ASSESSING THE POSSIBILITY TO APPLY THE FIBRIN GLuE BY CORd BLOOd PLASMA AS A SCAFFOLd FOR MESENCHYMAL STEM CELLS TRANSPLANTATION

Cover Page

Abstract


Mesenchymal stem cells (MSCs) and pre-chondrocytes (MSK-Ch) derived from them are an ef- fective tool for the restoration and maintenance of joint cartilage. This approach is based on the use of MSCs as a) chondrocyte precursor to form a cartilaginous implant, b) producing a large number of bioactive factors in the area of implantation. delivery of MSC and MSC-Ch into the damaged joint can be achieved by the implantation of scaffold with cells to ensure retention of the cells at the injection site and an additional supply of cells of biologically active substances.Scaffold based on fibrin glue (FG) are promising because of the high biocompatibility, biodegrad- ability, ease of use. FG cryoprecipitate of autologous plasma (Au-FG) patient or allogeneic umbili- cal cord blood plasma (uCB-FG) in some cases may be regarded as a preferred embodiment of ready commercial products. The advantages of the Au-FG are to minimize the side effects, risks of infection and the occurrence of allergic reactions, availability and reduced cost of the procedure. uCB-FG is enriched with biologically active substances and derived from byproduct during collection stem cells from the cord blood.We have developed a protocol that allows to obtain FG in a closed system throughout the entire process of blood sampling until the transplant procedure, which makes it possible clinical application of the Au-FG and uCB-FG. Also shown that cultivation in Au-FG and uCB-FG does not change the immunophenotype of cells and the level of their proliferation and has a stimulating effect on chondro- genic differentiation.

