CLINICAL ANd IMMuNOLOGICAL CHARACTERISTICS POSTOPERATIVE PERIOd AT HEMIFACIAL ALLOGRAFTS AVASCuLAR SKIN FLAP

Cover Page

Abstract


In an experiment on rats Wistar family and dark Agouti immunological status of recipients has been studied with facial allograft skin flap in the early and late postoperative periods. The evaluation of the state of the transplant and the general condition of the recipient rats after surgery immunosuppressive therapy.

Несмотря на широкое распространение ал- логенной трансплантации органов и тканей, требуется постоянное совершенствование прак- тического опыта по пересадке структур лица. В настоящее время проводится большое количе- ство научно-исследовательских работ по опти- мизации схем отбора реципиентов и доноров, методов хирургической тактики, иммуносу- прессивной терапии, а также разрабатываются стратегии использования большего объема ал- логенной ткани с целью максимального восста- новления функционально-эстетических харак- теристик лица [11-14]. Как известно, активация иммунокомпетент- ных клеток в ответ на внедрение чужеродного антигена является физиологическим процессом, направленным на поддержание внутреннего го- меостаза организма, при этом выраженность иммунного ответа коррелирует с особенностя- ми антигена и состоянием иммунной системы реципиента. Активация иммунных реакций в ответ на пересадку аллогенных тканей разви- вается уже в первые минуты после трансплан- тации, а наиболее значимые иммунологические изменения у реципиента происходят в первые четыре недели после операции. В этой связи анализ и интерпретация клинико-иммунологи- ческих показателей у реципиентов в различные сроки после пересадки кожи фациальной обла- сти являются очень важным и как для определе- ния этапов формирования посттрансплантаци- онного иммунитета, так и ранней диагностики процесса отторжения тканей [15, 17]. В коже представленны все типы клеток уча- ствующих в формировании иммунного ответа (нейтрофилы, клетки Лангерганса, тучные клет- ки, кератиноциты, эозинофилы), кожу можно считать высоко иммуногенным органом [4,7 ]. Материалы и методы исследования Объект исследования. для исследования были выбраны крысы-самцы семейств Wistar и dark Agouti в возрасте 4-х месяцев и весом более 300 граммов, которые были выведены в питом- нике Рапполово (г. Санкт-Петербург). Крысы в качестве модельных животных использовались- ввиду доступности получения противокрыси- ных антител для распознавания поверхностных эпитопов иммуноцитов реципиента. В исследуемую группу были включены кры- сы-реципиенты (n=14) с фациальным транс- плантатом, состоящим из кожи головы и шеи животного, из них 10 были с полнослойным кожным аллотрансплантатом от белошерст- ных крыс-доноров линии Wistar и 4 с таким же аллотрансплантатом от черношерстных крыс линейки dark Agouti. Клинико-лабораторный мониторинг включал оценку общего состояния реципиентов и ряда иммунологических пока- зателей в предоперационном периоде, а также на 3-и, 15-е и 45-е сутки после трансплантации. Контрольную группу (n=14) составили живот- ные с аналогичным полнослойным кожным гемифациальным аллотрансплантатами отсут- ствием иммуносупрессивной поддержки, из них шесть крыс-реципиентов были с васкуляризи- рованными гемифациальными аллотрансплан- татами, остальные восемь лоскутов методом свободной пересадки. Хирургический этап эксперимента был про- веден в операционной кафедры оперативной хи- 28 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ рургии СЗГМУ им. И.