SWEAT AND FAT TRACES OF THE PERSON AS OBJECT OF DNA IDENTIFICATION OF THE PERSONALITY

Full Text

В настоящее время типирование дНК явля- ется наиболее доказательным методом анализа биологического материала при производстве судебно-медицинской идентификационной экс- пертизы [1]. Исследование биологических следов имеет важное идентификационное и диагностическое значение в криминалистической деятельности. По своей природе эти следы содержат инфор- мацию, используемую для идентификации лич- ности, установления причастности лица к со- вершенному деянию, определения механизма преступления и других сведений, позволяющих установить обстоятельства, подлежащие дока- зыванию [2]. Одним из наиболее распространенных объ- ектов экспертного исследования являются пото- жировые следы (ПЖС) человека. Вывод о том, что следы на том или ином предмете оставлены определенным лицом, имеет важное, а часто ре- шающее значение для изобличения преступни- ка, так как устанавливается факт пребывания конкретного лица на месте преступления, его непосредственный контакт с конкретным пред- метом [3]. Исследование такого рода объектов сопряжено с трудностями, возникающими в процессе их обнаружения, изъятия на месте происшествия, влияющими на эффективность их дальнейших идентификационных исследо- ваний. Перспектива обнаружения ПЖС пре- ступника на теле жертвы особенно актуальна и, в то же время, сложна, поскольку требует специ- ального подхода к исследованию и интерпрета- ции результатов генотипирования. Обнаружение ПЖС В ходе осмотра места происшествия практи- чески всегда в качестве улик изымаются микро- следы (частицы биологического материала пре- ступника, волокна тканевого материала, семена или пыльца растений, принесенная на обуви или одежде и т.д.), обнаружение которых имеет большое значения при недостаточном или малом количестве вещественных доказательств. Когда обнаружение микроследов биологического мате- риала преступника составляет некоторые труд- ности, необходимо грамотное и безошибочное изъятие этих следов. В силу своей неочевидно- сти данные материалы подвержены упущению из внимания и как следствие - их утрате [4]. Отпечатки пальцев относятся к наиболее ин- формативному и распространенному объекту, оставленному на месте преступления [5]. для обнаружения и выявления следов рук могут использоваться визуальные (оптиче- ские), физические и химические методы. При- менение того или иного метода зависит от вида объекта, на котором оставлены следы, периода времени от образования следа до его выявле- ния, профессиональных качеств специалиста и прочих факторов [6]. дактилоскопический метод широко исполь- зуется для визуализации отпечатков пальцев рук, поскольку является простым, не требует больших затрат и дает непосредственные ре- зультаты, которые можно оценить уже на месте происшествия [7, 8]. В настоящее время, наряду с методом дактило- скопической визуализации, молекулярно-генети- ческий анализ является одним из самых доказа- 78 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ тельных методов анализа биологических следов, в том числе, ПЖС, человека [9]. Попытки иссле- дования одних и тех же ПЖС дактилоскопиче- скими и молекулярно-генетическими методами далеко не всегда сопровождаются положитель- ным результатом. Это, в первую очередь, связа- но с этапом обработки ПЖС отпечатков пальцев средствами, способствующими их визуализации, в частности, дактилоскопическими порошками (дП) [6]. Используемые криминалистами дП могут приводить к ингибированию полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая и лежит в основе современных методов дНК-идентификации био- логического материала [10, 11]. Зачастую причиной непригодности для идентификации отобранного биологического материала на месте происшествия является его неправильный отбор, изъятие, транспортировка и хранение [12, 13]. Согласно литературным данным получить отпечатки папиллярных узоров пальцев рук, оставленных на коже человека, за редким ис- ключением, весьма затруднительно [9, 14]. Тем не менее, кожа, как искусственная, так и человеческая, может рассматриваться как по- тенциально информативный и качественный носитель биологических следов, оставленных на ее поверхности. При контакте с пальцами и ладонями поверхность кожи различных частей человеческого тела впитывает наложения и удерживает эпителиальные клетки за счет сво- ей пористости с большей силой, чем непористые следовоспринимающие объекты [7]. На волок- нистых поверхностях, теле живых лиц и трупах применяется окуривание парами йода [6]. Была показана возможность использования отдель- ных дП, цианоакрилата и шведского дымного пороха для восстановления пальцевых отпечат- ков на поверхности кожи человека с последую- щей молекулярно-генетической идентификаци- ей. Наиболее подходящим дП для обнаружения отпечатков пальцев на поверхности кожи жи- вых лиц и трупов считается шведский дымный