Локальные посттравматические поврежде- ния хряща, а также дегенеративно-дистрофи- ческие повреждения хряща, такие как болезнь Кенига, остеоартроз 1-2 стадии являются рас- пространенным заболеванием. По статистике, от данной группы заболеваний в некоторых странах страдает до 22% населения. Таким образом, восстановление хряща явля- ется актуальной проблемой современной трав- матологии и ортопедии. На данный момент, несмотря на разнообразие применяемых для регенерации суставной поверхности методик, не существует адекватного подхода, который обеспечивал бы полное и долговременное вос- становление структуры и функциональной ак- тивности поврежденного сустава. Одним из перспективных подходов являет- ся использование биотрансплантатов, основой для которых могут служить аутологичные хондроциты или мезенхимные стромальные клетки (аутологичные или аллогенные). Использование аутологичных хондроцитов имеет ряд недостатков. Сниженная пролифе- ративная активность осложняет получение не- обходимого для терапевтического применения количества клеточного материала. Кроме того, инвазивная процедура забора фрагмента хря- щевой ткани сопряжена с риском возникнове- ния серьезных осложнений в области забора материала - donor site morbidity. Альтернативой является применение мезен- химных стромальных клеток (МСК), которые обладают способностью дифференцироваться в клетки тканей мезенхимного ряда, в том чис- ле, в хондроциты (Pittenger et al., 1999; Barry et al., 2004, Heng et al., 2004; Solchaga et al., 2011). МСК обладают более высоким пролифератив- ным потенциалом по сравнению с хондроцита- ми. Хондроциты, полученные в результате диф- Том 9 № 2 2017 35 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ференцировки из МСК, сохраняют способность делиться в течение более длительного периода, чем хондроциты, выделенные из фрагмента су- ставного хряща. Исторически сложилось, что основным ис- точником материала для исследований МСК длительное время служил костный мозг лабо- раторных животных и человека. Однако про- цедура забора костного мозга достаточно трав- матична, требует медикаментозной подготовки пациента, пребывания его в госпитале в течение суток, существует риск серьезных осложнений. В настоящее время известно, что МСК также можно получить из пуповинной крови, пупоч- ного канатика и жировой ткани, а также из мо- билизованной периферической крови (Wagner et al., 2005, Jin HJ et al., 2013). По нашим дан- ным, МСК из жировой ткани и пупочного кана- тика по своим свойствам очень близки к МСК, выделенным из костного мозга. А МСК из пу- почного канатика по своему пролиферативному потенциалу даже превосходят клетки, получен- ные из костного мозга (Айзенштадт и др., 2015). для создания трансплантата нужной формы, доставки клеток, удержания их на месте инъек- ции, создания оптимальной среды для роста, а также для усиления лечебного эффекта от при- менения МСК используются различные поддер- живающие матрицы (т.н. скаффолды). Разраба- тываются скаффолды с разными физическими и химическими свойствами, в том числе гидрогели на основе различных компонентов (напр. гиалу- роновой кислоты или фибрина). К достоинствам гидрогелей можно отнести высокое содержание жидкости и способность после полимеризации надежно удерживать клетки (Slaughter et al., 2009). Гель на основе фибрина (т.н. фибриновый клей) обладает рядом уникальных преимуществ: (а) для его создания возможно использование как аллогенной, так и аутологичной плазмы в каче- стве источника фибриногена, (б) полимеризация геля происходит при участии нецитотоксичных инициаторов (тромбин, соли кальция) (в) сам гель обладает достаточно прочной структурой, обеспечивающей надежное удержание клеток в месте инъекции, (г) наличие значительного объ- ема воды в геле позволяет вводить в него раз- личные биологически активные вещества, в т.ч. дифференцировочные факторы, противовоспа- лительные препараты и т.