И. Мечникова, который выполняли сотрудники университета, имеющие соответствующую подготовку и квалификацию в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации» [18]. Все манипуляции с животными проводи- лись в помещении при температурном режиме 18-23°C с использованием инструментов, про- шедших стерилизацию автоклавированием. Со- гласно протоколу хирургического вмешатель- ства, каждое животное было идентифицировано разноцветной маркировкой несмываемыми чер- нилами на ухе, фиксировалось время введения наркоза донору и реципиенту, количество вве- денной анестезирующей смеси, время начала и окончания операции, продолжительность опе- рации трансплантации, а также время выхода реципиента из наркоза. Анестезиологическое пособие. Экспери- ментальным животным проводилась комбини- рованная анестезия с подкожным введением препаратов домитор («Orionpharma») в дозе 2 мг/100 г и кетамин (ФГУП «Московский эндо- кринный завод») - 3 мг/100 г соответственно. Протокол операции После введения анестезирующей смеси и фиксации крысыпроводилась трехкратная об- работка кожи 0,05% раствором хлоргексидина. По предоперационной разметке у крысы-доно- ра выполнялся разрез одноразовым стерильным скальпелем по средней носолобной линии, за- тем периназально к краю губы, далее над мыш- цей поднимающей верхнюю губу с переходом на область шеи и в направлении от плеча к уху (рис. 1). Ушная раковина при этом оставалась интактной, как и двухмиллиметровый край в окологлазничной и околоротовой области. В лоскут включаласьтолько кожа, отслоенная от подлежащих тканей после гидропрепаровки 0,9% физиологическим раствором. Забранный неваскуляризированный трансплантат погру- жался в раствор гепарина. Аналогично произ- водилась отслойка фациальной кожи у крысы- реципиента. Полнослойный кожный лоскут укладывалсяна раневую поверхность, фиксиро- вался узловыми швами с использованием шов- ного материала Пролен 5.0. При трансплантации васкуляризированного кожного лоскута на переднебоковой поверхно- сти шеи донора через подкожную мышцу был осуществлен доступ к кивательной мышце, ви- зуализирована общая сонная артерия и ее ветви: наружная и внутренняя. После перевязки вет- Рис. 1. Зона отслойки полнослойного кожного гемифациального лоскута у экспериментального животного (выделено черным цветом) вей наружной сонной артерии у крысы-донора была выполнена эксплантация гемифациально- го кожного лоскута согласно предоперационной разметке. После подготовки при 24-кратном увеличении операционного микроскопа Carl Zeiss с использованием пролена 10/0 был нало- жен артерио-артериальный анастомоз «конец в бок» между общей сонной артерией реципиента и наружной сонной артерией донора. Венозный анастомоз выполнен «конец в конец». Рис. 2. Вид общей сонной артерии донора Зона вибриссов остается интактной, так как играет важную сенсорную (обычно осязатель- ную, механочувствительную) функцию. Это один из основных органов чувств. Крысиные вибриссы колеблются с частотой около 8 Гц. Ка- саясь «усами» окружающих предметов, крыса оценивает своё внешнюю среду. В мозге крысы каждому вибриссу соответствует определённая зона. Одновременно с ритмической пальпацией вибриссами крыса совершает вдохи и выдохи, обнюхивая окружающие предметы. Том 9 № 2 2017 29 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 3. Вид крысы-реципиента исследуемой группы сразу после операции. донор- белошерстная крыса семейства Wistar Протокол иммуносупрессивной терапии После выполнения полнослойной кожной аллотрансплантации крысам-реципиентам с первых по 7-е сутки проводилась иммуносу- прессивная терапия циклоспориномв дозе 12 мг/кг (препарат сандиммуннеорал, «Novartis», раствор для приема внутрь), которая коррек- тировалась в зависимости от показателей кле- точного иммунитета. Циклоспорин - препарат из группы селективных иммунодепрессантов, представляющий собой циклический полипеп- тид, состоящий из 11 аминокислот, ингибирую- щий