Том 58, № 1 (2024)

УФ-излучение солнца индуцирует в ДНК клеток разных организмов фотохимические реакции, которые могут приводить к развитию ряда биологических ответов на возникающие повреждения, включая апоптоз, мутагенез и канцерогенез. Химическая природа и количество повреждений в ДНК зависят от длины волны УФ-излучения. УФ-излучение В-области (УФВ, 290–320 нм) вызывает образование двух главных дефектов –циклобутановых пиримидиновых димеров и с меньшим выходом пиримидин-(6-4)-пиримидоновых фотопродуктов; они формируются в результате прямого поглощения фотонов УФВ основаниями ДНК. УФ-излучение А-области (УФА, 320–400 нм), в отличие от УФВ, индуцирует с малым выходом формирование только циклобутановых димеров – наиболее вероятно путем триплет-триплетного переноса энергии от клеточных хромофоров к основаниям тимина ДНК. Вместе с тем УФА намного эффективнее по сравнению с УФВ в сенсибилизированном окислительном образовании дефектов в ДНК, таких как одноцепочечные разрывы и окисленные основания; из них наиболее часто встречается 8-оксодигидрогуанин, поскольку он может образовываться в нескольких окислительных процессах. За последнее время опубликовано много работ с новой, более детальной информацией о молекулярных механизмах фотохимических реакций, лежащих в основе формирования различных повреждений в ДНК. В настоящем обзоре обобщены и проанализированы в основном данные, содержащиеся в этих публикациях. Особое внимание уделено окислительным реакциям, которые инициируются активными формами кислорода и радикалами, генерируемыми потенциальными эндогенными фотосенсибилизаторами, такими как птерины, рибофлавин, протопорфирин IX, NADH и меланин. Обсуждается роль конкретных фотопродуктов ДНК в генотоксических процессах, индуцируемых в живых системах УФ-излучением разной длины волны, включая канцерогенез кожи человека.

Биомаркеры периферической крови, ввиду их неинвазивности, имеют особое значение для диагностики некоторых заболеваний, в том числе ишемической болезни сердца (ИБС). Исследование экспрессии некодирующих РНК (ncРНК) открывает путь к ранней диагностике, прогнозу и лечению заболеваний. Исследована группа ncРНК как потенциальных биомаркеров у пациентов с ИБС. Участники двух сформированных групп: контрольной и ИБС ‒ прошли собеседование и клиническое обследование. У всех были взяты образцы периферической крови и выделена плазма, в которой методом количественной ПЦР оценивали уровни целевых ncРНК, выбранных на основании анализа литературы и биоинформационного анализа. Созданная панель включала длинные ncРНК (lncRNA) MEG3, TUG1 и SRA1, а также одну микроРНК ‒ hsa-miR-21-3p. Выявлено статистически значимое повышение уровней MEG3, TUG1 и hsa-miR21-3p у пациентов с ИБС по сравнению с участниками контрольной группы (p < 0.01), в то время как для SRA1 замечена статистически незначимая тенденция к снижению экспрессии (p > 0.05). Для исследованных ncРНК выявлена значимая сильная корреляция с заболеваемостью, возрастом и курением. При построении сети выявлена сильная взаимосвязь между MEG3 и TUG1. По результатам ROC-анализа сделан вывод, что hsa-miR-21-3p можно рассматривать в качестве перспективного биомаркера ИБС. Более того, для MEG3 и TUG1 выявлена заметная диагностическая значимость, хотя меньшая, чем для hsa-miR-21-3p. Различия в уровнях экспрессии этих трех ncРНК между группами ИБС и контроля были статистически значимыми. Таким образом, уровни MEG3, TUG1 и hsa-miR-21-3p в плазме можно рассматривать в качестве потенциальных биомаркеров заболеваемости и диагностики ИБС.