д, (д) фибрин является биодеградируемым материалом (Jockenhoevel et al., 2001; Swartz et al., 2005; Ahmed et al., 2008). Помимо этого, в тех случаях, когда нежелателен забор у пациента значительных объемов крови для получения нужного количества плазмы, в качестве источника фибриногена может исполь- зоваться и аллогенная плазма, в том числе плаз- ма пуповинной крови. Плазма пуповинной крови по своему составу значительно богаче биологи- чески активными веществами и ростовыми фак- торами по сравнению с плазмой крови взрослого человека (Fahdnis et al., 2006; Tekkatte et al., 2011; Pereira et al., 2014). Антиоксидантные свойства такой плазмы выше, чем у плазмы взрослого че- ловека (Wiedemann et al., 2003) дополнительным достоинством такого метода является возмож- ность использования плазмы, не используемой в трансфузиологии и обычно утилизируемой после выделения ядросодержащей фракции. Однако, использование плазмы пуповинной крови для приготовления фибринового клея теоретически может быть осложнено следующими факторами: (а) плазма пуповинной крови характеризуется меньшей вязкостью и (б) более низким содержа- нием фибриногена (в среднем 1.8 г/л) по сравне- нию с плазмой взрослого человека (референтные значения 2-4 г/л, 4,25 г/л у беременных женщин)) (Teger-Nilsson et ., 1974; Foley et al., 1978) в) повы- шенным содержанием фетальной формы фибри- ногена (фибриногена-420), снижающего скорость полимеризации фибрина и меняющего структуру фибриновых волокон (Mosesson et al., 2004). По- мимо этого плазма пуповинной крови обычно содержит значительный объем антикоагулянта в связи с тем, что образцы крови (малого объема - 40-100 мл) обычно собирают в стандартные меш- ки для сбора крови, рассчитанные на 450 мл и со- держащие около 50 мл антикоагулянта. Вместе с тем, степень фосфориллирования фибриногена и зависимость тромбинового времени от концен- трации солей кальция значительно сильнее выра- жена у новорожденных по сравнению со взрослы- ми (Hamulyak et al., 1983). Криопреципитация является одним из ме- тодов повышения концентрации фибриногена. (Pool et al., 1964). Криопреципитат представля- ет собой плохорастворимый концентрат высо- комолекулярных белков плазмы, получаемых при медленной разморозке плазмы при темпе- ратуре 1-6°С до консистенции «снежной каши- цы» («slushy»). Он обогащен коагулирующими белками плазмы, такими как фактор VIII, фи- бриноген, фактор фон Виллебранда, фибронек- тином. Концентрация фибриногена в криопре- ципитате возрастает в 2-10 раз по сравнению с плазмой. Остающаяся после криопреципитации плазма обеднена этими белками, но содержит все остальные компоненты плазмы и поэтому 36 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ часто используется в качестве растворителя для криопреципитата перед его использованием. Мы предположили, что использование мето- да криопреципитации для обогащения плазмы фибриногеном позволит использовать плазму пуповинной крови для приготовления фибри- нового клея. Цель работы Целью данного исследования являлась оцен- ка возможности использования фибриново- го клея на основе криопреципитата из плазмы пуповинной крови в качестве скаффолда для мезенхимальных стволовых клеток для после- дующего их применения при лечении дегенера- тивных поражений суставного хряща. Материалы и методы Клеточные культуры Образцы подкожной жировой ткани объемом 2-4 мл были получены в ходе липоэктоми с на- ружной поверхности бедра по стандартной ме- тодике. Ткань извлекали из контейнера с транс- портной средой, механически измельчали, затем инкубировали при 37°С в 0,2% растворе коллаге- назы (тип I, Sigma-Aldrich, США) в ФСР. дис- социированные клетки отмывали от фермента центрифугированием (400 G, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100-400 тыс. кл/см2. Смену среды проводили также через 72 ч. Пупочные канатики получали при неослож- ненных родах при наличии информированного согласия. МСК выделяли из периваскулярного пространства пупочной вены методом фермента- тивной обработки с помощью смеси коллагеназ I и IV. далее клетки культивировали в питатель- ной среде AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell media (HyClone), содержащей 10% заменителя сыворотки AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell Supplement (HyClone), 50 ед/мл пеницил- лина и 50 мкг/мл стрептомицина (далее «полная культуральная среда»). При достижении 70-80% конфлюентности монослоя МСК, клетки пересе- вали (не более 2 раз) при плотности 1000 кл/см2. МСК культивировали в условиях гипоксии разца. Образцы пуповинной крови получали при неосложненных родах, при наличии информиро- ванного согласия. В исследовании использовали образцы с группой крови A или AB, т.