активацию кальцийневрина лимфоцитов 647 antimouse/rat/human FOXP3 Antibody, PE Mouse IgG1, κ IsotypeCtrlAntibody, AlexaFluor® 647 Mouse IgG1, κ IsotypeCtrl (ICFC) Antibody, реактив для премобилизации лейкоцитов IntraPrep, фиксирующий раствор IOTest 3, лизирующийраствор VERSALYSE, Anti-Pan- Cytokeratin (AE1/AE3) AlexaFluor® 488 про- изводства «Biolegend», «BeckmanCoulter», «eBiosciense» (США). данные показатели для оценки иммунно- го статуса были выбраны в связи с тем, что Т-лимфоциты обеспечивают распознавание и уничтожение клеток, несущих чужеродные антигены, при этом снижение их абсолютного количества свидетельствует о недостаточно- сти клеточно-эффекторного звена иммунитета. Повышение количества Cd3+ наблюдается при гипериммунном ответе организма на различные стимулы. Снижение содержания В-лимфоцитов может наблюдаться при назначении иммуноде- прессантов, что актуально для трансплантологии. Натуральные киллеры (NK-клетки, Cd3-Cd (16+56)+) - популяция больших гранулярных лимфоцитов, способных лизировать клетки-ми- шени, инфицированные вирусами и другими внутриклеточными антигенами, опухолевые клетки, а также другие клетки аллогенного и ксеногенного происхождения. Увеличение ко- личества NK-клеток может свидетельствовать об активации антитрансплантационного имв фазе G или G клеточного цикла. Под деймунитета, а снижение - при врожденных имствием препарата предотвращается активация Т-лимфоцитов и антигензависимое высвобож- дение лимфокинов, включая интерлейкин-2 (фактор роста Т-лимфоцитов). действие ци- клоспорина на лимфоциты обратимое. Лабораторный этап исследования был вы- полнен в медицинском центре ФБУН НИИ эпи- демиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург. Проводилось количественное определение субпопуляций лимфоцитов Cd3+, Cd4+, Cd8a+, Cd161+, Cd25+, Cd45RA+, Cd20+ в периферической крови исследуемых крыс в динамике (до операции, а также на 3-и, 15-е и 45-е сутки после аллотрансплантации). Субпопуляционный состав лимфоцитов определялся методом проточной цитометрии с помощью набора следующих реактивов:FITC anti-rat Cd3 Antibody, PE anti-rat Cd8a Antibody, PE/Cy7anti-rat Cd4 Antibody, AlexaFluor® 64anti-rat Cd161 Antibody, FITCanti-rat Cd3 Antibody, APC anti-rat Cd45RA Antibody, FITC anti-rat Cd3 Antibody, PE anti-rat Cd25 Antibody, PE/Cy7 anti-rat Cd4 Antibody, AlexaFluor® мунодефицитных состояниях, аутоиммунных заболеваниях, применении цитостатиков и кор- тикостероидов. ТNK-лимфоциты (Cd3+Cd (16+56)+) - это Т-лимфоциты, несущие на сво- ей поверхности маркеры Cd16+ и Cd 56+ и имеющие свойства как Т-, так и NK-клеток. Методы статистического анализа Статистическаяобработка результатов про- ведена с помощью программ Excel для Windows XP. Расчитывались значения средней величины (М),ошибки средней (m), стандартного откло- нения. для описания различий между двумя не- зависимыми выборками, выходящими за рамки нормального распределения, использовался не- параметрический u-критерий Манна-Уитни. При р<0,05 различия считали достоверно значимыми. Результаты исследования и обсуждение У реципиентов контрольной группы им- мунный ответ на трансплантацию аллогенной кожи проявлялся в резкой активации иммуно- логических механизмов, о чем свидетельствует 30 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ значительное повышение практических всех ис- следуемых показателей Т-клеточного звена им- мунитета у 75% крыс-реципиентов на 3-е сутки после операции (табл. 1). При клиническом осмотре животных в пер- вые трое суток после операции у 8 животных было выявлено утолщение и возвышение краев трансплантата над окружающими тканями, по линии швов сформировался струп корич- нево-бурого цвета, при надавливании из-под