Клинико-лабораторный профиль наследственного сфероцитоза

Полный текст

Наследственный сфероцитоз (НС, по МКБ 10 — D58.0) — это наследственное заболевание, связанное с дефектом белков мембраны эритроцита, сопровождающееся развитием гемолитической анемии различной степени тяжести [1].

Впервые НС был описан в 1871 г. бельгийскими врачами С. Vanlair и J. Masius как случай гемолитической анемии. У пациента наблюдались желтуха, выраженная спленомегалия, острые боли в верхней части живота, анемия с наличием мелких красных сферичных глобул, которые они назвали «микросфероциты» [2]. O. Minkowski ассоциировал наличие анемии с уробилинурией и спленомегалией и предположил, что усиленное разрушение эритроцитов объясняется поражением селезенки. Таким образом, признание желтухи как процесса, связанного с гемолитической анемией, приписывают O. Minkowski [3]. В начале XX в. немецкий врач A. Chauffard независимо от O. Minkowski описал врожденную гемолитическую анемию и отметил снижение осмотической резистентности эритроцитов, а также наличие уробилинурии и спленомегалии [2]. В первом десятилетии ХХ в. A. Chauffard доказал снижение осмотической резистентности эритроцитов в гипотонических растворах хлорида натрия у пациентов с врожденной желтухой, в то время как у здоровых лиц такого явления не отмечалось. Наблюдения обоих авторов привели к тому, что впоследствии НС был назван анемией Минковского – Шоффара [4].

При НС уменьшается поверхность эритроцита по отношению к его объему, это приводит к тому, что эритроцит становится сферичным и теряет свою деформабельность [5].

НС наследуется по аутосомно-доминантному типу в 75 % случаев (мутации в генах, кодирующих анкирин, спектрин и белок полосы 3). Аутосомно-рецессивно наследуемые мутации в гене, кодирующем альфа-спектрин, либо белок полосы 4.2 и мутации, возникшие de novo, составляют 25 % случаев. Больные с не доминантным НС представляют собой большую проблему при генетическом консультировании [6].

Тяжесть заболевания определяется генетически унаследованным типом повреждения мембраны эритроцитов и количеством микросфероцитов в крови. Макрофаги селезенки селективно захватывают микросфероциты, что приводит к сокращению продолжительности их жизни до 70–80 дней. Степень тяжести гемолиза у различных пациентов варьирует и может осложниться инфекцией [1].

Эпидемиология микросфероцитоза

НС встречается во всех этнических и расовых группах [7]. В Северной Европе НС является самой распространенной причиной наследственной гемолитической анемии и встречается с частотой 1 : 2500, в США — с частотой 1 : 5000 [8]. Частота встречаемости НС среди африканцев и жителей Юго-Восточной Азии особенно низкая [9]. Распространенность НС в других популяциях изучена недостаточно [7].

Патогенез

На билипидном слое цитоплазматической мембраны расположен белковый слой цитоскелета эритроцита, представленный в основном спектрином, который связан с белком 4.1 и актином [10].

Молекула белка полосы 3 имеет три домена: N-терминальный домен, гидрофобный трансмембранный домен и С-терминальный домен. В норме N-терминальный домен связан с белком полосы 4.2 и гемоглобином; гидрофобный трансмембранный домен формирует комплекс с RH-ассоциированными белками; С-терминальный домен имеет участок для связывания карбоангидразы II. Гликофорин С и гликофорин А также ассоциированы с белком полосы 3 и участвуют в стабилизации мембраны.

Таким образом, дефицит или дисфункция любого из этих белков приводит к нарушению морфологии эритроцита. Эритроцит превращается в микросфероцит, представляющий собой эритроцит шарообразной формы, имеющий маленький диаметр (6,2–6,7 мкм), при этом объем микросфероцита остается в пределах нормы [11, 12].

В мазке периферической крови микросфероциты имеют вид мелких клеток без центрального просветления (рис. 1).

