ASSESSING THE POSSIBILITY TO APPLY THE FIBRIN GLuE BY CORd BLOOd PLASMA AS A SCAFFOLd FOR MESENCHYMAL STEM CELLS TRANSPLANTATION

Full Text

Локальные посттравматические поврежде- ния хряща, а также дегенеративно-дистрофи- ческие повреждения хряща, такие как болезнь Кенига, остеоартроз 1-2 стадии являются рас- пространенным заболеванием. По статистике, от данной группы заболеваний в некоторых странах страдает до 22% населения. Таким образом, восстановление хряща явля- ется актуальной проблемой современной трав- матологии и ортопедии. На данный момент, несмотря на разнообразие применяемых для регенерации суставной поверхности методик, не существует адекватного подхода, который обеспечивал бы полное и долговременное вос- становление структуры и функциональной ак- тивности поврежденного сустава. Одним из перспективных подходов являет- ся использование биотрансплантатов, основой для которых могут служить аутологичные хондроциты или мезенхимные стромальные клетки (аутологичные или аллогенные). Использование аутологичных хондроцитов имеет ряд недостатков. Сниженная пролифе- ративная активность осложняет получение не- обходимого для терапевтического применения количества клеточного материала. Кроме того, инвазивная процедура забора фрагмента хря- щевой ткани сопряжена с риском возникнове- ния серьезных осложнений в области забора материала - donor site morbidity. Альтернативой является применение мезен- химных стромальных клеток (МСК), которые обладают способностью дифференцироваться в клетки тканей мезенхимного ряда, в том чис- ле, в хондроциты (Pittenger et al., 1999; Barry et al., 2004, Heng et al., 2004; Solchaga et al., 2011). МСК обладают более высоким пролифератив- ным потенциалом по сравнению с хондроцита- ми. Хондроциты, полученные в результате диф- Том 9 № 2 2017 35 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ференцировки из МСК, сохраняют способность делиться в течение более длительного периода, чем хондроциты, выделенные из фрагмента су- ставного хряща. Исторически сложилось, что основным ис- точником материала для исследований МСК длительное время служил костный мозг лабо- раторных животных и человека. Однако про- цедура забора костного мозга достаточно трав- матична, требует медикаментозной подготовки пациента, пребывания его в госпитале в течение суток, существует риск серьезных осложнений. В настоящее время известно, что МСК также можно получить из пуповинной крови, пупоч- ного канатика и жировой ткани, а также из мо- билизованной периферической крови (Wagner et al., 2005, Jin HJ et al., 2013). По нашим дан- ным, МСК из жировой ткани и пупочного кана- тика по своим свойствам очень близки к МСК, выделенным из костного мозга. А МСК из пу- почного канатика по своему пролиферативному потенциалу даже превосходят клетки, получен- ные из костного мозга (Айзенштадт и др., 2015). для создания трансплантата нужной формы, доставки клеток, удержания их на месте инъек- ции, создания оптимальной среды для роста, а также для усиления лечебного эффекта от при- менения МСК используются различные поддер- живающие матрицы (т.н. скаффолды). Разраба- тываются скаффолды с разными физическими и химическими свойствами, в том числе гидрогели на основе различных компонентов (напр. гиалу- роновой кислоты или фибрина). К достоинствам гидрогелей можно отнести высокое содержание жидкости и способность после полимеризации надежно удерживать клетки (Slaughter et al., 2009). Гель на основе фибрина (т.н. фибриновый клей) обладает рядом уникальных преимуществ: (а) для его создания возможно использование как аллогенной, так и аутологичной плазмы в каче- стве источника фибриногена, (б) полимеризация геля происходит при участии нецитотоксичных инициаторов (тромбин, соли кальция) (в) сам гель обладает достаточно прочной структурой, обеспечивающей надежное удержание клеток в месте инъекции, (г) наличие значительного объ- ема воды в геле позволяет вводить в него раз- личные биологически активные вещества, в т.ч. дифференцировочные факторы, противовоспа- лительные препараты и т.