которого выделялся серозно-геморрагический экссудат. В этот временное период 11 из 14 крыс-реципиентов были малоподвижны, воду и пищу употребляли в недостаточном количестве. Таблица 1 Динамика иммунологических показателей у крыс-реципиентов контрольной группы после гемифациальной аллотрансплантации полнослойного кожного лоскута Показатели (М±m) Ед. изм-я - event до операции 3-и сутки 15-е сутки 45-е сутки Т-лимфоциты Т-хелперы Цитотоксические лимфоциты NK-клетки TNK-клетки N-активированные клетки В-лимфоциты Т-активированные клетки 312.1±78.0 412.6±34.5 13.5±3.2 39.7±12.1 28.9±5.7 19.6±7.8 5.4±2.1 2.9±1.4 3480.2±549.8 1843.1±439.0 790.2±217.7 96.4±39.8 86.5±29.4 439.2±143.5 19.7±5.4 7.9±2.1 1276.9±265.3 1334.2±489.8 739.1±209.4 81.1±12.8 37.0±5.3 219.8±52.5 20.5±9.2 5.7±1.9 549.9±133.7 639.9±214.3 97.0±17.6 56.4±9.2 41.2±23.7 56.3±17.0 13.6±2.2 4.3±0.6 Вышеперечисленные изменения иммуноло- гических показателей наблюдались и на 15-е сут- ки посттрансплантационного периода, однако их выраженность была менее значимой. У всех реципиентов контрольной группы в период с 3-х по 15-е суткипроизошло полное или частичное отторжение трансплантата, средняя площадь не- кроза лоскута составляла 27±16% от общей пло- щади алоотрансплантата. На 15-е сутки зафиксиро- вано снижение веса до 270±14 г у 12 крыс (рис. 2). Восстановление активности и увеличение массы животных до 290±5 г у 6 крыс отмечалось на 30-е сутки после аллотрансплантации. К концу исследуемого периода у всех крыс- реципиентов без иммунносупресивной терапии произошло полное отторжение кожного лоскута с последующим рубцеванием акцепторного ложа, независимо от наличия или отсутствия хирурги- ческой васкуляризации. При этом у них на 45-е послеоперационные сутки в периферической крови сохранялось повышенное количество ци- тотоксических Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Описанные изменения в данной группе приняты нами за адекватный ответ иммунной системы на операционную травму с пересадкой чужеродной кожи при отсутствие иммуносупрессивной те- рапии. Вместе с тем, летальных исходов в кон- трольной группе зафиксировано не было. Рис. 4. Вид крысы-реципиента контрольной группы на 15-е сутки после аллотрансплантации полнослойного васкуляризированного кожного лоскута Укрыс-реципиентов исследуемой группы наиболее выраженные изменения иммуно- логических показателей также наблюдались в раннем послеоперационном периоде, при этом на 3-и сутки количество цитотоксических Т-лимфоцитов и TNK-клеток было значимо выше, чем в контрольной группе, не получав- ших циклоспорин (табл. 2). В связи с высокими показателями Т-клеточного иммунитета, а также клинически- ми симптомами начинающейся реакции «транс- Том 9 № 2 2017 31 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ плантат против хозяина» (РТПХ) крысам-ре- ципиентам после 3-х суток наблюдения доза препарата сандиммуннеорал была увеличена с 12 мг/кг до 15 мг/кг. В частности, на 3-е сутки при осмотре у 8 реципиентов, а спустя 2-4 суток еще у 4 особей выявлялись признаки ишемии кожи трансплантата, диагностированные надрезом на всю толщу лоскута. Интенсивность окраски лоскута варьировала от бледно-розо- вого до темно-бордового цвета, у 35% животных трансплантаты приобрели багровую окраску вследствие имбибирования кровью, также опре- делялся незначительный серозный выпотпо ли- нии швов. Таблица 2 Динамика иммунологических показателей у крыс-реципиентов исследуемой группы после гемифациальной аллотрансплантации полнослойного неваскуляризированного кожного лоскута Показатели (М±m) Ед. изм-я - event до операции 3-и сутки 15-е сутки 45-е сутки Т-лимфоциты Т-хелперы Цитотоксические лимфоцит NK-клетки TNK-клетки N-активированные