 

Рис. 1. Мазок периферической крови пациента с наследственным сфероцитозом. Окраска по Романовскому – Гимзе (× 1000)

Fig. 1. Peripheral blood smear of the patient with hereditary spherocytosis. Staining according to Romanovsky-Giemsa (× 1000)

 

Микросфероциты избирательно захватываются и разрушаются селезенкой, что играет ключевую роль в клинических проявлениях этого заболевания [13].

Клинические проявления

Клиническая картина НС очень разнообразна. Заболевание проявляется в любой период жизни, чаще это происходит в детстве или подростковом возрасте под влиянием провоцирующих факторов, таких как перенесенная инфекция, переохлаждение, хирургическое вмешательство, беременность и т. д. [13].

Для НС характерно хроническое течение: периоды ремиссии сменяются периодами гемолитического криза. Отсюда складывается клиническая картина НС — классическая «триада» симптомов: желтуха, спленомегалия и анемия [14, 15]. При тяжелом течении заболевания у пациентов с детства формируются типичные для НС внешние признаки: башенная форма черепа, седловидный нос, изменение расположения зубов, высокое нёбо, микрофтальм, которые не всегда наблюдаются одновременно [16].

Повышенная температура, болезненность селезенки при пальпации и ее увеличение возникают на фоне постоянного гемолиза [17]. Частым осложнением является желчнокаменная болезнь из-за образования билирубиновых камней в желчном пузыре и в желчных протоках.

Выявление микросфероцитов, большого числа ретикулоцитов и билирубинемии за счет фракции непрямого билирубина наводит на мысль о наличие НС. При отсутствии микросфероцитов и ретикулоцитоза в периферической крови нельзя полностью исключить НС с бессимптомным течением [5].

У некоторых детей с НС в младенчестве диагностируют гемолитическую болезнь новорожденных, им показана фототерапия как основной метод лечения [18, 19]. Младенцам, страдающим тяжелой формой НС, при наличии анемии в течение первых нескольких недель жизни может потребоваться переливание крови. Большинство таких детей остаются трансфузионно зависимыми [15, 20].

Чаще всего у пациентов с легкой или средней степенью тяжести НС наблюдается компенсированный гемолиз с легко или умеренно выраженной анемией либо без нее. Пациенты предъявляют жалобы на усталость, быструю утомляемость и бледность [21]. Это могут быть пациенты как с доминантными, так и с рецессивными формами НС. Тяжело болеющие пациенты становятся трансфузионно зависимыми. У них существует высокий риск развития осложнений, связанных с переливанием крови или перенасыщением организма железом [22].

Лабораторная диагностика наследственного сфероцитоза

В классических случаях постановка диагноза НС не вызывает сложностей. Она основывается на клинической картине, данных лабораторных и инструментальных методов диагностики и семейного анамнеза. Необходимо исключить другие причины гемолиза, в частности аутоиммунную гемолитическую анемию, дисэритропоэтическую анемию типа II (CDA II).

Лабораторные данные характеризуются нормохромной микросфероцитарной анемией различной степени выраженности. При просмотре окрашенного мазка периферической крови обнаруживают микросфероциты. Индекс сферичности эритроцитов снижен. Чаще всего сложности в интерпретации результатов возникают при атипичных, вялотекущих, компенсированных формах НС, при сочетании НС с другими заболеваниями, например, с синдромом Жильбера [23–25], гемолитической анемией, вызванной недостаточностью фермента глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы [25], и т. д.

Для лабораторной диагностики НС применяют следующие методы:

1) клинический анализ крови с морфологической оценкой эритроцитов, расчетом эритроцитарных параметров и подсчетом количества ретикулоцитов;

2) расчет морфометрических параметров эритроцитов;

3) биохимический анализ крови (определение уровня билирубина в сыворотке, минимальной и максимальной осмотической резистентности эритроцитов, глицериновый тест на определение скорости лизиса эритроцитов, электрофорез мембранных белков);

4) тест с использованием флуоресцентного красителя эозин-5-малеимида (ЭМА-тест);

5) эктацитометрия.

