Kisspeptin and polycystic ovary syndrome - is there any connection?

Maria I. Yarmolinskaya; Ярмолинская Мария Игоревна; Nigar F. Ganbarli; Ганбарли Нигяр Фуадовна; Natalia N. Tkachenko; Ткаченко Наталья Николаевна; Vera I. Nikolaeva; Николаева Вера Ивановна; Gulrukhsor Kh. Tolibova; Толибова Гулрухсор Хайбуллоевна; Tatyana G. Tral; Траль Татьяна Георгиевна; Viktor V. Rulev; Рулев Виктор Викторович; Anna A. Tsypurdeeva; Цыпурдеева Анна Алексеевна

doi:10.17816/JOWD66673-80

Kisspeptin and polycystic ovary syndrome - is there any connection?

Authors: Yarmolinskaya M.I.¹, Ganbarli N.F.¹, Tkachenko N.N.¹, Nikolaeva V.I.¹, Tolibova G.K.¹, Tral T.G.¹, Rulev V.V.¹, Tsypurdeeva A.A.¹
Affiliations:
1. Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott
Issue: Vol 66, No 6 (2017)
Pages: 73-80
Section: Articles
URL: https://journals.eco-vector.com/jowd/article/view/7686
DOI: https://doi.org/10.17816/JOWD66673-80
ID: 7686

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is one of the most common endocrine disorders in women of reproductive age. It is known that kisspeptin stimulates activity of GnRH neurons and secretion of FSH and LH, thus disruption of interaction between kisspeptin and its receptor leads to anovulation. The aim of the study was to investigate the role kisspeptin in the pathogenesis of polycystic ovary syndrome. Materials and methods. The study included 14 patients with classic phenotype of PCOS and 11 healthy women of the control group. All the patients underwent laparoscopy and hysteroscopy with histological examination of ovarian tissue and endometrium. Determination of kisspeptin, FSH, LH, prolactin, AMH, estradiol, estrone, androgens (free testosterone and dehydroepiandrosterone sulfate) levels in peripheral blood in healthy women and patients with PCOS was performed by ELISA on the 2d and 8th days of menstrual cycle. Progesterone levels were investigated on the 18th-22d days of menstrual cycle. Expression of kisspeptin and its receptor in ovarian tissue and endometrium was estimated using immunohistochemical method. Results. Level of kisspeptin in peripheral blood of patients with PCOS tends to increase compared to its level in the control group, but the found difference was not reliable. Direct correlation between serum level of kisspeptin and levels of LH, free testosterone and DHEA-S was revealed in patients with PCOS. Immunohistochemical study in patients with PCOS showed a significant increase in the area of expression of КІЅЅ1 and KISS1R receptor in endometrium and in ovarian biopsies compared to these values in the control group. Conclusion. The obtained data show a definite role of kisspeptin in pathogenesis of polycystic ovary syndrome, but further research is needed.

Keywords

kisspeptin (KISS), kisspeptin receptor (KISS1R), polycystic ovary syndrome, peripheral blood, endometrium, ovarian biopsies, immunohistochemical method study

Full Text

Синдром поликистозных яичников (СПЯ) — одно из распространенных гинекологических заболеваний и встречается в популяции у 5–10 % пациенток и у 10–15 % женщин репродуктивного возраста [1]. С момента описания синдрома J. Stein и J.M. Levental в 1935 г. до настоящего времени не выработано единого представления о патогенезе этого состояния. Классический симптомокомплекс данного заболевания включает нарушения менструального цикла, чаще всего по типу опсоменореи, андрогензависимую дерматопатию (гирсутизм, acne vulgaris, алопецию) и УЗ-признаки увеличенных в размерах яичников с характерным строением, а также бесплодие. У женщин с ановуляторным бесплодием СПЯ устанавливается в 55–91 % случаев [1]. Хроническая ановуляция у женщин с СПЯ является фактором риска развития гиперплазии и рака эндометрия. В настоящее время синдром поликистозных яичников рассматривается как мультифакторное заболевание, имеющее четыре основных фенотипа [1]. Известно, что кисспептин и его рецептор играют важную роль в системе гипоталамус – гипофиз – яичники и участвуют в половом созревании [2, 3]. Обнаружение роли сигнального пути кисспептин/KISS1R в функционировании репродуктивной системы считается одним из основных механизмов в понимании регуляции секреции гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) [4]. ГнРГ-нейроны образуют финальный общий путь контроля фертильности, так как ГнРГ, выделяемый аксонами, может сти мулировать секрецию ЛГ и ФСГ передней доли гипофиза [5]. Гонадотропины, в свою очередь, стимулируют стероидогенез и гаметогенез [5].