клетки В-лимфоциты Т-активированные клетки 387.6±53.9 487.3±129.2 74.5±22.8* 43.7±17.6 39.7±9.4* 23.7±4.1 5.2±2.5 2.6±1.1* 2109.1±23.7 1346.8±329.7* 949.4±234.7* 78.4±45.9* 365.2±56.8 305.1±21.0 12.9±2.1* 14.5±3.9 947.6±91.7* 714.6±71.8 146.6±39.8* 73.8±41.6 215.0±143.2 50.2±41.1* 19.4±7.9 3.0±0.8* 652.5±190.0* 631.5±97.9* 128.8±12.9 45.7±9.5* 213.4±43.9 46.2±11.0* 31.7±6.3 15.9±2.4 *) р<0,05 в сравнении со средним значением показателей контрольной группы К 15-м суткам у 6 животных (особи с ранее выявленными проявлениями ишемии транс- плантата)указанные признаки сменились ча- стичным отторжением лоскута с явлениями краевого некроза(область некроза занимала 14±6% от общей площади донорской кожи). дальнейшее заживление послеоперационной раны в области швов, как и у животных кон- трольной группы, происходило под струпом. Следует особо подчеркнуть, что у 71% крыс исследуемой группыповышение дозы цикло- спорина, связанное с развитием РТПХ у ла- бораторных животных, сопровождалось уг- нетением иммунной системы и симптомами общего токсического воздействия, что прояв- лялось в замедлении двигательной активности крыс, снижении реакции на звуковые и болевые раздражителии др. Подавление клеточного зве- на иммунитета на фоне иммуносупрессивной терапии проявлялось в значимом снижении количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов, цито- токсическихи N-активированных клеток (табл. 2). После увеличения дозы циклоспорина дальней- шего отторжения кожного трансплантата не на- блюдалось, доза препарата составляла 15 мг/кг на протяжении всего исследования. Финальные результаты аллотранспланта- ции с положительным клиническим эффектом представлены на рис. 3. Летальность в исследуемой группе состави- ла 3 крысы - два случая на 30-е сутки и один Рис. 5. Вид крысы-реципиента исследуемой группы с аллотрансплантатом от черношерстной крысы-донора семейства darkAgouti на 45-е сутки после аллотрансплантации полнослойного неваскуляризированного кожного лоскута 32 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ на 41-е сутки. Ухудшение общего состояния по- гибших животных сопровождалось снижением их массы тела, начиная с 7-10 посттранспланта- ционных суток (масса тела животных к моменту летального исхода составила 198 г, 163 г и 192 г соответственно при первоначальной массе бо- лее 300 г), более глубоким угнетением клеточ- ного и гуморального звеньев иммунитета, а так- же появлением у них признаков инфекционного процесса (при осмотре аллотрансплантата у этих крыс, начиная с 12-х суток наблюдалось незначи- тельное гнойное отделяемое по линии швов). Таким образом, увеличение дозы циклоспори- на для купирования РТПХ у крыс-реципиентов в некоторых случаях сопровождалось более глу- бокой иммуносупрессией с развитием инфекци- онных осложнений и последующим летальным исходом, что свидетельствует о необходимости индивидуальной коррекции дозы циклоспори- на. Одним из предикторов таких осложнений может являться прогрессирующее снижение массы тела лабораторных животных. выводы Результаты проведенного исследования сви- детельствуют о том, что фациальная трансплан- тация полнослойного кожного неваскуляризи- рованного лоскута, выполненная в эксперименте на крысах, является хирургически оправданной моделью для отработки практических навыков, а также изучения иммунологического ответа на трансплантацию в раннем и позднем послеопе- рационных периодах у лабораторных животных и возможностей его коррекции. В раннем по- слеоперационном периоде выявлена активация клеточного звена иммунитета. В позднем по- слеоперационном периоде возможно говорить о присоединении гуморального звена иммунного ответа. Монотерапию циклоспорином можно считать достаточной.