Клинический анализ крови. При НС почти у всех пациентов выявляют анемию различной степени выраженности. Средний объем эритроцитов (MCV) остается в пределах нормы. У большинства пациентов вследствие клеточной дегидратации показатель средней концентрации гемоглобина в эритроците (MCHC) повышен (≥345 г/л), индекс ширины распределения эритроцитов по объему (RDW) повышен (>14 %) [26]. При изучении расчетных данных, полученных при помощи гематологических анализаторов, можно заподозрить наличие у пациента НС [27, 28]. Некоторые авторы исследовали чувствительность показателей MCHC и RDW [29], а также рассчитанных на их основе соотношений Hb/MCHC, Hb/RDW и MCHC/RDW [30]. Чувствительность и специфичность этих параметров у авторов различаются.

Некоторые автоматические гематологические анализаторы измеряют концентрацию гемоглобина в отдельных эритроцитах. Увеличение числа плотных дегидратированных клеток позволяет идентифицировать всех пациентов с НС без проведения дополнительных лабораторных исследований, особенно когда известно, что один из членов семьи уже болен [27]. Такие анализаторы не доступны большинству лабораторий, поэтому до сих пор для выявления микросфероцитов в периферической крови наиболее часто применяют микроскопию окрашенного мазка.

При микроскопии мазка периферической крови у пациентов с НС обнаруживают микросфероциты, которые являются отличительной, но не диагностической чертой данного заболевания (рис. 2). Их количество варьирует от единичных до многочисленных [13]. У некоторых больных со специфической аномалией мембранных белков выявляют шизоциты (дефект белка полосы 3) или акантоциты (дефект β-спектрина). При просмотре мазка периферической крови врач отмечает наличие анизоцитоза в полуколичественной форме: в виде балльной системы (1+, 2+, 3+) или словесного описания (легкий, умеренный или выраженный анизоцитоз эритроцитов), что недостаточно для постановки диагноза. Данный метод описания носит субъективный характер и зависит от опыта врача и качества приготовления мазка [31].

 

Рис. 2. Морфология микросфероцитов в мазке периферической крови пациента с наследственным сфероцитозом. Окраска по Романовскому – Гимзе (× 1000)

Fig. 2. The morphology of microspherocytes in a peripheral blood smear of the patient with hereditary spherocytosis. Staining according to Romanovsky-Giemsa (× 1000)

 

Необходимо учитывать, что существуют и другие причины появления микросфероцитов в периферической крови, такие как аутоиммунная гемолитическая анемия, микроангиопатическая гемолитическая анемия, реакция на переливание крови, ожоговая болезнь, некоторые заболевания печени, наследственный пиропойкилоцитоз, клостридиальный сепсис, отравление ядом некоторых змей, пауков и т. д. [32].

Как известно, в период гемолитического криза у больных НС количество ретикулоцитов резко возрастает и может достигать 16 %, а в периоды ремиссии приближается к нормальным значениям. Данные анализа периферической крови и количество ретикулоцитов могут позволить заподозрить диагноз НС, но не подтвердить его. В настоящее время ведется изучение ретикулоцитарных параметров (средний объем ретикулоцитов MRV, незрелая ретикулоцитарная фракция IRF) у пациентов с НС для использования их в качестве скрининг-метода (рис. 3) [33].

 

Рис. 3. Ретикулоциты пациента с наследственным сфероцитозом, окрашенные суправитальной методикой бриллиантовым крезиловым синим (× 1000)

Fig. 3. Reticulocytes of the patient with hereditary spherocytosis stained with a supravital technique of diamond cresyl blue (× 1000)

 

Расчет морфометрических параметров эритроцитов. Наиболее информативным методом описания морфологически измененных форм эритроцитов является количественная оценка морфологических параметров эритроцитов: средний диаметр эритроцитов (СДЭ, или D_эр, мкм), толщина эритроцитов (Т_эр, мкм) и индекс сферичности (R_сф). Оценка этих параметров эритроцитов классическим микроскопическим методом представляет собой чрезвычайно трудоемкую процедуру, требующую измерения с помощью окуляра-микрометра параметров эритроцитов в окрашенных препаратах крови [31]. Для стандартизации условий измерения используют аппаратно-программный комплекс (АПК), состоящий из микроскопа, цифровой цветной камеры высокого разрешения, компьютера с периферийными устройствами и программного обеспечения с набором методик. На сегодняшний день лаборатории не оснащены подобного типа АПК и данная методика не имеет широкого применения [34].