д, (д) фибрин является биодеградируемым материалом (Jockenhoevel et al., 2001; Swartz et al., 2005; Ahmed et al., 2008). Помимо этого, в тех случаях, когда нежелателен забор у пациента значительных объемов крови для получения нужного количества плазмы, в качестве источника фибриногена может исполь- зоваться и аллогенная плазма, в том числе плаз- ма пуповинной крови. Плазма пуповинной крови по своему составу значительно богаче биологи- чески активными веществами и ростовыми фак- торами по сравнению с плазмой крови взрослого человека (Fahdnis et al., 2006; Tekkatte et al., 2011; Pereira et al., 2014). Антиоксидантные свойства такой плазмы выше, чем у плазмы взрослого че- ловека (Wiedemann et al., 2003) дополнительным достоинством такого метода является возмож- ность использования плазмы, не используемой в трансфузиологии и обычно утилизируемой после выделения ядросодержащей фракции. Однако, использование плазмы пуповинной крови для приготовления фибринового клея теоретически может быть осложнено следующими факторами: (а) плазма пуповинной крови характеризуется меньшей вязкостью и (б) более низким содержа- нием фибриногена (в среднем 1.8 г/л) по сравне- нию с плазмой взрослого человека (референтные значения 2-4 г/л, 4,25 г/л у беременных женщин)) (Teger-Nilsson et ., 1974; Foley et al., 1978) в) повы- шенным содержанием фетальной формы фибри- ногена (фибриногена-420), снижающего скорость полимеризации фибрина и меняющего структуру фибриновых волокон (Mosesson et al., 2004). По- мимо этого плазма пуповинной крови обычно содержит значительный объем антикоагулянта в связи с тем, что образцы крови (малого объема - 40-100 мл) обычно собирают в стандартные меш- ки для сбора крови, рассчитанные на 450 мл и со- держащие около 50 мл антикоагулянта. Вместе с тем, степень фосфориллирования фибриногена и зависимость тромбинового времени от концен- трации солей кальция значительно сильнее выра- жена у новорожденных по сравнению со взрослы- ми (Hamulyak et al., 1983). Криопреципитация является одним из ме- тодов повышения концентрации фибриногена. (Pool et al., 1964). Криопреципитат представля- ет собой плохорастворимый концентрат высо- комолекулярных белков плазмы, получаемых при медленной разморозке плазмы при темпе- ратуре 1-6°С до консистенции «снежной каши- цы» («slushy»). Он обогащен коагулирующими белками плазмы, такими как фактор VIII, фи- бриноген, фактор фон Виллебранда, фибронек- тином. Концентрация фибриногена в криопре- ципитате возрастает в 2-10 раз по сравнению с плазмой. Остающаяся после криопреципитации плазма обеднена этими белками, но содержит все остальные компоненты плазмы и поэтому 36 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ часто используется в качестве растворителя для криопреципитата перед его использованием. Мы предположили, что использование мето- да криопреципитации для обогащения плазмы фибриногеном позволит использовать плазму пуповинной крови для приготовления фибри- нового клея. Цель работы Целью данного исследования являлась оцен- ка возможности использования фибриново- го клея на основе криопреципитата из плазмы пуповинной крови в качестве скаффолда для мезенхимальных стволовых клеток для после- дующего их применения при лечении дегенера- тивных поражений суставного хряща. Материалы и методы Клеточные культуры Образцы подкожной жировой ткани объемом 2-4 мл были получены в ходе липоэктоми с на- ружной поверхности бедра по стандартной ме- тодике. Ткань извлекали из контейнера с транс- портной средой, механически измельчали, затем инкубировали при 37°С в 0,2% растворе коллаге- назы (тип I, Sigma-Aldrich, США) в ФСР. дис- социированные клетки отмывали от фермента центрифугированием (400 G, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100-400 тыс. кл/см2. Смену среды проводили также через 72 ч. Пупочные канатики получали при неослож- ненных родах при наличии информированного согласия. МСК выделяли из периваскулярного пространства пупочной вены методом фермента- тивной обработки с помощью смеси коллагеназ I и IV. далее клетки культивировали в питатель- ной среде AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell media (HyClone), содержащей 10% заменителя сыворотки AdvanceSTEM Mesenchymal Stem Cell Supplement (HyClone), 50 ед/мл пеницил- лина и 50 мкг/мл стрептомицина (далее «полная культуральная среда»). При достижении 70-80% конфлюентности монослоя МСК, клетки пересе- вали (не более 2 раз) при плотности 1000 кл/см2. МСК культивировали в условиях гипоксии разца. Образцы пуповинной крови получали при неосложненных родах, при наличии информиро- ванного согласия. В исследовании использовали образцы с группой крови A или AB, т.