к. в таких об- разцах выше содержание в плазме фактора VIII. Образцы пуповинной крови объемом 70,1±18,4 мл (из них объем антикоагулянта - ЦФдА, цитрат-фосфат-декстроза-аденин - со- ставлял 49 мл) центрифугировали (10 мин при 250 g) в закрытой системе из двух полимер- ных контейнеров для сбора крови (Green Cross Medical Science Corporation, Корея). Эритроци- тарную массу и плазму разделяли с помощью плазмоэкстрактора Ностальгия (Россия). далее для получения криопреципитата следовали, в основном, протоколу Американской ассоциа- ции Банков Крови (AABB technical manual, 15th edition) с нашими модификациями. К пакету с плазмой подсоединяли пластиковый контейнер (Компопласт, Россия) и повторно центрифуги- ровали при 4500 g 10 мин при комнатной тем- пературе и затем с помощью плазмоэкстрактора отделяли супернатант (обедненная по тромбо- цитам плазма - platelet poor plasma) от осадка (остаточные эритроциты, тромбоциты). Часть плазмы (1 мл) использовали для определения количества фибриногена стандартными клини- ческими методами. Полученную плазму (30±15 мл из одного образца крови) замораживали и хранили в пластиковых контейнерах с запаян- ными портами при -80°С в течение 1-18 дней. для получения криопреципитата образец плазмы медленно размораживали при темпера- туре +4 - +6°С до консистенции «снежной ка- шицы» («slushy»). Криопреципитат отделяли от остальной плазмы одним из двух методов: а) цен- трифугированием при 4500 g 10 мин при +4°С и последующим пассивным сливанием плазмы в подсоединенный пакет или б) разделением за- мороженных кристаллов и растаявшей плазмы с помощью плазмоэкстрактора. После разделения и окончательного растаивания криопреципитата хлопья криопреципитированных высокомолеку- лярных белков плазмы растворяли в оставшейся в пакете плазме (примерно 10-15 мл), прогревая при 37°С в атмосфере 5% СО и 5% О с испольпакет до комнатной температуры. далее полузованием мультигазовых инкубаторов (BBd 6220, Thermo Scientific, США) с возможностью подачи азота. Получение обедненной тромбоцитами плазмы и криопреципитата Криопреципитат получали из плазмы пупо- винной крови, непригодной для выделения ядро- содержащей фракции по причине малого веса обченный криопреципитат немедленно замора- живали. Количество фибриногена определяли во всех фракциях (обедненная по тромбоцитам плазма, криопреципитат, отделенная от него (cryo-depleted) остаточная плазма). Приготовление фибринового клея При приготовлении фибринового клея с ресуспендированными в нем МСК, в основ- Том 9 № 2 2017 37 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ном, следовали протоколу Новозеландско- го Банка Крови (http://www.nzblood.co.nz/ assets/Transfusion-Medicine/PdFs/Fibrin-Glue- 111I027.pdf) с нашими модификациями. для получения фибринового клея с иммо- билизованными в нем клетками использовали двухкомпонентную систему, состоящую из раз- мороженного криопреципитата с ресуспендиро- ванными в нем клетками (3*105/мл или 106/мл) и тромбинового раствора. два компонента сме- шивались непосредственно перед внесением в лунку 6-луночного планшета. Тромбин (Baxter или Технология-Стандарт, Новосибирск) растворяли до концентрации 200u/мл или 32.5u/мл в полной культураль- ной среде (см. выше), что отличается от стан- дартного протокола получения клея для хирур- гии, однако повышает выживаемость МСК. для предотвращения фибринолиза и повышения ко- агулирующих свойств тромбинового раствора в полную культуральную среду перед внесением тромбина добавляли ингибитор фибринолиза аминокапроновую кислоту (до 2 г/л) и хлорид кальция (2 г/л). Приготовленный таким обра- зом раствор использовали в течение трех часов. МСК выращивали как описано выше до 70-80% конфлюэнтности. Клетки снимали с подложки раствором 0,25% трипсина (Gibco). Затем их ресуспендировали в 5 мл полной культуральной среды и центрифугировали при 800 g 5 мин. Осевшие клетки ресуспендирова- ли в свежеразмороженном криопреципитате таким образом, чтобы их концентрация состав- ляла 3*105/мл или 106/мл. Смешивание тромбинового раствора (0,5 мл) и МСК-содержащего криопреципитата (0,5 мл) осуществляли с помощью аппликационного набора duploject (Baxter) - системы из двух шприцов с общей иглой - непосредственно в момент внесения клея с клетками в лунки 6-лу- ночного планшета. Культивирование клеток в фибриновом клее После завершения