порох. Ряд исследований показали отсутствие различий результатов генотипирования дНК ПЖС, оставленных посторонним лицом, на по- верхности кожи живых лиц и трупов [5, 14]. Морфология кожи и физиология потоотделения Кожа человека должна рассматриваться не только как источник биологических выделений, имеющих большое значение для криминалисти- ки и молекулярно-генетической идентификации, но и как специфическая сложная поверхность, на которой существует возможность обнаружения посторонних наложений биологического проис- хождения. Сложность работы с поверхностью кожи живых лиц или трупов в рамках генети- ческого анализа заключается в возможностях вычленения генетического материала, принад- лежащего постороннему лицу, оставившему свои следы на поверхности кожи другого человека, из превалирующего биологического материала хо- зяина, генотип которого будет являться мажор- ным в смеси. Поэтому важно использовать эф- фективные методы визуализации и отбора ПЖС, которые не станут препятствовать последующей дНК-идентификации. для оценки ПЖС, как объекта исследова- ний, и возможностей их дНК-идентификации необходимо рассмотреть кожу человека, ее про- изводные и процесс потоотделения с точки зре- ния морфологии и физиологии. Как известно, наружным слоем кожи являет- ся эпидермис, представленный многослойным плоским ороговевающим эпителием. Эпидер- мис состоит из базального, шиповатого, зерни- стого, блестящего и рогового слоев [15]. Около 95% клеток эпидермиса являются кератиноци- тами (производными эктодермы), которые по мере дифференцировки продвигаются от ба- зальной мембраны по направлению к поверхно- сти кожи. Клетки блестящего слоя по мере про- движения к периферии постепенно утрачивают ядра и в верхних слоях, как и далее в роговом слое эпидермиса, клетки безъядерны. Следует учитывать, что ядросодержащие клетки более идентификационно значимы в плане молекуляр- но-генетического анализа, поскольку содержат индивидуализирующие маркеры ядерной дНК. Поскольку наиболее развит роговой слой в области ладоней и подошв, где кожа подверга- ется наибольшему механическому воздействию, возникает закономерный вопрос об источниках дНК в ПЖС. Состав вещества ПЖС человека определяет- ся, главным образом, выделениями потовых и сальных желез на поверхности кожи человека. В состав потожировых выделений человека входят вещества разных химических классов: липиды, белковые компоненты, простые орга- нические и неорганические вещества. Пот на 98- 99% состоит из воды, 1-2% - это органические и минеральные вещества. Основная масса рас- творенных соединений приходится на мочеви- ну, аммиак, мочевую и молочную кислоты, соли кальция, калия. Том 9 № 2 2017 79 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Ни жировой, ни потовый компонент ПЖС не содержит дНК (за исключением дНК в поте, продуцируемом апокриновыми (голокриновы- ми) потовыми железами, за счет разрушения клеток в процессе секреции). В коже ладоней и подошв стоп располагает- ся наибольшая плотность эккриновых потовых желез [16, 17]. Выводной проток такой железы заканчиваются в базальном слое эпидермиса - ростковом ядросодержащем слое клеток [18]. Показано, что пот обладает протеолитиче- ской активностью в кислой и щелочной средах [19]. Поскольку пот эккриновых желёз облада- ет кислой реакцией, то он способен не только оказывать бактерицидные свойства для кожи, но и лизировать (разрушать) мембраны как собственных клеток эпидермиса, так и биоло- гических наложений, привнесенных извне: с поверхности других частей тела, поверхностей различных объектов, на которых находился биологический материал. Такой материал мо- жет быть представлен как свободной дНК, кле- точными структурами, так и целыми клетками: эпителиальными, эпидермальными, клетками крови и т.д. За счет кислой реакции происходит частичный лизис клеток, что способствует вы- ходу дНК из сохранившихся и частично разру- шенных ядерных структур. Поскольку на ладонях и стопах сальные же- лезы отсутствуют, липидный компонент пото- жирового вещества, остающийся в отпечатках пальцев можно объяснить привнесением его извне при контакте ладоней с поверхностью собственных участков кожи, имеющей жировые выделения, либо при контакте с объектами, име- ющими на своей поверхности такие наложения. Работа потовых желез усиливается при раз- дражении нервных окончаний, реагирующих на тепло. Но выделение пота не всегда связано с повышением температуры. Активности желез возрастает при гормональных всплесках, стрес- сах, в опасных ситуациях. Психогенное потоотделение возникает при эмоциональном или психическом напряжении и не связано с необходимостью охлаждения организма. Физиологически оно отражает ре- акцию на эмоциональные процессы, связанные с поведением и реакцией на окружающий мир. Однако, в отличие от терморегуляционного потоотделения, при котором активируются железы всего кожного покрова, при стрессах, эмоциях и