Поскольку при классическом фенотипе СПЯ отмечается увеличение базального уровня ЛГ по отношению к уровню ФСГ, вызывает интерес изучение кисспептина (KISS) и его рецептора (KISS1R) в патогенезе данного заболевания.

Существует небольшое число работ, посвященных изучению уровня кисспептина при СПЯ. В одном из исследований [6] при изучении содержания кисспептина в периферической крови у больных СПЯ было сформировано три группы. Первую группу составили 19 девушек-подростков с СПЯ, вторую — 23 взрослых пациентки с СПЯ и в группу контроля вошли 20 здоровых подростков. Взятие крови проводилось с 1-го по 5-й день спонтанных менструальных выделений в группе СПЯ и в интервале с 1-го по 5-й день менструального цикла в группе контроля через 9 часов ночного голодания. В полученных образцах крови определялись уровни кисспептина (метастина), ЛГ, ФСГ, пролактина, тестостерона, свободного тестостерона, ДГЭА-С (дегидроэпиандростерона-сульфата), глобулина, связывающего половые стероиды, инсулина, глюкозы. Результаты исследования показали, что уровни кисспептина (метастина) в плазме крови были повышены у девушек-подростков и у женщин репродуктивного возраста с СПЯ по сравнению с уровнем у подростков контрольной группы. Было отмечено, что содержание кисспептина положительно коррелировало с уровнями ЛГ, тестостерона и уровнем глюкозы, измеренного через два часа при проведении перорального глюкозотолерантного теста. Коэффициент корреляции (r) между уровнем метастина и уровнем глюкозы для подростков с СПЯ составил 0,256, для женщин с СПЯ репродуктивного возраста — 0,286, для контрольной группы — 0,267 соответственно. Полученные результаты дают основание предполагать, что кисспептин может принимать участие в развитии СПЯ у подростков [6].

В одном из исследований Y. Jeon et al. в 2013 г. было показано, что уровень кисспептина в периферической крови у женщин при сочетании СПЯ с ожирением был достоверно повышен на 3-й и 8-й дни менструального цикла по сравнению с уровнем кисспептина в крови здоровых женщин. Была определена прямая корреляция между уровнем кисспептина в периферической крови у пациенток с СПЯ, страдающих ожирением, и индексом свободных андрогенов [7].

В исследовании S. Yilmaz et al. (2014) было изучено содержание в сыворотке крови уровня кисспептина у здоровых женщин и у больных СПЯ, как с избытком массы тела или ожирением, так и с нормальным весом [8]. Образцы крови собирали в период со 2-го по 5-й день менструального цикла и определяли уровни метастина, ЛГ, ФСГ, ПРЛ, ТТГ, ДЭА, 17-ОНР, глобулина, связывающего половые стероиды, инсулина, глюкозы, оценивали липидный профиль. Результаты исследования показали, что уровень метастина в периферической крови был выше у женщин с синдромом поликистозных яичников по сравнению с показателем в контрольной группе независимо от индекса массы тела. Кроме того, авторы работы высказали предположение, что метастин может быть использован в качестве специфического маркера для оценки андрогенного профиля и играть определенную роль в патогенезе СПЯ [8].

Таким образом, представленные результаты показывают несомненные перспективы дальнейших исследований кисспептина в развитии СПЯ.

Цель исследования — изучить роль кисспептина в патогенезе синдрома поликистозных яичников.

Материалы и методы

В исследование вошли 14 больных с классическим фенотипом синдрома поликистозных яичников и 11 здоровых женщин, составивших контрольную группу. Диагноз у всех больных СПЯ был установлен на основании лапароскопии и подтвержден результатами гистологического исследования. Контрольную группу составили пациентки, у которых при лапароскопическом обследовании не было найдено гинекологической патологии. Гормональное обследование выполнялось на 2-й и 8-й дни менструального цикла и включало определение в сыворотке крови уровня кисспептина, ФСГ, ЛГ, АМГ, пролактина, эстрадиола, эстрона, андро генов (свободного тестостерона, ДЭА-C). У больных СПЯ и женщин контрольной группы проводилось определение уровня прогестерона с 18-го по 22-й день менструального цикла. Уровни пролактина, ФСГ, ЛГ, ДЭА-C определяли при помощи тест-систем «Алкор-био» (Россия). Содержание эстрадиола, андростендиона, свободного тестостерона и эстрона определяли при помощи тест-систем DRG Instruments (Германия); АМГ — с использованием тест-системы Beckman Coulter (США). Содержание прогестерона устанавливали с помощью иммуноферментного метода с усиленной хемилюминесценцией на тест-системе DRG Instruments (Германия). Также для выяснения уровня кисспептина в периферической крови образцы крови собирались на 2-й и 8-й дни менструального цикла в полипропиленовую пробирку, содержащую ЭДТА (1 мг/мл крови) в качестве антикоагулянта и апротинин (500 КМЕ/мл крови) в качестве ингибитора протеаз. Далее проводилось центрифугирование образцов крови при частоте вращения 4 × 1000 мин-1 в течение 15 минут при температуре 5 °C. На следующем этапе верхний слой плазмы собирался в пробирку типа Эппендорф с дальнейшим замораживанием образца до –70 °C. Уровень кисспептина-54 в сыворотке крови определялся методом хроматографии с помощью набора Peninsula Laboratories, LLC (Bachem Group, США).

Всем пациенткам было проведено ком плексное морфологическое (гистологическое и иммуногистохимическое) исследование ткани яичника и биоптатов эндометрия, полученных с 18-го по 22-й день менструального цикла. Гистологическое исследование было выполнено по стандартной методике с обзорной окраской гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического исследования экспрессии рецепторов кисспептина использовали первичные моноклональные мышиные антитела к KISS [клон ab 55384] производства Abcam в стандартном разведении 1 : 100; для изучения его рецептора KISS1R [клон ab 140839] применяли поликлональные кроличьи антитела производства Abcam в стандартном разведении 1 : 200. Результаты иммуногистохимического исследования оценивали методом морфометрии при помощи системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Olympus, цифровой камеры Olympus-BX46 и программного обеспечения СellSens Entry. Дальнейшее количественное исследование (оптическую плотность и площадь экспрессии) осуществляли с помощью программы компьютерного анализа изображений «Морфология 5.0» (ВидеоТест, Россия). Величина оптической плотности экспрессии вычислялась автоматически в соответствии с законом Бугера – Ламберта – Бера; значение относительной площади экспрессии вычисляли как отношение площади иммунопозитивных клеток к общей площади препарата.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартных пакетов статистического анализа (STATGRAPHICS v.6.0). Методы дескpиптивной статистики включали в себя оценку сpеднего аpифметического (M), сpедней ошибки сpеднего значения (m) для признаков, имеющих непрерывное распределение, а также частоты встречаемости признаков с дискретными значе ниями.

Для оценки межгрупповых различий применяли t-критерий Стьюдента и коэффициент корреляции Спирмена с соблюдением рекомендаций для медицинских и биологических исследований. Критическое значение уровня значимости (p) для проверки нулевых гипотез принимали p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Средний возраст больных СПЯ составил 32,5 ± 7,5 года, в группе контроля — 34,1 ± 4,9 года. У всех больных СПЯ отмечались опсоменорея, проявления андрогензависимой дермопатии различной степени выраженности, бесплодие (соотношение первичного бесплодия к вторичному составило 2 : 1). До лапароскопического обследования у больных СПЯ отмечались ультразвуковые признаки мультифолликулярных яичников с характерным строением. В группе женщин с СПЯ индекс массы тела (ИМТ) у пяти больных находился в пределах нормы (23,7 ± 1,8), у 9 — отмечался избыток массы тела (26,2 ± 1,4). В группе контроля у всех женщин ИМТ находился в пределах нормальных значений (22,9 ± 1,6).