полимеризации фибрино- вого клея с ресуспендированными клетками в лунки планшета над фибриновым сгустком на- слаивали полную культуральную среду (2 мл) и культивировали клетки в условиях гипоксии как описано выше в течение 7 дней. Смену сре- ды осуществляли каждые 2 дня. Исследовали клетки, как растущие в геле, так и покинувшие его. Методами световой микроскопии оценива- ли внешний вид клеток, число клеток, растущих вне геля, число одиночных клеток и колоний в геле. Через 7 дней фибриновый сгусток удаляли, а покинувшие его клетки (примерно 20% от общего числа клеток в лунке) использовали для изучения способности клеток из фибринового клея дифференцироваться в хондроцитарном направлении. Дифференцировка в хондроцитарном направлении клеток, полученных из фибри- нового клея Клетки, покинувшие гель, культивировали до достижения ими 60-70% конфлюэнтности и далее переносили в хондрогенную культураль- ную среду, содержащую 10% хондрогенного за- менителя сыворотки (hMSC Mesenchymal Stem Cell Chondrocyte differentiation Medium, Lonza) и культивировали согласно протоколу произво- дителя. Морфологию клеток оценивали на 3, 7 и 10 день от переноса в хондрогенную среду мето- дами световой микроскопии. Иммунофенотипирование полученных клеток Однородность выделенных первичных МСК, а также дифференцированных клеток, оценивали по экспрессии специфических по- верхностных антигенов - иммунофенотипи- ческих маркеров методом проточной цитоф- луорометрии. Поверхностные маркеры МСК выявляли с помощью меченных флуорохрома- ми антител против Cd10, Cd13, Cd34, Cd44, Cd45, Cd73, Cd90, Cd105 и Cd117 (Beckman Coulter, США) на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) в соответствии с инструкцией фирмы производителя. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения CXP. Окраска альциановым синим Клетки выращивали и дифференцировали на покровных стеклах. Образцы дважды про- мывали фосфатным буфером и фиксировали 4% параформальдегидом 10 минут при комнатной температуре. далее проводили окрашивание аль- циановым синим (рН 2,5), используя стандарт- ный протокол. Анализ данных проводили мето- дом световой микроскопии (Zeiss Axiovert 40 c). Статистические методы В ходе эксперимента проанализировано 8 об- разцов криопреципитата. Эксперименты с куль- тивированием клеток в фибриновом клее по- вторяли три раза. Результаты представлены как среднее ± ошибка среднего. для определения нормальности распределения переменных про- водился тест Колмогорова-Смирнова / Стати- стический анализ проводился с использованием t-критерия Стьюдента, ANOVA для связанных значений. Критический уровень значимости был принят p<0,05. Применялся стандартный 38 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ пакет прикладных программ: GraphPad Prism, Microsoft Excel 2003. Результаты и обсуждение Результаты измерения количества фибри- ногена в обедненной по тромбоцитам (PPP) плазме, криопреципитате и остаточной плазме представлены на рис. 1. Исходное количество фибриногена в PPP-плазме (1,60±0,08 г/л) было ниже нормы взрослого человека (2-4 г/л), а также среднего значения для концентрации фибриногена в пуповинной крови, 1.8 г/л (Foley et al., 1978). Такое низкое содержание фибрино- гена в плазме обусловлено как физиологически- ми свойствами плазмы пуповинной крови, так и довольно значительным (в 0,5-2 раза) разведе- нием крови при заборе в стандартный контей- нер. Помимо снижения концентрации фибри- ногена, наличие такого большого количества антикоагулянта меняет ионную силу раствора и концентрации солей, что также вносит погреш- ность в измерение тромбинового времени, что является основой метода измерения концентра- ции фибриногена. (Момот, 2006). Образцы свежеразмороженного криопреци- питата содержали фибриноген в количествах (2,25±0,14 г/л), меньше рекомендованных AABB (7-14 г/л), что связано с более низким со- держанием фибриногена в исходной плазме по причинам описанным выше. Также содержание фибриногена в получаемом нами криопреци- питате было ниже по сравнению с коммерчески производимым препаратом фибриногена, ис- пользуемом в препарате Тиссукол (60-70 г/л). Однако данный препарат был разработан, пре- жде всего, для использования в хирургии для удержания краев раны. Механические харак- теристики получаемого нами геля достаточны для получения прочного сгустка и удерживания в нем МСК (рис. 2). Кроме того, по данным Но со соавторами (Ho et al, 2006), низкое (5 г/л) содержание фибриногена обеспечивает более высокую скорость пролиферации клеток. При этом относительно мягкая, крупнопористая структура получаемого геля в данном случае играет положительную роль, т.