других стимулах активизируются в основном потовые железы, расположенные на лице, в подмышечных областях, на ладонях и подошвенных поверхностях стоп. Причём стресс приводит к вазоконстрикции (спазму кожных сосудов), тогда как терморегуляторное потоотделение сопровождается вазодилятацией (расширением кожных сосудов). данный факт имеет большое значение для обнаружения ПЖС, оставленных преступни- ком в момент совершения преступления: стрес- совая ситуация провоцирует повышенное пото- отделение, а местом наиболее частого контакта с окружающими объектами становится ладон- ная поверхность кистей рук - область наиболее обильного потоотделения. фиксация и молекулярно-генетическое исследование ДНК ПЖС Результат молекулярно-генетического анализа дНК в ПЖС человека зависит от многих факто- ров, включая индивидуальные особенности лица, оставившего свой след, обстоятельств, при кото- рых возник контакт, от факторов внешней среды и структуры объекта, на котором след оставлен [3]. Большое значение имеет выбор метода об- наружения и сбора ПЖС, их транспортировка, длительность хранения перед осуществлением исследований [9, 20]. При работе с такими объектами как ПЖС следует учитывать крайне низкое количество генетического материала, содержащегося в них, и необходимость исключения контаминации исследуемых объектов посторонней дНК. Выбор метода исследования дНК ПЖС ос- новывается на особенностях следовосприни- мающего объекта: его гладкости, пористости, физико-химических свойств. Специфические качества объекта влияют и на сохранность гене- тического материала в ПЖС. Так, например, на гладких непористых поверхностях дНК в боль- шей степени подвержена деградации, нежели на негладких пористых, которые способны впиты- вать и задерживать на себе большее количество биологических наложений [7, 9]. достаточно часто на месте происшествия изъятие биологических наложений проводит- ся с использование стандартных методов без учета особенностей исследуемого объекта и сложившихся обстоятельств. Этап проведения лабораторных исследований полученных био- логических наложений может быть отсрочен или наступить через длительный период вре- мени. При работе с такими объектами в соб- ственной экспертной практике получить пол- ный генетический профиль нередко вызывает затруднения. Так, смывы ПЖС с гладких непо- 80 Вестник Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ристых поверхностей и с искусственной кожи, осуществленные на месте происшествия при по- мощи деионизованной воды, зачастую приводят к искажению результатов генотипирования, вы- ражающемуся в эффектах выпадения аллелей, вставках дополнительных аллелей (так называ- емый эффект «ложной смеси дНК»), а порой и в отсутствии продуктов энзиматической ампли- фикации ряда исследуемых полиморфных ло- кусов дНК. Это можно объяснить и изначально малым содержанием активной дНК-матрицы, содержащейся в ПЖС, и особенностями усло- вий сбора и хранения биологического материа- ла [21]. дНК в смывах, осуществленных с помо- щью деионизованной воды, может подвергаться гидролизу и деградации в условиях отсутствия стабилизирующих ее факторов. При отборе ПЖС с помощью клейкой ленты чаще удается получить полный генетический профиль с гладких непористых поверхностей. При исследовании негладких пористых поверх- ностей (искусственная кожа, кожа живых лиц и трупов) частичный или полный генотип можно получить при проведении смывов, осуществлен- ных с помощью растворов, содержащих дНК- стабилизирующие компоненты, с последующим выделением дНК при помощи различных ме- тодов экстракции дНК, либо с использованием коммерческих наборов реагентов, включающих сорбент на основе кремнезема [22]. Выбор метода, режима и условий экстракции дНК имеет принципиальное значение при рабо- те с объектами, содержащими крайне малые ко- личества дНК. Результаты проведенных иссле- дований показали, что +37°С является наиболее оптимальной температурой инкубации биологи- ческого материала в лизирующем буфере, так как при данной температуре по сравнению с +56°С и +70°С скорость гидролиза фосфодиэфирных свя- зей дНК минимальна, что особенно важно при работе с такими сложными объектами, как отпе- чатки пальцев, следы сухой крови и др. [23]. Работа с ПЖС, обработанными специальны- ми средствами для их визуализации, например дП, ставит перед экспертом задачу максимальной очистки препаратов дНК от ингибиторов [10, 24]. Несмотря на то, что сложные методы экс- тракции дНК позволяют максимально изба- виться от присутствия ингибиторов ПЦР, боль- шие потери генетического материала в процессе выделения (например, при фенол-органической экстракции) делают их неприемлемыми для пробоподготовки большинства такого рода био- объектов. Простые же методы выделения дНК (например, с помощью ионообменной смолы Chelex-100) позволяют с минимальными поте- рями извлекать генетический материал, однако не всегда обеспечивают необходимую чистоту получаемого препарата дНК [7]. Применение простых методов экстракции дНК из ПЖС, обработанных дП, не оказыва- ющих существенного воздействия на эффек- тивность ПЦР, существенно облегчит задачу эксперта-генетика в получении генетического профиля этих ПЖС. При исследовании ПЖС на поверхности кожи трупов необходимо также учитывать ус- ловия и механизмы наступления смерти, пере- мещение, транспортировку и хранение тела с точки зрения пригодности материала для даль- нейшего исследования [14]. Высокая чувствительность ПЦР-анализа выдвигает жесткие требования к правилам вы- деления дНК из биологического материала, поэтому большое внимание следует уделять ме- тодам экстракции и очистки дНК с целью пред- упреждения как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов. Интерпретация результатов генотипирования ДНК ПЖС При работе с биологическими объектами, со- держащими крайне малое количество генетиче- ского материала, в том числе ПЖС пальцев рук, в результате типирования зачастую выявляют неполный генетический профиль. В таких слу- чаях могут наблюдаться отсутствие результа- тов энзиматической амплификации отдельных локусов дНК, дополнительные («фантомные») аллели, эффекты выпадения аллелей (эффекты «ложной гомозиготы») [22]. Поэтому при от- сутствии объектов сравнения интерпретация результатов исследования генетических профи- лей такого рода объектов зачастую крайне за- труднительна [12]. При интерпретации генетических профилей объектов, содержащих малое количество гене- тического материала, необходимо исключить как ложноотрицательные выводы в экспертизах (исключение причастности идентифицируемого лица к происхождению исследованных объек- тов), так и ложноположительные, когда эксперт принимает ложные («фантомные») аллели за истинные и делает вывод о наличии смеси дНК различных людей в объекте, в котором, на самом деле, эта, так называемая, смесь отсутствует. А появление «лишних» аллелей обусловлено край- не низкой концентрацией дНК-матрицы [21]. Том 9 № 2 2017 81 ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Однако, при исследованиях ПЖС, кроме крайне низкого содержания биоматериала, прак- тически во всех случаях необходимо учитывать возможность наличия смеси дНК в объекте. Приказом от 12 мая 2010 г. № 346н Минздрав- соцразвития России «Об утверждении порядка организации и производства судебно-медицин- ских экспертиз в государственных судебно-экс- пертных учреждениях Российской Федерации», регламентировано «для обоснованного вывода о безусловном исключении причастности иден- тифицируемого лица к происхождению иссле- дованных объектов несовпадение аллельных профилей должно быть зарегистрировано как минимум для двух несцепленных локусов (в некоторых случаях с учетом конкретных обсто- ятельств исключающий вывод может быть обо- снован при однолокусном несовпадении гетеро- зиготных профилей)» (п. 84.11.6.) [25]. Экспериментально доказано, что при срав- нительном исследовании генотипа конкретного лица с генотипом, полученным из ПЖС пальцев рук, оставленных более недели назад, возраста- ет вероятность получения ложных результатов генотипирования по двум и более локусам. В случае несовпадения аллельных состояний по двум и более локусам, а конкретно - несовпа- дении аллелей подозреваемого с генетическим профилем ПЖС, можно сделать вывод об ис- ключении происхождения следа от данного лица. При отсутствии аллелей подозреваемого в профиле ПЖС, вызванном низкой концен- трацией матричной дНК, эксперту следует де- лать некатегорический вывод о не исключении возможности происхождения следа от данного лица, либо о непригодности результатов для сравнительного исследования. В случае появле- ния «фантомных» аллелей возможно проведе- ние стандартного вычисления вероятности уча- стия лица в смесевом генетическом профиле. Поэтому для достоверного подтверждения, либо исключения тождества исследуемых про- филей необходимо осуществлять генетический анализ объекта в нескольких параллелях [9]. Заключение Использование стандартных методов ис- следования потожировых следов человека в экспертной практике зачастую сопряжено с трудностями получения идентификацион- но значимых результатов в дНК-анализе, что связано с исходно малым содержанием гене- тического материала в образцах, деградацией активной дНК-матрицы, контаминацией, либо ингибированием реакции энзиматической ам- плификации при недостаточной очистке пре- паратов дНК. Необходим качественно новый подход к методологии сбора, транспортировки, хранения, исследованию и интерпретации ре- зультатов идентификационного исследования следов, оставленных человеком. Комплексный подход к идентификации отпечатков пальцев может позволить одновременно проводить дер- матоглифические и молекулярно-генетические исследования.

About the authors

T G Faleeva

Northwestern State Medical university named after I. I. Mechnikov

References

Supplementary files