O G Hurtsilava

North-West State Medical university named after I.I. Mechnikov

M A Voloh

North-West State Medical university named after I.I. Mechnikov

A M Lila

North-West State Medical university named after I.I. Mechnikov

S A Aksenova

North-West State Medical university named after I.I. Mechnikov

  1. Devauchelle B., Badet L., Lengele B., et al. First Human Face Allograft: early report. Lancet, 2006. - P. 203209.
  2. Lantieri L., Meningaud J.P., Grimbert P., et al. Repair of the lower and middle parts of the face by composite tissue allotransplantation in a patient with massive plexiformneurofibroma: a 1year followup study. Lancet, 2008. - P. 372.
  3. Siemionow M., Papay F., Alam D., et al. Neartotal human face transplantation for a severely disfigured patient in the USA. Lancet, 2009. - P. 203209.
  4. Pomahac B., Aflaki P., Nelson C., et al. Evaluation of appearance transfer and persistence in central face transplantation: a computer simulation analysis. J PlastReconstrAesthetSurg, 2010. - P. 63.
  5. Baccarani A., Follmar K.E., Das R.R., et al. A pilot study in subSMAs face transplantation: defining donor compatibility and assessing outcomes in a cadaver model. PlastReconstrSurg, 2007. - P. 121129.
  6. Pomahac B., Pribaz J., Eriksson E., et al. Restoration of facial form and function after severe disfigurement from burn injury by a composite facial allograft. Am J Transplant, 2011. - P. 386393.
  7. Siemionow M., Agaoglu G., Unal S. A cadaver study in preparation for facial allograft transplantation in humans: Part II. mock facial transplantation. PlastReconstrSurg, 2006. - P. 876885.
  8. Daly C.C. Saving face. South Med J, 2006. - P. 412413.
  9. Siemionow M., Unal S., Agaoglu G., et al. A cadaver study in preparation for facial allograft transplantation in humans: Part I. What are alternative sources for total facial defect coverage? PlastReconstr Surg., 2006. - P. 864.
  10. Siemionow M., Agaoglu G. Allotransplantation of the face: how close are we? ClinPlastSurg/, 2005. - P. 401409.
  11. Washington K.M., Solari M.G., Sacks J.M., et al. A model for functional recovery and cortical reintegration after hemifacial composite tissue allotransplantation. PlastReconstrSurg, 2009. - P. 123.
  12. Petit F., Paraskevas A., Minns A.B., et al. Face transplantation: where do westandy PlastReconstr Surg., 2004. - P. 33.
  13. Losee J.E., Schneeberger S., Lee W.P. Discussion. First U.S. neartotal human face transplantation: a paradigm shift for massive complex injuries. PlastReconstrSurg., 2010. - P. 123124.
  14. Siemionow M., Demir Y., Mukherjee A., et al. Development and maintenance of donorspecificchimerism in semiallogenic and fully major histocompatibility complex mismatched facial allograft transplants. Transplantation, 2005. - P. 558567.
  15. Siemionow M., Ozmen S., Demir Y. Prospects for facial allograft transplantation in humans. PlastReconstrSurg., 2004. - P. 113.
  16. Siemionow M., Klimczak A. Tolerance and future directions for composite tissue allograft transplants: Part II. PlastReconstrSurg., 2009. - P. 17.
  17. Wigmore S.J. Face transplantation: the view from Birmingham, England. South MedJ., 2006. - P. 424426.
  18. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Views

Abstract - 126

PDF (Russian) - 93

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Hurtsilava O.G., Voloh M.A., Lila A.M., Aksenova S.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies