид, состоящий из 11 аминокислот, ингибирую- щий активацию кальцийневрина лимфоцитов 647 antimouse/rat/human FOXP3 Antibody, PE Mouse IgG1, κ IsotypeCtrlAntibody, AlexaFluor® 647 Mouse IgG1, κ IsotypeCtrl (ICFC) Antibody, реактив для премобилизации лейкоцитов IntraPrep, фиксирующий раствор IOTest 3, лизирующийраствор VERSALYSE, Anti-Pan- Cytokeratin (AE1/AE3) AlexaFluor® 488 про- изводства «Biolegend», «BeckmanCoulter», «eBiosciense» (США). данные показатели для оценки иммунно- го статуса были выбраны в связи с тем, что Т-лимфоциты обеспечивают распознавание и уничтожение клеток, несущих чужеродные антигены, при этом снижение их абсолютного количества свидетельствует о недостаточно- сти клеточно-эффекторного звена иммунитета. Повышение количества Cd3+ наблюдается при гипериммунном ответе организма на различные стимулы. Снижение содержания В-лимфоцитов может наблюдаться при назначении иммуноде- прессантов, что актуально для трансплантологии. Натуральные киллеры (NK-клетки, Cd3-Cd (16+56)+) - популяция больших гранулярных лимфоцитов, способных лизировать клетки-ми- шени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения. Увеличение ко- личества NK-клеток может свидетельствовать об активации антитрансплантационного имв фазе G или G клеточного цикла. Под деймунитета, а снижение - при врожденных имствием препарата предотвращается активация Т-лимфоцитов и антигензависимое высвобож- дение лимфокинов, включая интерлейкин-2 (фактор роста Т-лимфоцитов). действие ци- клоспорина на лимфоциты обратимое. Лабораторный этап исследования был вы- полнен в медицинском центре ФБУН НИИ эпи- демиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург. Проводилось количественное определение субпопуляций лимфоцитов Cd3+, Cd4+, Cd8a+, Cd161+, Cd25+, Cd45RA+, Cd20+ в периферической крови исследуемых крыс в динамике (до операции, а также на 3-и, 15-е и 45-е сутки после аллотрансплантации). Субпопуляционный состав лимфоцитов определялся методом проточной цитометрии с помощью набора следующих реактивов:FITC anti-rat Cd3 Antibody, PE anti-rat Cd8a Antibody, PE/Cy7anti-rat Cd4 Antibody, AlexaFluor® 64anti-rat Cd161 Antibody, FITCanti-rat Cd3 Antibody, APC anti-rat Cd45RA Antibody, FITC anti-rat Cd3 Antibody, PE anti-rat Cd25 Antibody, PE/Cy7 anti-rat Cd4 Antibody, AlexaFluor® мунодефицитных состояниях, аутоиммунных заболеваниях, применении цитостатиков и кор- тикостероидов. ТNK-лимфоциты (Cd3+Cd (16+56)+) - это Т-лимфоциты, несущие на сво- ей поверхности маркеры Cd16+ и Cd 56+ и имеющие свойства как Т-, так и NK-клеток. Методы статистического анализа Статистическаяобработка результатов про- ведена с помощью программ Excel для Windows XP. Расчитывались значения средней величины (М),ошибки средней (m), стандартного откло- нения. для описания различий между двумя не- зависимыми выборками, выходящими за рамки нормального распределения, использовался не- параметрический u-критерий Манна-Уитни. При р<0,05 различия считали достоверно значимыми. Результаты исследования и обсуждение У реципиентов контрольной группы им- мунный ответ на трансплантацию аллогенной кожи проявлялся в резкой активации иммуно- логических механизмов, о чем свидетельствует 30 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ значительное повышение практических всех ис- следуемых показателей Т-клеточного звена им- мунитета у 75% крыс-реципиентов на 3-е сутки после операции (табл. 1). При клиническом осмотре животных в пер- вые трое суток после операции у 8 животных было выявлено утолщение и возвышение краев трансплантата над окружающими тканями, по линии швов сформировался струп корич- нево-бурого цвета, при надавливании из-под которого выделялся серозно-геморрагический экссудат. В этот временное период 11 из 14 крыс-реципиентов были малоподвижны, воду и пищу употребляли в недостаточном количестве. Таблица 1 Динамика иммунологических показателей у крыс-реципиентов контрольной группы после гемифациальной аллотрансплантации полнослойного кожного лоскута Показатели (М±m) Ед. изм-я - event до операции 3-и сутки 15-е сутки 45-е сутки Т-лимфоциты Т-хелперы Цитотоксические лимфоциты NK-клетки TNK-клетки N-активированные клетки В-лимфоциты Т-активированные клетки 312.1±78.0 412.6±34.5 13.5±3.2 39.7±12.1 28.9±5.7 19.6±7.8 5.4±2.1 2.9±1.4 3480.2±549.8 1843.1±439.0 790.2±217.7 96.4±39.8 86.5±29.4 439.2±143.5 19.7±5.4 7.9±2.1 1276.9±265.3 1334.2±489.8 739.1±209.4 81.1±12.8 37.0±5.3 219.8±52.5 20.5±9.2 5.7±1.9 549.9±133.7 639.9±214.3 97.0±17.6 56.4±9.2 41.2±23.7 56.3±17.0 13.6±2.2 4.3±0.6 Вышеперечисленные изменения иммуноло- гических показателей наблюдались и на 15-е сут- ки посттрансплантационного периода, однако их выраженность была менее значимой. У всех реципиентов контрольной группы в период с 3-х по 15-е суткипроизошло полное или частичное отторжение трансплантата, средняя площадь не- кроза лоскута составляла 27±16% от общей пло- щади алоотрансплантата. На 15-е сутки зафиксиро- вано снижение веса до 270±14 г у 12 крыс (рис. 2). Восстановление активности и увеличение массы животных до 290±5 г у 6 крыс отмечалось на 30-е сутки после аллотрансплантации. К концу исследуемого периода у всех крыс- реципиентов без иммунносупресивной терапии произошло полное отторжение кожного лоскута с последующим рубцеванием акцепторного ложа, независимо от наличия или отсутствия хирурги- ческой васкуляризации. При этом у них на 45-е послеоперационные сутки в периферической крови сохранялось повышенное количество ци- тотоксических Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Описанные изменения в данной группе приняты нами за адекватный ответ иммунной системы на операционную травму с пересадкой чужеродной кожи при отсутствие иммуносупрессивной те- рапии. Вместе с тем, летальных исходов в кон- трольной группе зафиксировано не было. Рис. 4. Вид крысы-реципиента контрольной группы на 15-е сутки после аллотрансплантации полнослойного васкуляризированного кожного лоскута Укрыс-реципиентов исследуемой группы наиболее выраженные изменения иммуно- логических показателей также наблюдались в раннем послеоперационном периоде, при этом на 3-и сутки количество цитотоксических Т-лимфоцитов и TNK-клеток было значимо выше, чем в контрольной группе, не получав- ших циклоспорин (табл. 2). В связи с высокими показателями Т-клеточного иммунитета, а также клинически- ми симптомами начинающейся реакции «транс- Том 9 № 2 2017 31 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ плантат против хозяина» (РТПХ) крысам-ре- ципиентам после 3-х суток наблюдения доза препарата сандиммуннеорал была увеличена с 12 мг/кг до 15 мг/кг. В частности, на 3-е сутки при осмотре у 8 реципиентов, а спустя 2-4 суток еще у 4 особей выявлялись признаки ишемии кожи трансплантата, диагностированные надрезом на всю толщу лоскута. Интенсивность окраски лоскута варьировала от бледно-розо- вого до темно-бордового цвета, у 35% животных трансплантаты приобрели багровую окраску вследствие имбибирования кровью, также опре- делялся незначительный серозный выпотпо ли- нии швов. Таблица 2 Динамика иммунологических показателей у крыс-реципиентов исследуемой группы после гемифациальной аллотрансплантации полнослойного неваскуляризированного кожного лоскута Показатели (М±m) Ед. изм-я - event до операции 3-и сутки 15-е сутки 45-е сутки Т-лимфоциты Т-хелперы Цитотоксические лимфоцит NK-клетки TNK-клетки N-активированные клетки В-лимфоциты Т-активированные клетки 387.6±53.9 487.3±129.2 74.5±22.8* 43.7±17.6 39.7±9.4* 23.7±4.1 5.2±2.5 2.6±1.1* 2109.1±23.7 1346.8±329.7* 949.4±234.7* 78.4±45.9* 365.2±56.8 305.1±21.0 12.9±2.1* 14.5±3.9 947.6±91.7* 714.6±71.8 146.6±39.8* 73.8±41.6 215.0±143.2 50.2±41.1* 19.4±7.9 3.0±0.8* 652.5±190.0* 631.5±97.9* 128.8±12.9 45.7±9.5* 213.4±43.9 46.2±11.0* 31.7±6.3 15.9±2.4 *) р<0,05 в сравнении со средним значением показателей контрольной группы К 15-м суткам у 6 животных (особи с ранее выявленными проявлениями ишемии транс- плантата)указанные признаки сменились ча- стичным отторжением лоскута с явлениями краевого некроза(область некроза занимала 14±6% от общей площади донорской кожи). дальнейшее заживление послеоперационной раны в области швов, как и у животных кон- трольной группы, происходило под струпом. Следует особо подчеркнуть, что у 71% крыс исследуемой группыповышение дозы цикло- спорина, связанное с развитием РТПХ у ла- бораторных животных, сопровождалось уг- нетением иммунной системы и симптомами общего токсического воздействия, что прояв- лялось в замедлении двигательной активности крыс, снижении реакции на звуковые и болевые раздражителии др. Подавление клеточного зве- на иммунитета на фоне иммуносупрессивной терапии проявлялось в значимом снижении количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цито- токсическихи N-активированных клеток (табл. 2). После увеличения дозы циклоспорина дальней- шего отторжения кожного трансплантата не на- блюдалось, доза препарата составляла 15 мг/кг на протяжении всего исследования. Финальные результаты аллотранспланта- ции с положительным клиническим эффектом представлены на рис. 3. Летальность в исследуемой группе состави- ла 3 крысы - два случая на 30-е сутки и один Рис. 5. Вид крысы-реципиента исследуемой группы с аллотрансплантатом от черношерстной крысы-донора семейства darkAgouti на 45-е сутки после аллотрансплантации полнослойного неваскуляризированного кожного лоскута 32 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ на 41-е сутки. Ухудшение общего состояния по- гибших животных сопровождалось снижением их массы тела, начиная с 7-10 посттранспланта- ционных суток (масса тела животных к моменту летального исхода составила 198 г, 163 г и 192 г соответственно при первоначальной массе бо- лее 300 г), более глубоким угнетением клеточ- ного и гуморального звеньев иммунитета, а так- же появлением у них признаков инфекционного процесса (при осмотре аллотрансплантата у этих крыс, начиная с 12-х суток наблюдалось незначи- тельное гнойное отделяемое по линии швов). Таким образом, увеличение дозы циклоспори- на для купирования РТПХ у крыс-реципиентов в некоторых случаях сопровождалось более глу- бокой иммуносупрессией с развитием инфекци- онных осложнений и последующим летальным исходом, что свидетельствует о необходимости индивидуальной коррекции дозы циклоспори- на. Одним из предикторов таких осложнений может являться прогрессирующее снижение массы тела лабораторных животных. выводы Результаты проведенного исследования сви- детельствуют о том, что фациальная трансплан- тация полнослойного кожного неваскуляризи- рованного лоскута, выполненная в эксперименте на крысах, является хирургически оправданной моделью для отработки практических навыков, а также изучения иммунологического ответа на трансплантацию в раннем и позднем послеопе- рационных периодах у лабораторных животных и возможностей его коррекции. В раннем по- слеоперационном периоде выявлена активация клеточного звена иммунитета. В позднем по- слеоперационном периоде возможно говорить о присоединении гуморального звена иммунного ответа. Монотерапию циклоспорином можно считать достаточной.

About the authors

O G Hurtsilava

North-West State Medical university named after I.I. Mechnikov

M A Voloh

North-West State Medical university named after I.I. Mechnikov

A M Lila

North-West State Medical university named after I.I. Mechnikov

S A Aksenova

North-West State Medical university named after I.I. Mechnikov

References

Supplementary files