Исследование уровня билирубина в сыворотке. У больных отмечаются повышение уровня непрямого билирубина, гипогаптоглобулинемия, степень выраженности которых зависит от интенсивности гемолиза. В период гемолитического криза концентрация билирубина в сыворотке крови увеличивается в 5 раз и более по сравнению с нормальными значениями, а в период ремиссии или при компенсированном гемолизе — приближается к референтным значениям [35].

Тест на осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ), оценивающий лизис эритроцитов в условиях in vitro под действием гипотонических растворов, используют в диагностике НС как дополнительное исследование, помогающее подтвердить диагноз. В связи с уменьшением соотношения площади мембраны эритроцита и его объема микросфероциты не способны выдерживать поступление воды в клетку при воздействии на них гипотоническими солевыми растворами, поэтому подвергаются гемолизу быстрее нормальных эритроцитов в солевых растворах [36].

Примерно у 25 % больных наследственным сфероцитозом ОРЭ свежей крови остается в пределах нормы. Патологические результаты ОРЭ могут определяться при различных физиологических и патологических состояниях организма, например, после хирургических вмешательств, на фоне лечения некоторыми препаратами, при беременности и т. д. [8]. Данный тест обладает низкими чувствительностью и специфичностью, является очень трудоемким, длительным в исполнении и не подходит для использования в лабораториях в качестве рутинного исследования.

Глицериновый тест на определение скорости лизиса эритроцитов. В 1974 г. E. Готфрид и Н. Робертсон предложили количественный метод оценки осмотической резистентности эритроцитов под действием глицеринового буфера. Это однопробирочный тест для определения времени, за которое происходит до 50 % гемолиза образца крови в буферной гипотонической глицериново-солевой смеси. Принцип действия заключается в том, что глицерин, находящийся в гипотоническом буферном солевом растворе, уменьшает скорость вхождения молекул воды в эритроциты. О скорости гемолиза эритроцитов судят по снижению оптической плотности реакционной смеси. Для выполнения данного теста не требуется специального оборудования, достаточно спектрофотометра, оснащенного линейно-логарифмическим самописцем, либо колориметра и секундомера. Данную методику можно применять как у взрослых, так и у новорожденных, так как для ее осуществления необходим небольшой объем крови (20 мкл) [37]. Как и тест на ОРЭ, данное исследование дает возможность отличить сфероциты от нормальных эритроцитов, но не позволяет установить причину сфероцитоза. Укорочение времени гемолиза эритроцитов, так же как сниженная ОРЭ, может наблюдаться при различных физиологических и патологических состояниях, таких как онкологические заболевания, хронические заболевания почек, беременность и т. д. [8].

Для постановки диагноза в нетипично протекающих случаях НС используют количественное определение мембранных белков эритроцитов при помощи SDS-PAGE электрофореза по Лэммли. Электрофорез помогает выявить аномалии эритроцитов в 70–80 % случаев. Метод доступен лишь специализированным лабораториям, так как он требует высокой точности исполнения, а интерпретация результатов может вызывать сложности [5].

Тест на связывание красителя эозин-5-малеимида (метод проточной цитометрии) на сегодняшний день является наиболее информативным. Он основан на оценке интенсивности флюоресценции, которую определяют по количеству связанных с красителем эозин-5-малеимидом мембранных белков: белка полосы 3 и RH-ассоциированных белков. Дефицит белка полосы 3 и связанных с ним мембранных белков приводит к уменьшению флюоресценции, как правило, до 65 % от нормы. Несмотря на то что дефект белка полосы 3 обнаруживают у 25 % больных наследственным сфероцитозом, уменьшение флюоресценции наблюдается также в случаях с дефицитом анкирина и спектрина за счет нарушения передачи сигнала через мембрану, что влияет на связывание эозин-5-малеимида с белком полосы 3. ЭМА-тест обладает достаточными специфичностью и чувствительностью в качестве дополнительного метода диагностики НС (97 и 98 % соответственно). Данный тест не коррелирует со степенью тяжести заболевания [38]. Однако интенсивность свечения красителя эозин-5-малеимида может быть снижена и при других заболеваниях, которые сопровождаются наличием морфологически измененных эритроцитов, например при серповидноклеточной анемии и т. д.

Наиболее точно определить степень деформабельности эритроцитов можно при помощи метода эктацитометрии, в основе которого лежит измерение степени деформации эритроцита под действием силы трения, возникающей при сдвиговом потоке жидкости. Суть метода состоит в следующем: между стенками двух стаканов эктацитометра заливают суспензию эритроцитов. Один из этих стаканов остается неподвижным, а второй вращается с заданной скоростью, и вследствие создающегося трения эритроциты вытягиваются [39]. Суспензию просвечивают лазерным пучком и наблюдают картину рассеяния света на эритроцитах [40]. Этот метод используют лишь в специализированных лабораториях, так как он трудоемок и для проведения анализа необходимо специальное оборудование.

Несмотря на совершенствование различных методов оценки эритроцитов, трудности в диагностике НС по-прежнему сохраняются, о чем свидетельствует большое количество недавно появившихся публикаций, посвященных разработке алгоритмов и подходов к выявлению НС [23].

Заключение

НС служит самой распространенной причиной гемолиза у пациентов в Северной Европе и США [8]. При латентном течении НС возникают трудности в диагностике, поскольку результаты исследований могут находиться в пределах возрастной нормы либо попадать в интервал между нормальными и типичными для НС значениями. Существующие лабораторные методы не обладают необходимыми чувствительностью и специфичностью. По этой причине одним из перспективных направлений в изучении НС является исследование новых чувствительных и специфичных методов и разработка клинико-лабораторного алгоритма его диагностики. До сих пор не определен общий подход к диагностике микросфероцитозов и отсутствуют программы скрининга, что затрудняет раннюю диагностику и лечение этой категории пациентов.

Увеличение доли пациентов с микросфероцитозами, недостаточное знакомство практикующих врачей с данной проблемой, сложности, возникающие при дифференциальной диагностике, а также отсутствие руководств по выявлению НС обусловливают необходимость изучения данной проблемы с целью разработки новых лабораторных подходов к раннему выявлению пациентов с аномалиями белкового состава мембран эритроцитов.

На наш взгляд, для формирования современного подхода к диагностике НС необходимо решить ряд задач, в том числе оценить чувствительность и специфичность основных лабораторных маркеров НС, изучить возможности современных систем для выявления этого заболевания на этапе первичного скрининга.

Не вызывает сомнений, что разработка алгоритма диагностики НС с использованием набора современных лабораторных маркеров позволит обогатить как теоретическую, так и практическую медицину.

Об авторах

Татевик Тиграновна Асатрян

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России

Автор, ответственный за переписку.
Email: tatevik.asatryan@szgmu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9146-3080
SPIN-код: 5587-1360

аспирантка кафедры клинической лабораторной диагностики 

Россия, 195015, г. Санкт-Петербург, Кирочная ул., 41

Марина Николаевна Зенина

ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства»

Email: mari_ng@bk.ru
SPIN-код: 3580-9167

ассистент кафедры

Россия, 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-Советская, д.16

Наталия Юрьевна Черныш

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр имени В.А. Алмазова»

Email: nycher@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-3800-2680
SPIN-код: 6801-3813

 к.м.н., доцент кафедры клинической лабораторной диагностики

Россия, 197341, г. Санкт-Петербург, ул. Аккуратова, д. 2

Лариса Борисовна Гайковая

ФГБОУ ВО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова» Минздрава России

Email: largaykovaya@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1000-1114
SPIN-код: 9424-1076
Scopus Author ID: 57195760287

профессор, заведующая кафедры биологической и общей химии

 

Россия, 195015, г. Санкт-Петербург, Кирочная ул., 41

Список литературы

Дополнительные файлы