к. облегчается миграция клеток и диффузия биологически активных веществ из/в гель. Помимо этого мы используем достаточно большое количество остаточной плазмы для растворения криопре- ципитата (1/3 от исходного объема плазмы), что также приводит к снижению концентрации фибриногена. Однако, с другой стороны, это по- зволяет увеличить концентрацию в криопреципитате некоторых удаляемых из него факторов, например, фактора XIII, который необходим для взаимодействия фибрина с фибронектином и коллагеном (Radosevich et al., 1997), а также для жизнедеятельности МСК (Lee et al., 2008). Рис. 1. Содержание фибриногена в обедненной тромбоцитами PPP-плазме, криопреципитате и остаточной плазме (А) и зависимость его концентрации в криопреципитате от количества циклов замораживания- оттаивания (B). данные представлены в виде среднего, ошибки среднего, также приведены значения всех элементов выборки. * - достоверные отличия, p<0.05. При повторном замораживании-разморажи- вании криопреципитата количество фибрино- гена снижалось на 40% (рис. 1В). Однако, даже при использовании такого криопреципитата мы получали сгусток удовлетворительной механи- ческой прочности. Время полимеризации фибринового клея за- висело от количества тромбина в фибриновом клее (табл. 1). Статистически достоверных от- личий между тромбином различных производи- телей выявлено не было (табл. 1). Значительная вариабельность параметра связана с различным содержанием фибриногена в криопреципитате. Различное содержание фибриногена приводило также к тому, что в образцах с низким содержа- нием белка (менее 1,4 г/л), наблюдалось сжатие фибринового геля на 2-3 день культивирования. В будущем мы планируем добиться меньшей Таблица 1 время полимеризации фибринового клея в зависимости от концентрации тромбина Том 9 № 2 2017 39 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ вариабельности за счет разработки внутреннего стандарта лаборатории по содержанию фибри- ногена в криопреципитате. Визуальный анализ клеток растущих в геле показал, что основная их часть (до 80%) не поки- дает гель (рис. 1B). Клетки имеют сферическую форму, некоторые клетки при делении образуют небольшие колонии (4-14 клеток), крупные ко- лонии при культивировании в течение 7 дней на- блюдаются, но редко (3-4 на лунку). Считается, что фактор XIII, содержащийся в плазме и кри- опреципитате, облегчает миграцию МСК и уси- ливает их пролиферативную активность (Lee, 2008). В получаемых нами образцах МСК, куль- тивируемых в стандартных условиях, а также в фибриновом клее на основе плазмы пуповинной крови или периферической крови не было по- казано достоверных отличий пролиферативного потенциала МСК а также жизнеспособности клеток (рис. 2). Уровень экспрессии поверхност- ных маркеров Cd90, Cd105, Cd73, Cd44, Cd13, Cd10, Cd34, Cd45, Cd117 и Cd14 также не за- висел от способа культивирования (табл. 2). Рис. 2. Оценка уровня жизнеспособности клеток в стандартных условиях культивирования, в фибриновом клее на основе Тиссукола, аутологичной плазмы и плазмы пуповинной крови. Окраска 7-AAd (A) - день 0, (B) - день 4. Измерение уровня поверхностных Таблица 2 маркерных антигенов в МСК пупочного канатика и дифференцированных МСК в хондрогенном направлении Маркерный антиген Cd 34 Cd 45 Cd 117 Cd 14 Cd 44 Cd 13 Cd 73 Cd 90 Cd 105 Cd 10 доля клеток (%), несущих антигены в культуре, полученной из пупочный канатик 0,1 2,8 3,8 1,7 98,1 98,3 96,5 98 97,5 74,8 доля клеток (%), несущих антигены в культуре, полученной из дифференцированные МСК 6,7 1,9 1,3 6,5 98,7 96,3 99,3 98,9 98,4 22,1 Влияние фибринового клея на поведение имплантата с МСК в хрящевой ткани пока мало изучено, однако известно, что фибриновый клей ускоряет ангиогенез (за счет хемотаксиса), ускоряет пролиферативную активность МСК и синтез матрикса остеоцитами при аппликации в область повреждения костной ткани (Isogai et al., 2000; Lee et a., 2008, Wu et al., 2012). Ускоре- ние ангиогенеза и роста гладкомышечной ткани при использовании МСК в