Мобильные генетические элементы IS630/Tc1/mariner (ITm) являются широко распространенными представителями ДНК-транспозонов, вносящих значительный вклад в эволюцию геномов эукариот. Масштабное применение технологий секвенирования нового поколения (NGS) привело к появлению множества полногеномных нуклеотидных последовательностей новых организмов и выявлению элементов ITm в большинстве таксонов эукариот. Несмотря на достаточно детальную изученность разнообразия ITm, по-прежнему обнаруживаются элементы, которые способствуют расширению и пересмотру классификации этой группы ДНК-транспозонов. В представленной работе впервые проведен детальный анализ элементов L31 двустворчатых моллюсков, что позволило описать структуру, разнообразие, распространение и филогенетическое положение этих элементов в группе ITm. Установлено, что L31-транспозоны являются самостоятельным надсемейством в группе ITm, имеющим древнее происхождение. Внутри клады L31 наблюдается достаточно высокое разнообразие – выделено пять филогенетических кластеров. На данный момент L31-транспозоны у двустворчатых моллюсков выявлены только в подклаcсе Autobranchia с преобладанием по разнообразию и количеству в инфраклассе Pteriomorphia. Показано также, что белок, кодируемый второй открытой рамкой считывания, является неотъемлемым структурным компонентом практически всех полноразмерных элементов L31. Полученные данные способствуют лучшему пониманию эволюции представителей ITm-транспозонов. Дальнейшее изучение L31-транспозонов в других таксонах (стрекающие), а также исследование функции белка, кодируемого второй рамкой считывания, позволит лучше понять эволюцию ДНК-транспозонов, механизмы их горизонтального переноса и вклад в биоразнообразие эукариот.

Стрессовые воздействия могут играть значимую роль в развитии артериальной гипертонии и многих других осложнений сердечно-сосудистых заболеваний. Изучению молекулярных механизмов, вовлеченных в ответ организма на стрессовые воздействия, уделяется значительное внимание, но в понимании деталей этих механизмов все еще остается много белых пятен. Крысы линии НИСАГ моделируют стресс-чувствительную форму артериальной гипертонии. Они характеризуются генетически обусловленной повышенной активностью гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и симпато-адреномедуллярной систем, что предполагает функциональное состояние повышенной стресс-реактивности. Впервые в гипоталамусе взрослых самцов гипертензивных крыс НИСАГ исследована динамика экспрессии гена Fos и некоторых связанных с ним генов после однократного воздействия рестрикционного стресса разной продолжительности (30, 60 и 120 мин). Показана активация транскрипции гена Fos с пиком через 1 ч после начала такого воздействия. Динамика активации гена Fos совпадает с динамикой увеличения артериального давления. В процессе активации нейронов гипоталамуса изменяется уровень транскрипции и других генов, кодирующих транскрипционные факторы (Jun, Nr4a3, Jdp2, Ppargc1a), ассоциированные с развитием кардиоваскулярных заболеваний. Поскольку индукция Fos является маркером активации нейронов мозга, можно заключить, что повышенная стрессовая реактивность гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной и симпатоадреналовой систем гипертензивных крыс НИСАГ при кратковременном рестрикционном стрессе сопровождается активацией нейронов гипоталамуса и повышением уровня артериального давления.

Регуляция активности ретротранспозонов в соматических тканях – сложный процесс, детали которого остаются неизученными. Основным механизмом подавления транспозиции за пределами гонад считается siРНК-интерференция, однако в последнее время появляется все больше сведений, подтверждающих участие системы piРНК-интерференции в контроле активности ретротранcпозонов во время развития соматических тканей, в частности нервной системы. В настоящей работе на модельном объекте Drosophila melanogaster проведен комплексный анализ экспрессии основных генов, участвующих в piРНК-интерференции, в сочетании с изучением экспрессии отдельных ретротранспозонов и кластеров piРНК в генеративных и соматических тканях, включая нервные ткани. Показано, что повышение экспрессии ретротранспозонов при нарушении работы этой системы происходит тканеспецифично. Ведущим фактором в тканеспецифичной регуляции ретротранспозона является не его положение в геноме, а наличие в его последовательности сайтов связывания транскрипционных факторов.