к. в таких об- разцах выше содержание в плазме фактора VIII. Образцы пуповинной крови объемом 70,1±18,4 мл (из них объем антикоагулянта - ЦФдА, цитрат-фосфат-декстроза-аденин - со- ставлял 49 мл) центрифугировали (10 мин при 250 g) в закрытой системе из двух полимер- ных контейнеров для сбора крови (Green Cross Medical Science Corporation, Корея). Эритроци- тарную массу и плазму разделяли с помощью плазмоэкстрактора Ностальгия (Россия). далее для получения криопреципитата следовали, в основном, протоколу Американской ассоциа- ции Банков Крови (AABB technical manual, 15th edition) с нашими модификациями. К пакету с плазмой подсоединяли пластиковый контейнер (Компопласт, Россия) и повторно центрифуги- ровали при 4500 g 10 мин при комнатной тем- пературе и затем с помощью плазмоэкстрактора отделяли супернатант (обедненная по тромбо- цитам плазма - platelet poor plasma) от осадка (остаточные эритроциты, тромбоциты). Часть плазмы (1 мл) использовали для определения количества фибриногена стандартными клини- ческими методами. Полученную плазму (30±15 мл из одного образца крови) замораживали и хранили в пластиковых контейнерах с запаян- ными портами при -80°С в течение 1-18 дней. для получения криопреципитата образец плазмы медленно размораживали при темпера- туре +4 - +6°С до консистенции «снежной ка- шицы» («slushy»). Криопреципитат отделяли от остальной плазмы одним из двух методов: а) цен- трифугированием при 4500 g 10 мин при +4°С и последующим пассивным сливанием плазмы в подсоединенный пакет или б) разделением за- мороженных кристаллов и растаявшей плазмы с помощью плазмоэкстрактора. После разделения и окончательного растаивания криопреципитата хлопья криопреципитированных высокомолеку- лярных белков плазмы растворяли в оставшейся в пакете плазме (примерно 10-15 мл), прогревая при 37°С в атмосфере 5% СО и 5% О с испольпакет до комнатной температуры. далее полузованием мультигазовых инкубаторов (BBd 6220, Thermo Scientific, США) с возможностью подачи азота. Получение обедненной тромбоцитами плазмы и криопреципитата Криопреципитат получали из плазмы пупо- винной крови, непригодной для выделения ядро- содержащей фракции по причине малого веса обченный криопреципитат немедленно замора- живали. Количество фибриногена определяли во всех фракциях (обедненная по тромбоцитам плазма, криопреципитат, отделенная от него (cryo-depleted) остаточная плазма). Приготовление фибринового клея При приготовлении фибринового клея с ресуспендированными в нем МСК, в основ- Том 9 № 2 2017 37 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ном, следовали протоколу Новозеландско- го Банка Крови (http://www.nzblood.co.nz/ assets/Transfusion-Medicine/PdFs/Fibrin-Glue- 111I027.pdf) с нашими модификациями. для получения фибринового клея с иммо- билизованными в нем клетками использовали двухкомпонентную систему, состоящую из раз- мороженного криопреципитата с ресуспендиро- ванными в нем клетками (3*105/мл или 106/мл) и тромбинового раствора. два компонента сме- шивались непосредственно перед внесением в лунку 6-луночного планшета. Тромбин (Baxter или Технология-Стандарт, Новосибирск) растворяли до концентрации 200u/мл или 32.5u/мл в полной культураль- ной среде (см. выше), что отличается от стан- дартного протокола получения клея для хирур- гии, однако повышает выживаемость МСК. для предотвращения фибринолиза и повышения ко- агулирующих свойств тромбинового раствора в полную культуральную среду перед внесением тромбина добавляли ингибитор фибринолиза аминокапроновую кислоту (до 2 г/л) и хлорид кальция (2 г/л). Приготовленный таким обра- зом раствор использовали в течение трех часов. МСК выращивали как описано выше до 70-80% конфлюэнтности. Клетки снимали с подложки раствором 0,25% трипсина (Gibco). Затем их ресуспендировали в 5 мл полной культуральной среды и центрифугировали при 800 g 5 мин. Осевшие клетки ресуспендирова- ли в свежеразмороженном криопреципитате таким образом, чтобы их концентрация состав- ляла 3*105/мл или 106/мл. Смешивание тромбинового раствора (0,5 мл) и МСК-содержащего криопреципитата (0,5 мл) осуществляли с помощью аппликационного набора duploject (Baxter) - системы из двух шприцов с общей иглой - непосредственно в момент внесения клея с клетками в лунки 6-лу- ночного планшета. Культивирование клеток в фибриновом клее После завершения полимеризации фибрино- вого