Том 59, № 3 (2025)

В современном мире устойчивость к антибиотикам рассматривается как одна из наиболее серьезных угроз здоровью и продовольственной безопасности человечества. Поиск новых путей предупреждения и преодоления формирования устойчивости возбудителей к антибиотикам представляет чрезвычайно важную и актуальную задачу современной медицинской науки. Все бактерии, за исключением микоплазм, имеют клеточную стенку, в которой локализуются различные ферменты, рецепторы, белки-транспортеры, каналы и антигены. Настоящий обзор посвящен строению основных элементов бактериальных клеточных стенок и ферментов, участвующих в их биосинтезе и используемых в качестве молекулярных мишеней для скрининга и отбора новых селективных антибиотиков. Отдельное внимание уделено методам изучения функциональной активности и ингибирования этих мишеней. Кроме того, описаны функциональные характеристики порообразующих белков наружной мембраны грамотрицательных бактерий и молекулярные механизмы проникновения антибиотиков через пориновые каналы. Анализ структуры и функциональных особенностей мишеней разных классов антибиотиков является основой для выработки новых стратегий преодоления бактериальной резистентности.

Этиология транссексуализма остается неустановленной, поскольку это многофакторное заболевание обусловлено комплексом причин, одной из которых может быть половая дифференцировка тканей головного мозга в процессе внутриутробного развития. Показано, что половая дифференцировка мозга происходит на гораздо более поздней стадии развития, чем дифференцировка гениталий, причем эти два процесса регулируются независимо друг от друга. Различные половые особенности, такие как гендерная идентичность (идентификация себя в мужской или женской роли), сексуальная ориентация (гетеросексуальность, гомосексуальность или бисексуальность), а также риски развития нервно-психических расстройств запрограммированы в мозге на раннем этапе развития. Установлено, что строение некоторых участков мозга у лиц с транссексуализмом отличается от строения соответствующих участков мозга у цисгендерных мужчин и женщин и приближается (хотя и не идентично) к строению этих участков у лиц противоположного анатомического и генетического пола. В результате воздействий физиологически активных веществ в развивающемся мозге происходит необратимая или частично обратимая модификация его нейрохимических систем. Семейные исследования подтвердили роль генетических факторов в нарушении половой идентификации. В обзоре проведен подробный анализ известных локусов генов-кандидатов, предположительно ассоциированных с транссексуализмом. Выявлены как положительные, так и отрицательные корреляции большинства генов-кандидатов с транссексуализмом, в то время как у некоторых других маркеров выявлены только отрицательные корреляции. Противоречивость результатов исследований может быть связана с такими факторами, как “размытость” выборок транссексуалов, выбор нейтральных маркеров, не имеющих функционально значимых полиморфизмов, влияющих на экспрессию или функциональную активность белковых продуктов данных генов и т. д. Представлены современные данные по проблеме транссексуализма; обозначены перспективы изучения этого феномена на генетическом уровне с целью применения на практике в процессе верификации диагноза.

Детальные механизмы патогенеза инфекций, вызванных вирусом клещевого энцефалита, несмотря на активное изучение, до сих пор остаются не полностью раскрытыми. В последнее время пристальное внимание привлекают внеклеточные везикулы, особенно везикулы малого размера, которые, как оказалось, играют важную роль в патогенезе многих вирусных инфекций. В представленной работе изучено влияние экспрессии неструктурного белка 1 (NS1) вируса клещевого энцефалита на выделение внеклеточных везикул клетками, а также оценена возможность влияния этих везикул на другие клетки. Обнаружено, что экспрессия вирусного NS1 приводит к повышению выделения клетками НЕК293Т внеклеточных везикул; изменений в профиле размеров выделяемых везикул при этом не обнаружено. Кроме того, NS1 детектируется во фракциях везикул как крупного, так и малого размера. Обнаружено, что NS1 вируса клещевого энцефалита находится не внутри везикул, а ассоциирован с их внешней поверхностью. Везикулы малого размера, полученные из среды культивирования клеток НЕК293Т, экспрессирующих NS1, способны вызывать повышение содержания мРНК и секреции интерлейкина-1бета (IL-1β) в клетках нейробластомы человека SHSY5Y. Полученные результаты, указывающие на участие белка NS1 и везикул в развитии нейровоспаления, важны для понимания молекулярных механизмов патогенеза клещевого энцефалита.

Инфекция, вызванная вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ), может привести к тяжелым неврологическим осложнениям, в значительной степени связанным с активацией врожденного иммунитета и воспалительных реакций в тканях нервной системы. В связи с этим ведется изучение факторов, в том числе вирусных, влияющих на эти процессы. Нами проанализирована возможная роль неструктурного белка 1 (NS1) ВКЭ в активации реакций врожденного иммунного ответа в клетках нервной системы. Клетки нейробластомы SH-SY5Y и глиобластомы DBTRG-05MG трансфицировали плазмидой, кодирующей NS1, или обрабатывали внеклеточными везикулами NS1-экспрессирующих клеток HEK293T и затем стимулировали полиинозин-полицитидиловой кислотой [poly(I:C)] для активации врожденного иммунного ответа. Обнаружено, что стимуляция poly(I:C) клеток SH-SY5Y, экспрессирующих NS1, приводит к более низким уровням мРНК провоспалительных цитокинов: интерлейкина-1β (IL-1β) и фактора некроза опухолей-α (TNF-α), – а также цитокина врожденного иммунного ответа интерферона-β (IFN-β) и продукта интерферонстимулируемого гена 15 (ISG15), по сравнению со стимулированными клетками без экспрессии NS1. Кроме того, в этих клетках была снижена транскрипция гена сенсора MDA5, отвечающего за активацию транскрипции генов этих цитокинов. В экспрессирующих NS1 стимулированных клетках DBTRG-05MG было снижено содержание мРНК только IL-1β. Обработка клеток SH-SY5Y внеклеточными везикулами из NS1-экспрессирующих клеток с последующей стимуляцией poly(I:C) приводила к повышенным уровням мРНК IL-6, TNF-α и IFN-β, по сравнению со стимулированными клетками, обработанными везикулами из не экспрессирующих NS1 клеток. В клетках DBTRG-05MG при аналогичной обработке различий не обнаружено. На основании полученных данных можно предполагать двоякую роль NS1 ВКЭ в формировании нейровоспаления при инфекции и рассматривать этот белок в качестве потенциальной терапевтической мишени.