Ранее показано, что ассоциированные со злокачественными опухолями эпигенетические альтерации облегчают туморогенез и индуцируют метастазирование. При изучении механизмов метастазирования обнаружили, что эпигенетика играет решающую роль в уклонении опухоли от распознавания иммунной системой. В результате эпигенетические препараты рассматривают в качестве потенциальных агентов, активирующих противоопухолевый иммунный ответ и “отменяющих” иммунологическую толерантность опухоли. Все больше данных свидетельствует о том, что аберрантная экспрессия молекул, процессирующих антигены главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, MHC) класса I, и их активация ‒ потенциальные индикаторы противоопухолевого иммунитета. В проведенном исследовании продемонстрировано, что эпигенетический препарат трихостатин А (Trichostatin A, TSA), ингибитор гистондеацетилазы, восстанавливает экспрессию генов системы презентации антигенов (antigen presentation machinery, APM) MHC I в клетках рака молочной железы человека (MCF-7). Обработка TSA приводила к усилению экспрессии генов MHC I, B2M и PSMB9 в монослое клеток MCF-7 и MHC I, B2M, PSMB9, PSMB8, TAP1 и TAP2 в сфероидных клетках MCF-7. Интересно, что обработка TSA также увеличивала экспрессию CD274 в этих клетках и усиливала инвазивную способность сфероида MCF-7. Это агрессивное поведение подтверждено повышенной экспрессией генов, ассоциированных с метастазами: SCN5A (белок nNav1.5) и MMP1. Таким образом, под действием TSA в клетках рака молочной железы, с одной стороны, происходит восстановление экспрессии генов APM MHC I, с другой ‒ активируется экспрессия метастатических генов и CD274, что усиливает инвазивную способность клеток. Эти результаты свидетельствуют о необходимости глубокого изучения вопроса о возможности применения эпигенетических препаратов в терапии рака молочной железы.

Недостаточная изученность молекулярных механизмов фиброза и цирроза печени не позволяет полностью понять все этапы развития этих патологий. Известно, что огромную роль в реализации функций генов и сигнальных путей играют взаимодействия между ними. Однако сведения о взаимосвязи генов и сигнальных путей недостаточны и часто противоречивы. В настоящей работе впервые детально изучена экспрессия мРНК генов Notch1, Notch2, Yap1, Tweak (Tnfsf12), Fn14 (Tnfrsf12a), Ang, Vegfa, Cxcl12 (Sdf), Nos2 и Mmp-9 на разных стадиях индуцированного тиоацетамидом фиброза печени крыс Wistar. С помощью факторного анализа получены три фактора, которые объединили высоко коррелирующие гены-мишени между собой. Первый фактор включает четыре гена: Cxcl12 (r = 0.829, р < 0.05), Tweak (r = 0.841, р < 0.05), Notch1 (r = 0.848, р < 0.05), Yap1 (r = 0.921, р < 0.05). Второй фактор описывает корреляции между генами Mmp-9 (r = 0.791, р < 0.05) и Notch2 (r = 0.836, р < 0.05). В третий фактор вошли гены Ang (r = 0.748, р < 0.05) и Vegfa (r = 0.679, р < 0.05). Гены Nos2 и Fn14 не вошли ни в один из факторов. Можно предположить, что продукты выбранных генов, классифицированных на основании уровней экспрессии их мРНК, взаимосвязаны в процессах фиброзных изменений печени крыс токсической этиологии. Полученные результаты представляют фундаментальный интерес для изучения патогенетических механизмов развития фиброза и цирроза печени.

Гаммагерпесвирус-68 мыши (murine gammaherpesvirus 68, MHV68) латентно инфицирует главным образом В-клетки и вызывает у лабораторных мышей лимфому, напоминающую по симптоматике гаммагерпесвирусные заболевания человека. Для изучения молекулярного механизма вирусной инфекции и того, как вирусные детерминанты контролируют клетку и в итоге вызывают онкогенез, необходимы легкодоступные латентно инфицированные клеточные линии. Для in vitro исследований латентности MHV68, как и других гаммагерпесвирусов, доступны только две системы культивирования: созревающие В-клетки и макрофаги. В связи с этим актуальна задача расширения репертуара клеточных линий, латентно инфицированных MHV68. В проведенном исследовании получено несколько клонов линий незрелых В-клеток и макрофагоподобных клеток с латентным фенотипом. Устойчивый к гигромицину рекомбинантный вирус MHV68 был выделен из лабораторной линии латентно инфицированных клеток HE2.1 и размножен под селекцией гигромицина для получения стабильных клеточных линий, несущих вирусный геном. В субклонах этих клеточных линий анализировали экспрессию вирусных микроРНК с помощью количественной ПЦР TaqMan и оценивали экспрессию литического вирусного транскрипта M3. Клеточные линии сохраняли вирусный геном в виде эписомы, что показано с помощью ПЦР-анализа с расщеплением-циркуляризацией. Несмотря на то что полученные латентно инфицированные клеточные линии экспрессировали вирусные микроРНК на уровнях, не превышающих таковые в родительской клеточной линии, их можно рассматривать как альтернативный инструмент для изучения механизмов латенции и идентификации мишеней микроРНК.