Результаты обследования больных СПЯ показали, что уровень кисспептина в периферической крови на 2-й день менструального цикла имеет тенденцию к повышению (0,64 ± 0,06 нг/мл) по сравнению с показателями в контрольной группе (0,57 ± 0,04 нг/мл), что не противоречит данным других авто ров [6–8], однако отличия не были достоверными. Полученные нами результаты также согласуются с ретроспективным исследованием, проведенным в 2016 г. и включившим 285 пациенток с СПЯ и 162 женщины, составившие группу контроля [9]. При изучении уровня кисспептина в периферической крови у больных СПЯ и в группе контроля достоверных различий также отмечено не было [9]. Согласно результатам наших предыдущих исследований, уровень кисс пептина у больных СПЯ в фолликулярную фазу менструального цикла, несмотря на тенденцию к повышению, достоверно ниже, чем у больных с наружным генитальным эндометриозом (НГЭ). У пациенток с НГЭ уровень кисспептина в сыворотке крови на 2-й день менструального цикла составил 1,2 ± 0,04 нг/мл [10]. Отмечено достоверное повышение уровня АМГ у больных СПЯ (15,9 ± 0,63 нг/мл) по сравнению с его уровнем в группе контроля (5,74 ± 2,07 нг/мл; p < 0,05), что является «классической», наиболее часто описываемой гормональной характеристикой данного заболевания. Содержание ФСГ у больных СПЯ (7,6 ± 0,56 МЕ/л) достоверно не отличалось от значений в группе конт роля (7,24 ± 0,33 МЕ/л), при этом уровень ЛГ (11,94 ± 0,67 МЕ/л) в периферической крови у пациенток с СПЯ был достоверно выше по сравнению с показателем в контрольной группе (4,43 ± 0,37 МЕ/л; p < 0,01), что также характерно для большинства больных СПЯ. Установлено, что содержание кисспептина у больных СПЯ в сыворотке крови положительно коррелирует с уровнем ЛГ (коэффициент Спирмена (rs) составил 0,57). Уровень эстрадиола у пациенток с СПЯ достоверно выше (237,23 ± 34,36 пмоль/л) по сравнению с показателями в контрольной группе (186,80 ± 33,74 пмоль/л; p < 0,01). Содержание эстрона в периферической крови больных СПЯ также имело тенденцию к повышению относительно уровня в контрольной группе (262,91 ± 31,17 и 235,08 ± 34,21 пмоль/л соответственно), но достоверных отличий отмечено не было.

Коэффициент активности ароматазы овариальных фолликулов на 2-й день менструального цикла, рассчитанный по формуле Е2/АМГ, где Е2 — базальный уровень эстрадиола на 2-й день менструального цикла, деленный на уровень АМГ в крови на 2-й день менструального цикла [11], у больных СПЯ достоверно ниже (14,92 ± 2,49) по сравнению со значениями ароматазной активности в контрольной группе (32,54 ± 9,08; p < 0,01).