скаффолде на осно- ве фибринового клея показано также на модели повреждениях уретры кроликов (Wang et al., 2012). Предпринимались попытки использо- вать фибриновый гель для предимплантацион- ного культивирования аутологичных хондро- цитов и в качестве скаффолда для имлантации хондроцитов (Scotti et al., 2010). Показано, что культивирование в фибриновом геле усиливает выработку матрикса хондроцитами. В этом от- ношении влияние фибринового клея сходно с влиянием альгинатов. Однако этот эффект значительно варьирует в зависимости от состава фибринового клея, а именно от соотношения в нем тромбина и фибриногена. При достаточно большой концентрации кле- ток в фибриновом клее (0,7-3*106/мл клея, что соответствует концентрации при аппликации) часть клеток покидает сгусток. После удаления сгустка на 7 день оставшиеся в лунке клетки продолжают активно делиться (рис. 3C). К 3-4 дню после удаления сгустка МСК формировали монослой на пластиковой подложке (рис. 3d). В условиях культуры клеток мы удаляли оста- точный сгусток. В условиях in vivo фибрин так- же подвергается биодеградации, но достаточно медленной. Присутствие ингибиторов фибри- нолиза (аминокапроновой кислоты в наших экспериментах) дополнительно снижает эту скорость. Способность фибрина к биодеграда- ции является достоинством этого материала. Проведенные эксперименты показали, что после ресуспендирования в фибриновом клее 40 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 5. Измерение уровня экспрессии глюкозамингликанов в дифференцированных МСК, покинувших гель. Окраска альциановым синим (A) - день 0, (B) - день 10. Масштаб - 100 мкм. Увеличение: 100. Рис. 3. Рост клеток в фибриновом клее. (А) - контроль, монослой МСК при культивировании без фибринового клея, (B) - МСК, ресуспендированные в фибриновом клее, 3 день культивирования, врезки - колонии клеток, (С) - Клетки, покинувшие гель, 7 день культивирования, видны митозы в достаточном количестве (4 в поле зрения), (d) - Образец (С) на 3 день культивирования после удаления сгустка. Масштаб - 100 мкм. Увеличение: 100 раз. клетки не утрачивают своей способности к диффренцировке в хондрогенном направлении (рис. 4). После смены среды на хондрогенную отчетливые изменения (округление и укрупне- ние клеток, образование округлых скоплений вместо продольных тяжей) наблюдались уже на 3 день. Этот срок несколько меньше по сравне- нию с МСК, которые росли только на пластико- вой подложке. Рис. 4. дифференцировка МСК, покинувших гель, в хондрогенном направлении. (A) - день 0, (B) - день 3. Масштаб - 100 мкм. Увеличение: 100. Изменение морфологии клеток сопровожда- лось изменением уровня экспрессии глюкоза- мингликанов, которые являются структурными компонентами межклеточного матрикса натив- ного хряща (рис. 5). В проведенных исследова- ниях наблюдалось увеличение интенсивности окрашивания альциановым синим в дифферен- цированных клетках по сравнению с контро- лем. Накопление глюкозамингликанов говорит о синтезе основных структурных компонентов суставного матрикса. Известно, что клеи с различными пропорция- ми и количествами тромбина и фибриногена поразному влияют на МСК. Так, например, в за- висимости от состава, фибриновый клей может или усиливать пролиферацию, или ускорять дифференцировку в нейрогенном направлении МСК из зубной пульпы (Germain et al., 2015). дальнейшие более детальные исследования не- обходимы для выяснения вопроса о влиянии со- става фибринового клея на пролиферативную активность и способность к дифференцировке в хондрогенном направлении. выводы 1. Плазма пуповинной крови является удоб- ным источником фибриногена для получения фибринового клея. 2. Фибриновый клей на основе пуповинной крови пригоден для культивирования МСК. 3. Применение фибринового клея на основе пуповинной и периферической крови в качестве скаффолда не приводит к снижению пролифе- ративного и дифференцировочного потенциала МСК, а также к изменению их иммунофенотипа. 4. МСК из фибринового клея сохраняют спо- собность дифференцироваться в хондрогенном направлении. 5. дифференцированные МСК в хондроген- ном направлении начинают экспрессировать гликозамингликаны, характерные для сустав- ного матрикса. 6. Фибриновый клей на основе пуповинной крови может использоваться в качестве скаффол- да для регенеративной терапии хрящевых тканей.

N I Enukashvily

A A Aizenshtadt

V V Bagaeva

O V Supilnikova

D A Ivolgin

I I Maslennikova

S V Novikova

Sh F Adylov

  1. Pittenger M.F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells / Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. // Science. - 1999. - 284 (5411). - P. 1437.
  2. Barry F.P. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization / Barry F.P., Murphy J.M. // Int J Biochem Cell Biol. - 2004. - Vol. 36. - Issue 4. - P. 568584.
  3. Heng B.C. Directing stem cell differentiation into the chondrogenic lineage in vitro / Heng B.C. [et al] //Stem Cells. - 2004. - Vol. 22 (7). - P. 115267.
  4. Solchaga L.A. Chondrogenic differentiation of bone marrowderived mesenchymal stem cells: tips and tricks / Solchaga L.A., Penick K.J., Welter J.F. // Methods Mol Biol. - 2011. - Vol. 698. - P. 253278.
  5. Wagner W. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood / Wagner W. [et al] // Exp Hematol. - 2005. - Vol. 33 (11). - P. 14021416.
  6. Jin H.J. Comparative analysis of human mesenchymal stem cells from bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood as sources of cell therapy /Jin H.J. [et al] // Int J Mol Sci. - 2013. - Vol. 3; 14 (9). - P. 179868001.
  7. Айзенштадт А.А. Сравнение пролиферативной активности и фенотипа МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика / Айзенштадт А.А. [и др]// Вестник СевероЗападного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, 2015. - № 2. - С. 1422.
  8. Slaughter B.V. Hydrogels in regenerative medicine / Slaughter [et al] // Adv Mater. - 2009. - Vol. 21 (3233) - P. 330729.
  9. Jockenhoevel S. Fibrin gel - advantages of a new scaffold in cardiovascular tissue engineering / Jockenhoevel S. [et al] // Eur J Cardiothorac Surg. - 2001. - Vol. 4 - P. 42430.
  10. Swartz D.D. Engineering of fibrinbased functional and implantable smalldiameter blood vessels/ Swartz D.D. [et al]// Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2005. - Vol. 288 (3). - P. 145160.
  11. Ahmed T.A. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications// Ahmed T.A. [et al] // Tissue Eng Part B Rev. - 2008. - Vol. 14 (2) - P. 199215.
  12. Phadnis S.M. Human umbilical cord blood serum promotes growth, proliferation, as well as differentiation of human bone marrowderived progenitor cells/ Phadnis S.M. [et al] // In Vitro Cell Dev Biol Anim. - 2006. - Vol. 42 (10). - P. 283286.
  13. Tekkatte С. "Humanized" stem cell culture techniques: the animal serum controversy / Tekkatte C. [et al] // Stem Cells Int. - 2011. - Vol. 2011. - P. 504723.
  14. Pereira T. (2014) MSCs Conditioned Media and Umbilical Cord Blood Plasma Metabolomics and Composition. / Pereira T. [et al.] // PLoS ONE. - 2014 - Vol. 9 (11): - e113769.
  15. Wiedemann M. Neonatal blood plasma is less susceptible to oxidation than adult plasma owing to its higher content of bilirubin and lower content of oxidizable Fatty acids. / Wiedemann M. [et al] // Pediatr Res. - 2003 - Vol. 53 (5) - P. 843849.
  16. TegerNilsson A.C. Fibrinogen to fibrin transformation in umbilical cord blood and purified neonatal fibrinogen./ TegerNilsson A.C. [et al]// Thromb Res. - 1974 - Vol. 5 (5) - P. 601612.
  17. Foley M.E. Viscosity, haematocrit, fibrinogen and plasma proteins in maternal and cord blood / Foley M.E. [et al] // Br J Obstet Gynaecol. - 1978. - Vol. 85 (7). - P. 5004.
  18. Mosesson M.W. The ultrastructure of fibrinogen420 and the fibrin420 clot. / Mosessen M.W. [et al.] // Biophysical Chemistry - 2004 - Vol. 112 - P. 209214.
  19. Hamulyak K. Reevaluation of some properties of fibrinogen, purified from cord blood of normal newborns / Hmulyak K. [et al] // Thromb Res. - 1983. - Vol. 32 (3). - P. 30110.
  20. Pool J.G. Experiences in the preparation of AHG concentrates from human plasma./ Pool J.G., Hink JH// Bibl Haematol. - 1964 - Vol. 19 - P. 14650.
  21. Brecher M. America Association of Blood Banks Technical Manual. Methods 6.11, 6.12 / Brecher M. / AABB, 15th Edition - 2005. - Chapter 3. - P. 81415.
  22. Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клиниколабораторной диагностики/ Момот А.П. // СПб., ФормаТ - 2006. - Стр. 208.
  23. Radosevich M. Fibrin sealant: Scientific rationale, production methods, properties, and current clinical / Radosevich [et al] // Vox Sang. - 1997 - Vol. 72 - P. 133143.
  24. Lee O.K. Fibrin glue as a vehicle for mesenchymal stem cell delivery in bone regeneration/ Lee O.K. [et al]// J Chin Med Assoc. - 2008. - Vol. 71 (2). - P. 5961.
  25. Ho W. The Behavior of Human Mesenchymal Stem Cells in 3D Fibrin Clots: Dependence on Fibrinogen Concentration and Clot Structure Tissue Engineering./ Ho [et al] - 2006. - Vol. 12 (6) - P. 1587.
  26. Isogai N. Experimental use of fibrin glue to induce sitedirected osteogenesis from cultured periosteal cells // Isogai N. [et al] // Plast Reconstr Surg. - 2000. - Vol. 105 (3). - P. 95363.
  27. Wu X. Fibrin glue as the celldelivery vehicle for mesenchymal stromal cells in regenerative medicine/ Wu X. [et al] // The Journal of Cell Therapy. Cytotherapy - 2012. - Vol. 14 (5). - P. 555562.
  28. Wang K. Fibrin glue with autogenic bone marrow mesenchymal stem cells for urethral injury repair in rabbit model / Wang K. [et al] // Tissue Eng Part A. - 2012. - Vol. 18 (2324). - P. 250717.
  29. Scotti C. Engineering human cellbased, functionally integrated osteochondral grafts by biological bonding of engineered cartilage tissues to bony scaffolds / Scotti C. [et al] // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31 (8). - P. 22529.
  30. Germain L. Fibrin hydrogels to deliver dental stem cells of the apical papilla for regenerative medicine / Germain L. [et al] // Regen Med. - 2015. - Vol. 10 (2). - P. 15367.

Views

Abstract - 153

PDF (Russian) - 129

PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2017 Enukashvily N.I., Aizenshtadt A.A., Bagaeva V.V., Supilnikova O.V., Ivolgin D.A., Maslennikova I.I., Novikova S.V., Adylov S.F.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.