клея с ресуспендированными клетками в лунки планшета над фибриновым сгустком на- слаивали полную культуральную среду (2 мл) и культивировали клетки в условиях гипоксии как описано выше в течение 7 дней. Смену сре- ды осуществляли каждые 2 дня. Исследовали клетки, как растущие в геле, так и покинувшие его. Методами световой микроскопии оценива- ли внешний вид клеток, число клеток, растущих вне геля, число одиночных клеток и колоний в геле. Через 7 дней фибриновый сгусток удаляли, а покинувшие его клетки (примерно 20% от общего числа клеток в лунке) использовали для изучения способности клеток из фибринового клея дифференцироваться в хондроцитарном направлении. Дифференцировка в хондроцитарном направлении клеток, полученных из фибри- нового клея Клетки, покинувшие гель, культивировали до достижения ими 60-70% конфлюэнтности и далее переносили в хондрогенную культураль- ную среду, содержащую 10% хондрогенного за- менителя сыворотки (hMSC Mesenchymal Stem Cell Chondrocyte differentiation Medium, Lonza) и культивировали согласно протоколу произво- дителя. Морфологию клеток оценивали на 3, 7 и 10 день от переноса в хондрогенную среду мето- дами световой микроскопии. Иммунофенотипирование полученных клеток Однородность выделенных первичных МСК, а также дифференцированных клеток, оценивали по экспрессии специфических по- верхностных антигенов - иммунофенотипи- ческих маркеров методом проточной цитоф- луорометрии. Поверхностные маркеры МСК выявляли с помощью меченных флуорохрома- ми антител против Cd10, Cd13, Cd34, Cd44, Cd45, Cd73, Cd90, Cd105 и Cd117 (Beckman Coulter, США) на проточном цитофлуориметре FC500 (Beckman Coulter, США) в соответствии с инструкцией фирмы производителя. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения CXP. Окраска альциановым синим Клетки выращивали и дифференцировали на покровных стеклах. Образцы дважды про- мывали фосфатным буфером и фиксировали 4% параформальдегидом 10 минут при комнатной температуре. далее проводили окрашивание аль- циановым синим (рН 2,5), используя стандарт- ный протокол. Анализ данных проводили мето- дом световой микроскопии (Zeiss Axiovert 40 c). Статистические методы В ходе эксперимента проанализировано 8 об- разцов криопреципитата. Эксперименты с куль- тивированием клеток в фибриновом клее по- вторяли три раза. Результаты представлены как среднее ± ошибка среднего. для определения нормальности распределения переменных про- водился тест Колмогорова-Смирнова / Стати- стический анализ проводился с использованием t-критерия Стьюдента, ANOVA для связанных значений. Критический уровень значимости был принят p<0,05. Применялся стандартный 38 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ пакет прикладных программ: GraphPad Prism, Microsoft Excel 2003. Результаты и обсуждение Результаты измерения количества фибри- ногена в обедненной по тромбоцитам (PPP) плазме, криопреципитате и остаточной плазме представлены на рис. 1. Исходное количество фибриногена в PPP-плазме (1,60±0,08 г/л) было ниже нормы взрослого человека (2-4 г/л), а также среднего значения для концентрации фибриногена в пуповинной крови, 1.8 г/л (Foley et al., 1978). Такое низкое содержание фибрино- гена в плазме обусловлено как физиологически- ми свойствами плазмы пуповинной крови, так и довольно значительным (в 0,5-2 раза) разведе- нием крови при заборе в стандартный контей- нер. Помимо снижения концентрации фибри- ногена, наличие такого большого количества антикоагулянта меняет ионную силу раствора и концентрации солей, что также вносит погреш- ность в измерение тромбинового времени, что является основой метода измерения концентра- ции фибриногена. (Момот, 2006). Образцы свежеразмороженного криопреци- питата содержали фибриноген в количествах (2,25±0,14 г/л), меньше рекомендованных AABB (7-14 г/л), что связано с более низким со- держанием фибриногена в исходной плазме по причинам описанным выше. Также содержание фибриногена в получаемом нами криопреци- питате было ниже по сравнению с коммерчески производимым препаратом фибриногена, ис- пользуемом в препарате Тиссукол (60-70 г/л). Однако данный препарат был разработан, пре- жде всего, для использования в хирургии для удержания краев раны. Механические харак- теристики получаемого нами геля достаточны для получения прочного сгустка и удерживания в нем МСК (рис. 2). Кроме того, по данным Но со соавторами (Ho et al, 2006), низкое (5 г/л) содержание фибриногена обеспечивает более высокую скорость пролиферации клеток. При этом относительно мягкая, крупнопористая структура получаемого геля в данном случае играет положительную роль, т.