Содержание свободного тестостерона (9,38 ±± 0,54 пмоль/л) и ДГЭА-С (8,4 ± 1,61 мкмоль/л) в периферической крови у больных СПЯ имело тенденцию к повышению по сравнению с показателями в группе контроля (3,86 ± 0,74 и 6,50 ± 1,20 мкмоль/л соответственно; p < 0,01). Установлена прямая корреляционная связь между уровнем кисспептина и содержанием свободного тестостерона (rs = 0,73), а также уровнем кисспептина и ДГЭА-С (rs = 0,65). Уровень кисспептина в периферической крови у больных СПЯ на 8-й день менструального цикла также имел тенденцию к повышению по сравнению с показателями контрольной группы (0,63 ± 0,04 и 0,52 ± 0,03 нг/мл соответственно). Согласно результатам наших предыдущих исследований значения кисспептина у больных СПЯ были достоверно ниже при сравнении с его уровнем у больных НГЭ на 8-й день менструального цикла в периферической крови — 0,87 ± 0,05 нг/мл (p < 0,01) [10]. Сохранялось достоверное повышение уровня АМГ у больных СПЯ (17,39 ± 0,77 нг/мл) по сравнению с показателями в контрольной группе (7,54 ± 2,59 нг/мл; p < 0,05). Содержание ФСГ (6,57 ± 0,46 МЕ/л) у больных СПЯ не имело достоверных отличий от показателей группы контроля (7,14 ± 0,78 МЕ/л), при этом уровень ЛГ (11,50 ± 0,63 МЕ/л) в периферической крови у пациенток с СПЯ был достоверно выше по сравнению со значениями контрольной группы (6,10 ± 0,54 МЕ/л; p < 0,01). На 8-й день менструального цикла также отмечена положительная корреляция уровня кисспептина с уровнем ЛГ (rs = 0,68). Уровни пролактина (194,21 ± 32,64 мМ/л) и эстрадиола (279,4 ± 53,07 пмоль/л) на 8-й день менструального цикла у пациенток с СПЯ не имели достоверных отличий по сравнению с показателями контрольной группы (177,58 ± 28,60 мМЕ/л и 254,46 ± 67,23 пмоль/л соответственно; p < 0,01). Содержание свободного тестостерона (9,75 ± 0,98 пмоль/л) в периферической крови у больных СПЯ было достоверно повышено по сравнению с уровнем в контрольной группе (2,32 ± 0,63 пмоль/л соответственно; p < 0,01). Установлена прямая корреляционная связь между уровнем кисспептина и содержанием свободного тестостерона (rs составил 0,83).

Коэффициент активности ароматазы овариальных фолликулов на 8-й день менструального цикла у больных СПЯ, так же как и на 2-й день менструального цикла, достоверно ниже (16,06 ± 3,19) по сравнению с коэффициентом в контрольной группе (33,75 ± 8,46; p < 0,01).

При изучении уровня прогестерона у больных СПЯ с 18-го по 22-й день менструального цикла ановуляция установлена у 8 больных (7,2 ± 2,4 нмоль/л). У 5 больных СПЯ выявлена недостаточность лютеиновой фазы (уровень прогестерона составил 14,3 ± 2,9 нмоль/л). В группе контроля у всех женщин отмечен овуляторный менструальный цикл (содержание прогестерона 38,6 ± 4,1 нмоль/л).

При гистологическом изучении биоптатов корковой зоны яичников у больных СПЯ в 57,1 % (8) случаев выявлены кисты неовулировавшего фолликула и фолликулярные кисты, в 42,9 % (6) случаев наблюдались атрезирующиеся фолликулы. Биоптаты яичников контрольной группы исследования (11 случаев) были представлены корковой зоной с первичными фолликулами. В 18,2 % (2) исследуемых образцов были выявлены неовулировавший фолликул и формирующаяся фолликулярная киста, в 81,8 % (9) случаев в корковой зоне определялись атретические фолликулы (рис. 2, а).

При иммуногистохимическом исследовании биоптатов яичников у пациенток с СПЯ было обнаружено достоверное повышение площади экспрессии KISS и KISS1R по сравнению со значениями в группе контроля. Данные представлены на рис. 1.

Рис. 1. Относительная площадь экспрессии КISS и KISS1R в биоптатах яичников у пациенток обследованных групп (** p < 0,01; *** p < 0,001 внутри групп)

Рис. 2. Корковая зона яичника у больных синдромом поликистозных яичников с первичными фолликулами. Окраска гематоксилином и эозином, ×100 (а); экспрессия KISS и KISS1R в фрагментах яичника (в кистах яичника). ИГХ, ×400 (b, c)

Следует отметить, что согласно полученным нами ранее данным площадь экспрессии КISS и KISS1R у больных СПЯ в биоптатах яичников была достоверно выше по сравнению со значениями у больных НГЭ [10].