Транскрипционные циклинзависимые киназы CDK8 и CDK19 — ферментативные компоненты Медиаторного комплекса. Предполагается, что CDK19, которая является минорным паралогом CDK8, может в некоторых ситуациях компенсировать отсутствие CDK8, в то время как свидетельства уникальных функций обеих киназ остаются единичными. Подавляющее большинство информации о роли и механизмах действия этих белков получено в экспериментах с использованием культур опухолевых клеток, что может давать нерелевантные результаты в силу накопленных опухолевыми клетками изменений. В связи с этим нами впервые получены мыши (Cdk8^fl/fl/Cdk19^–/–/Rosa26/Cre/ER^T2) с индуцируемым нокаутом Cdk8 на фоне конститутивного нокаута Cdk19 для изучения их совместной роли в целом организме и в первичных клетках. С использованием таких мышей получены эмбриональные фибробласты, нокаут в которых мог индуцироваться 4-гидрокситамоксифеном. Обнаружено, что, в отличие от большинства опухолевых клеток, эмбриональные фибробласты чувствительны к ингибированию и нокауту CDK8/19 — при ингибировании этих киназ значительная часть клеток гибнет за 5 дней, а в случае нокаута скорость их пролиферации падает. Секвенирование РНК из эмбриональных фибробластов с нокаутом Cdk8/Cdk19 выявило изменения в сигнальном пути Wnt, в цитокиновом ответе и в дифференцировке остеокластов. Сниженной оказалась также экспрессия генов, связанных со стероидогенезом, обнаруженная нами ранее. Впервые описаны изменения, связанные с цитоскелетом, адипогенной и остеогенной дифференцировкой, клеточной адгезией, формированием внеклеточного матрикса и биогенезом митохондрий. При изучении ответа эмбриональных фибробластов на стресс мы обнаружили, что ответ на повреждение ДНК, вызванное рентгеновским излучением, и на стимуляцию сывороткой после голодания также опосредован CDK8/19 и значительно снижен в клетках с нокаутом Cdk8/Cdk19.

Микрочипы с иммобилизованными белковыми зондами используются в анализе белковых проб. Ключевыми задачами технологии биочипов являются подбор материалов для изготовления биочипов, функционализация поверхности носителя, получение упорядоченных матриц ячеек, иммобилизация белковых молекулярных зондов в ячейках, достижение высокой чувствительности анализа белковых проб. Белковые зонды для сохранения их аффинных свойств иммобилизовали в ячейках биочипов в “мягких” условиях. Для достижения высокой концентрации и пространственной доступности зонды иммобилизовали в трехмерных ячейках, получаемых из динамически подвижных щеточных полимеров, закрепленных на подложке только одним концом. Матрицу ячеек получали на поверхности подложки методом фотоиндуцированной радикальной полимеризации мономеров с реактивными химическими группами в соответствии с шаблоном фотомаски. Проведен сравнительный анализ полимерных щеточных структур, полученных на подложке из полибутилентерефталата методом фотоиндуцированной радикальной полимеризации. Эти структуры состояли из звеньев одного или нескольких мономеров. Исследовали влияние способа активации реактивных групп на полимерных цепях на эффективность иммобилизации в ячейках молекулярных белковых зондов, а также состава акрилатных мономеров, из которых получали ячейки, на специфическое связывание ответных белков с белковыми зондами, иммобилизованными в ячейках биочипов. Разработан новый метод изготовления биочипов. Подложки из фотонеактивного полибутилентерефталата покрывали тонким слоем фотоактивного полимера поливинилацетата. Ячейки, которые получали фотополимеризацией мономеров на модифицированной подложке, не разрушаются и не отслаиваются от поверхности в водных растворах. Подложки, покрытые поливинилацетатом, не адсорбируют белки. В качестве моделей белковых зондов использовали стрептавидин и иммуноглобулины человека, а в качестве ответных белков — биотинилированные иммуноглобулины козы и антитела козы против иммуноглобулинов человека. Установлено, что полимеры с нерегулярной структурой способствуют более высокой концентрации белковых зондов и их равномерному распределению внутри ячеек, что положительно влияет на эффективность специфического связывания с ответными белками. Биочипы с ячейками из щеточных полимеров на подложке из черного полибутилентерефталата представляют интерес для дальнейшего совершенствования с целью использования в иммунофлуоресцентном анализе белковых мишеней для развития технологий микроанализа “лаборатория на чипе”.