к. облегчается миграция клеток и диффузия биологически активных веществ из/в гель. Помимо этого мы используем достаточно большое количество остаточной плазмы для растворения криопре- ципитата (1/3 от исходного объема плазмы), что также приводит к снижению концентрации фибриногена. Однако, с другой стороны, это по- зволяет увеличить концентрацию в криопреципитате некоторых удаляемых из него факторов, например, фактора XIII, который необходим для взаимодействия фибрина с фибронектином и коллагеном (Radosevich et al., 1997), а также для жизнедеятельности МСК (Lee et al., 2008). Рис. 1. Содержание фибриногена в обедненной тромбоцитами PPP-плазме, криопреципитате и остаточной плазме (А) и зависимость его концентрации в криопреципитате от количества циклов замораживания- оттаивания (B). данные представлены в виде среднего, ошибки среднего, также приведены значения всех элементов выборки. * - достоверные отличия, p<0.05. При повторном замораживании-разморажи- вании криопреципитата количество фибрино- гена снижалось на 40% (рис. 1В). Однако, даже при использовании такого криопреципитата мы получали сгусток удовлетворительной механи- ческой прочности. Время полимеризации фибринового клея за- висело от количества тромбина в фибриновом клее (табл. 1). Статистически достоверных от- личий между тромбином различных производи- телей выявлено не было (табл. 1). Значительная вариабельность параметра связана с различным содержанием фибриногена в криопреципитате. Различное содержание фибриногена приводило также к тому, что в образцах с низким содержа- нием белка (менее 1,4 г/л), наблюдалось сжатие фибринового геля на 2-3 день культивирования. В будущем мы планируем добиться меньшей Таблица 1 время полимеризации фибринового клея в зависимости от концентрации тромбина Том 9 № 2 2017 39 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ вариабельности за счет разработки внутреннего стандарта лаборатории по содержанию фибри- ногена в криопреципитате. Визуальный анализ клеток растущих в геле показал, что основная их часть (до 80%) не поки- дает гель (рис. 1B). Клетки имеют сферическую форму, некоторые клетки при делении образуют небольшие колонии (4-14 клеток), крупные ко- лонии при культивировании в течение 7 дней на- блюдаются, но редко (3-4 на лунку). Считается, что фактор XIII, содержащийся в плазме и кри- опреципитате, облегчает миграцию МСК и уси- ливает их пролиферативную активность (Lee, 2008). В получаемых нами образцах МСК, куль- тивируемых в стандартных условиях, а также в фибриновом клее на основе плазмы пуповинной крови или периферической крови не было по- казано достоверных отличий пролиферативного потенциала МСК а также жизнеспособности клеток (рис. 2). Уровень экспрессии поверхност- ных маркеров Cd90, Cd105, Cd73, Cd44, Cd13, Cd10, Cd34, Cd45, Cd117 и Cd14 также не за- висел от способа культивирования (табл. 2). Рис. 2. Оценка уровня жизнеспособности клеток в стандартных условиях культивирования, в фибриновом клее на основе Тиссукола, аутологичной плазмы и плазмы пуповинной крови. Окраска 7-AAd (A) - день 0, (B) - день 4. Измерение уровня поверхностных Таблица 2 маркерных антигенов в МСК пупочного канатика и дифференцированных МСК в хондрогенном направлении Маркерный антиген Cd 34 Cd 45 Cd 117 Cd 14 Cd 44 Cd 13 Cd 73 Cd 90 Cd 105 Cd 10 доля клеток (%), несущих антигены в культуре, полученной из пупочный канатик 0,1 2,8 3,8 1,7 98,1 98,3 96,5 98 97,5 74,8 доля клеток (%), несущих антигены в культуре, полученной из дифференцированные МСК 6,7 1,9 1,3 6,5 98,7 96,3 99,3 98,9 98,4 22,1 Влияние фибринового клея на поведение имплантата с МСК в хрящевой ткани пока мало изучено, однако известно, что фибриновый клей ускоряет ангиогенез (за счет хемотаксиса), ускоряет пролиферативную активность МСК и синтез матрикса остеоцитами при аппликации в область повреждения костной ткани (Isogai et al., 2000; Lee et a., 2008, Wu et al., 2012). Ускоре- ние ангиогенеза и роста гладкомышечной ткани при использовании МСК в скаффолде на осно- ве фибринового клея показано также на модели повреждениях уретры кроликов (Wang et al., 2012). Предпринимались