Межгрупповая оценка оптической плотности экспрессии KISS в биоптатах яичников не имела значимых отличий и составила 0,14 ± 0,01 и 0,12 ± 0,06. Оптическая плотность KISS1R составила 0,11 ± 0,05 по сравнению с группой контроля (0,10 ± 0,04). На рис. 2 (b, c) представлена экспрессия КISS и KISS1R в биоптатах яичников у пациенток с СПЯ.

При гистологическом исследовании эндо метрия в контрольной группе было отмечено, что эндометрий у 6 женщин (54,5 %) соответствовал средней стадии фазы секреции, у 3 (27,3 %) — ранней стадии фазы секреции, слабовыраженная секреторная трансформация эндометрия наблюдалась у 2 (18,2 %) пациенток.

Гистологическое исследование биоптатов эндометрия у 14 больных СПЯ выявило железистую гиперплазию эндометрия у 10 (71,4 %) пациенток, у 4 (28,6 %) больных эндометрий находился в ранней стадии фазы секреции.

Результаты иммуногистохимического исследования биоптатов эндометрия показали, что у пациенток с CПЯ площадь экспрессии КISS и KISS1R была достоверно выше при сопоставлении с группой контроля (*р < 0,05; ***р < 0,001). Вероятно, что повышенная экспрессия кисспептина и его рецептора в эндометрии может быть объяснена высокой частотой гиперплазии эндометрия, которая отмечена в нашем исследовании почти у 2/3 пациенток с СПЯ. Данные представлены на рис. 3.

Рис. 3. Относительная площадь экспрессии КISS и KISS1R в эндометрии пациенток обследованных групп (** p < 0,05; *** p < 0,01 при сравнении с конт рольной группой)

Оптическая плотность экспрессии КISS в эндометрии больных СПЯ статистически значимо не отличалась 0,15 ± 0,01 по сравнению со значениями в группе контроля (0,14 ± 0,001). В то же время оптическая плотность экспрессии КISS1R в группе больных СПЯ была достоверно выше 0,18 ± 0,005 при сопоставлении с показателями в контрольной группе (0,13 ± 0,001). На рис. 4 представлена гиперплазия эндометрия и экспрессия КISS и KISS1R в эндометрии у пациенток с СПЯ.

Рис. 4. Гиперплазия эндометрия. Окраска гематоксилином и эозином, ×400 (a); экспрессия KISS и KISS1R при гиперплазии эндометрия у больных синдромом поликистозных яичников. ИГХ ×400 (b, c)

Выводы

В крови больных СПЯ определяется тенденция к повышению уровня кисспептина по сравнению с показателями в контрольной группе, однако достоверных отличий получено не было. Кисспептин в крови пациенток с СПЯ положительно коррелирует с уровнем ЛГ, свободного тестостерона и ДГЭА-С. Гиперпродукция ЛГ, вероятно, связана со стимулирующим влиянием кисспептина на секрецию ГнРГ гипоталамусом. Однако полученные нами ранее данные не выявили связи между уровнем кисспептина и андрогенов у больных НГЭ.

Достоверное повышение площади экспрессии KISS и KISS1R в фрагментах ткани яичника и в биоптатах эндометрия у пациенток с СПЯ указывает на возможное влияние кисспептина на фолликулогенез и стероидогенез в яичниках. Вместе с тем корреляции между экспрессией кисспептина и его рецептора у больных СПЯ и уровнем половых стероидных гормонов крови нами получено не было. Также повышение экспрессии кисспептина и его рецептора в эндометрии может быть связано с высокой частотой гиперплазии эндометрия, которую мы наблюдали у пациенток с данным заболеванием.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить участие кисспептина в патогенезе СПЯ и его влияние на гормональную и овуляторную функции яичников, однако необходимо проведение дальнейших исследований.