Системы CRISPR/Cas являются перспективными молекулярными инструментами для направленных манипуляций с генетическим материалом, включая редактирование генома, регуляцию транскрипции генов, модификацию эпигенома. Несмотря на высокую эффективность и возможность использования систем CRISPR/Cas при различных наследственных, инфекционных и онкологических заболеваниях, отсутствие эффективных методов упаковки и доставки этих систем in vivo препятствует их внедрению в клиническую практику. Современные платформы для доставки генетических конструкций на основе синтетических наночастиц органической и неорганической природы имеют ряд ограничений, а именно низкую эффективность упаковки, иммуногенность, токсичность, отсутствие тропности, сложный и дорогой процесс производства. Экзосомы, секретируемые клетками эукариот, представляют собой биологические наночастицы, которые обладают высочайшей биосовместимостью, физико-химической стабильностью и способностью преодолевать биологические барьеры. Безопасность использования экзосом подтверждена в многочисленных клинических исследованиях. В последние годы экзосомы рассматриваются как перспективные носители для доставки систем CRISPR/Cas in vivo. В представленной работе на различных линиях клеток определена эффективность стохастической упаковки систем CRISPR/Cas в экзосомы. Показано, что белок Cas9 локализуется в компартменте биогенеза экзосом, однако стохастическая упаковка Cas9 в экзосомы обеспечивает попадание белка Cas9 всего в ~1% целевых клеток. Низкая эффективность стохастической упаковки белка Cas9 не позволяет использовать этот метод в генетическом редактировании. Следовательно, необходимы новые методы и технологии загрузки CRISPR/Cas-систем в экзосомы.

Множество вирусов, включая коронавирус-2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), который стал причиной пандемии коронавирусной инфекции (COVID-19), проникает в клетку за счет активируемого протеолитическими ферментами процесса слияния клеточной и вирусной мембран. Как правило, роль протеолитических ферментов в этом случае выполняют протеазы хозяйской клетки. Идентификация активирующих протеаз ‒ задача непростая, но важная для разработки новых противовирусных лекарственных средств. В рамках проведенного исследования мы разработали биоинформатический метод идентификации протеаз, воздействующих на белки оболочки вирусов. Предлагаемый подход включает в себя использование предсказательных моделей субстратной специфичности протеаз человека и применение метода предсказания уязвимости участков белка к протеолизу на основе его трехмерной структуры. Модели специфичности были построены для 169 протеаз человека на основании информации по их известным субстратам. Метод структурного анализа потенциальных сайтов протеолиза был разработан нами ранее и применен в представленной здесь работе совместно с моделями специфичности протеаз. Валидация предлагаемого подхода выполнялась применительно к белку шипа SARS-CoV-2, для которого хорошо изучены сайты протеолиза.

Внеклеточные мембранные везикулы являются важным фактором коммуникации в бактериальных популяциях и при взаимодействии бактерий с хозяином. Везикулы как носители различных регуляторных и сигнальных молекул обусловливают возможность их использования в качестве биомаркеров заболеваний и перспективных терапевтических агентов, в том числе вакцинных препаратов. Состав мембранных везикул расшифрован у ограниченного числа грамотрицательных и грамположительных бактерий. В данной работе впервые выделены, визуализированы и охарактеризованы внеклеточные мембранные везикулы стрептомицинустойчивого штамма Bacillus pumilus 3-19, продуцента внеклеточной гуанилпредпочитающей рибонуклеазы – биназы. Установлено, что в везикулах отсутствует генетический материал, а спектр белков зависит от содержания фосфата в среде культивирования. Везикулы, продуцируемые бактериями, которые росли на среде с дефицитом фосфата, несут 49 уникальных белков, на среде с высоким содержанием фосфата – 101 белок. Оба типа везикул включают 140 общих белков. В везикулах идентифицированы флагеллярные белки, РНКаза J – основной фермент РНК-деградосомы, фосфатазы, пептидазы, транспортеры железа, сигнальные пептиды. Белки антибиотикорезистентности и амилоидоподобные белки, которые присутствуют в клетках B. pumilus 3-19, в везикулах не обнаружены. Биназа, индуцируемая дефицитом фосфата, обнаружена только в составе везикул, полученных на среде с дефицитом фосфата.