попытки использо- вать фибриновый гель для предимплантацион- ного культивирования аутологичных хондро- цитов и в качестве скаффолда для имлантации хондроцитов (Scotti et al., 2010). Показано, что культивирование в фибриновом геле усиливает выработку матрикса хондроцитами. В этом от- ношении влияние фибринового клея сходно с влиянием альгинатов. Однако этот эффект значительно варьирует в зависимости от состава фибринового клея, а именно от соотношения в нем тромбина и фибриногена. При достаточно большой концентрации кле- ток в фибриновом клее (0,7-3*106/мл клея, что соответствует концентрации при аппликации) часть клеток покидает сгусток. После удаления сгустка на 7 день оставшиеся в лунке клетки продолжают активно делиться (рис. 3C). К 3-4 дню после удаления сгустка МСК формировали монослой на пластиковой подложке (рис. 3d). В условиях культуры клеток мы удаляли оста- точный сгусток. В условиях in vivo фибрин так- же подвергается биодеградации, но достаточно медленной. Присутствие ингибиторов фибри- нолиза (аминокапроновой кислоты в наших экспериментах) дополнительно снижает эту скорость. Способность фибрина к биодеграда- ции является достоинством этого материала. Проведенные эксперименты показали, что после ресуспендирования в фибриновом клее 40 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Рис. 5. Измерение уровня экспрессии глюкозамингликанов в дифференцированных МСК, покинувших гель. Окраска альциановым синим (A) - день 0, (B) - день 10. Масштаб - 100 мкм. Увеличение: 100. Рис. 3. Рост клеток в фибриновом клее. (А) - контроль, монослой МСК при культивировании без фибринового клея, (B) - МСК, ресуспендированные в фибриновом клее, 3 день культивирования, врезки - колонии клеток, (С) - Клетки, покинувшие гель, 7 день культивирования, видны митозы в достаточном количестве (4 в поле зрения), (d) - Образец (С) на 3 день культивирования после удаления сгустка. Масштаб - 100 мкм. Увеличение: 100 раз. клетки не утрачивают своей способности к диффренцировке в хондрогенном направлении (рис. 4). После смены среды на хондрогенную отчетливые изменения (округление и укрупне- ние клеток, образование округлых скоплений вместо продольных тяжей) наблюдались уже на 3 день. Этот срок несколько меньше по сравне- нию с МСК, которые росли только на пластико- вой подложке. Рис. 4. дифференцировка МСК, покинувших гель, в хондрогенном направлении. (A) - день 0, (B) - день 3. Масштаб - 100 мкм. Увеличение: 100. Изменение морфологии клеток сопровожда- лось изменением уровня экспрессии глюкоза- мингликанов, которые являются структурными компонентами межклеточного матрикса натив- ного хряща (рис. 5). В проведенных исследова- ниях наблюдалось увеличение интенсивности окрашивания альциановым синим в дифферен- цированных клетках по сравнению с контро- лем. Накопление глюкозамингликанов говорит о синтезе основных структурных компонентов суставного матрикса. Известно, что клеи с различными пропорция- ми и количествами тромбина и фибриногена поразному влияют на МСК. Так, например, в за- висимости от состава, фибриновый клей может или усиливать пролиферацию, или ускорять дифференцировку в нейрогенном направлении МСК из зубной пульпы (Germain et al., 2015). дальнейшие более детальные исследования не- обходимы для выяснения вопроса о влиянии со- става фибринового клея на пролиферативную активность и способность к дифференцировке в хондрогенном направлении. выводы 1. Плазма пуповинной крови является удоб- ным источником фибриногена для получения фибринового клея. 2. Фибриновый клей на основе пуповинной крови пригоден для культивирования МСК. 3. Применение фибринового клея на основе пуповинной и периферической крови в качестве скаффолда не приводит к снижению пролифе- ративного и дифференцировочного потенциала МСК, а также к изменению их иммунофенотипа. 4. МСК из фибринового клея сохраняют спо- собность дифференцироваться в хондрогенном направлении. 5. дифференцированные МСК в хондроген- ном направлении начинают экспрессировать гликозамингликаны, характерные для сустав- ного матрикса. 6. Фибриновый клей на основе пуповинной крови может использоваться в качестве скаффол- да для регенеративной терапии хрящевых тканей.

About the authors

N I Enukashvily

A A Aizenshtadt

V V Bagaeva

O V Supilnikova

D A Ivolgin

I I Maslennikova

S V Novikova

Sh F Adylov

References

Supplementary files