Применение qPCR для оценки эффективности удаления объемных повреждений ДНК в экстрактах клеток млекопитающих с различной максимальной продолжительностью жизни

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Белки системы эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) ответственны за обнаружение и удаление из ДНК широкого спектра объемных повреждений, благодаря чему вносят заметный вклад в поддержание стабильности генома в клетках млекопитающих. Диагностика функционального статуса NER в клетках имеет важное значение для выявления патологических изменений в организме и оценки эффективности применения химиотерапевтических препаратов. В работе представлено описание способа оценки эффективности удаления объемных повреждений ДНК in vitro, основанного на использовании qPCR. С помощью разработанного метода проведена сравнительная оценка активности NER на экстрактах клеток двух млекопитающих с различной продолжительностью жизни – долгоживущего голого землекопа (Heterocephalus glaber) и короткоживущей мыши (Mus musculus). Было показано, что белки экстракта клеток H. glaber в 1,5 раза более эффективно удаляют объемное повреждение из модельного ДНК-субстрата, чем белки экстракта клеток M. musculus, что согласуется с экспериментальными данными, полученными ранее. Представленная разработка может найти применение не только в фундаментальных исследованиях репарации ДНК в клетках млекопитающих, но и в клинической практике.

Ключевые слова

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

А. А. Попов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

В. А. Шаманин

ООО «БиоЛинк»

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

И. О. Петрусева

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

А. Н. Евдокимов

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск

О. И. Лаврик

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН; Новосибирский национальный исследовательский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: lavrik@niboch.nsc.ru
Россия, Новосибирск; Новосибирск

Список литературы

  1. Chatterjee, N., and Walker, G. C. (2017) Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis, Environ. Mol. Mutagen., 58, 235-263, https://doi.org/10.1002/em.22087.
  2. Krasikova, Y., Rechkunova, N., and Lavrik, O. (2021) Nucleotide excision repair: from molecular defects to neurological abnormalities, Int. J. Mol. Sci., 22, 6220, https://doi.org/10.3390/ijms22126220.
  3. Paccosi, E., Balajee, A. S., and Proietti-De-Santis, L. (2022) A matter of delicate balance: loss and gain of Cockayne syndrome proteins in premature aging and cancer, Front. Aging, 3, 960662, https://doi.org/10.3389/fragi.2022.960662.
  4. Yurchenko, A. A., Rajabi, F., Braz-Petta, T., Fassihi, H., Lehmann, A., Nishigori, C., Wang, J., Padioleau, I., Gunbin, K., Panunzi, L., Morice-Picard, F., Laplante, P., Robert, C., Kannouche, P. L., Menck, C. F. M., Sarasin, A., and Nikolaev, S. I. (2023) Genomic mutation landscape of skin cancers from DNA repair-deficient xeroderma pigmentosum patients, Nat. Commun., 14, 2561, https://doi.org/10.1038/s41467-023-38311-0.
  5. Kap, E. J., Popanda, O., and Chang-Claude, J. (2016) Nucleotide excision repair and response and survival to chemotherapy in colorectal cancer patients, Pharmacogenomics, 17, 755-794, https://doi.org/10.2217/pgs-2015-0017.
  6. Bowden, N. A. (2014) Nucleotide excision repair: why is it not used to predict response to platinum-based chemotherapy? Cancer Lett., 346, 163-171, https://doi.org/10.1016/j.canlet.2014.01.005.
  7. Kiwerska, K., and Szyfter, K. (2019) DNA repair in cancer initiation, progression, and therapy-a double-edged sword, J. Appl. Genet., 60, 329-334, https://doi.org/10.1007/s13353-019-00516-9.
  8. Evdokimov, A., Petruseva, I., Tsidulko, A., Koroleva, L., Serpokrylova, I., Silnikov, V., and Lavrik, O. (2013) New synthetic substrates of mammalian nucleotide excision repair system, Nucleic Acids Res., 41, e123, https:// doi.org/10.1093/nar/gkt301.
  9. Liu, Z., Ding, S., Kropachev, K., Lei, J., Amin, S., Broyde, S., and Geacintov, N. E. (2015) Resistance to nucleotide excision repair of bulky guanine adducts opposite abasic sites in DNA duplexes and relationships between structure and function, PLoS One, 10, e0142068, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0137124.
  10. Lukyanchikova, N. V., Petruseva, I. O., Evdokimov, A. N., Silnikov, V. N., and Lavrik, O. I. (2016) DNA with damage in both strands as affinity probes and nucleotide excision repair substrates, Biochemistry (Moscow), 81, 263-274, https://doi.org/10.1134/S0006297916030093.
  11. Naumenko, N., Petruseva, I., Lomzov, A., and Lavrik, O. (2021) Recognition and removal of clustered DNA lesions via nucleotide excision repair, DNA Repair (Amst), 108, 103225, https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2021.103225.
  12. Chesner, L. N., and Campbell, C. (2018) A quantitative PCR-based assay reveals that nucleotide excision repair plays a predominant role in the removal of DNA-protein crosslinks from plasmids transfected into mammalian cells, DNA Repair (Amst), 62, 18-27, https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2018.01.004.
  13. Shen, J. C., Fox, E. J., Ahn, E. H., and Loeb, L. A. (2014) A rapid assay for measuring nucleotide excision repair by oligonucleotide retrieval, Sci. Rep., 4, 1-10, https://doi.org/10.1038/srep04894.
  14. Evdokimov, A., Kutuzov, M., Petruseva, I., Lukjanchikova, N., Kashina, E., Kolova, E., Zemerova, T., Romanenko, S., Perelman, P., Prokopov, D., Seluanov, A., Gorbunova, V., Graphodatsky, A., Trifonov, V., Khodyreva, S., and Lavrik, O. (2018) Naked mole rat cells display more efficient excision repair than mouse cells, Aging (Albany NY), 10, 1454-1473, https://doi.org/10.18632/aging.101482.
  15. Reardon, J. T., and Sancar, A. (2006) Purification and characterization of Escherichia coli and human nucleotide excision repair enzyme systems, Methods Enzymol., 408, 189-213, https://doi.org/10.1016/S0076-6879(06)08012-8.
  16. Clavé, G., Reverte, M., Vasseur, J. J., and Smietana, M. (2020) Modified internucleoside linkages for nuclease-resistant oligonucleotides, RSC Chem. Biol., 2, 94-150, https://doi.org/10.1039/d0cb00136h.
  17. Smith, C. A., Baeten, J., and Taylor, J. S. (1998) The ability of a variety of polymerases to synthesize past site-specific cis-syn, trans-syn-II, (6-4), and Dewar photoproducts of thymidylyl-(3′→5′)-thymidine, J. Biol. Chem., 273, 34, 21933-21940, https://doi.org/10.1074/jbc.273.34.21933.
  18. Taylor, J. S. (2002) New structural and mechanistic insight into the A-rule and the instructional and non-instructional behavior of DNA photoproducts and other lesions, Mutat. Res., 510, 55-70, https://doi.org/ 10.1016/s0027-5107(02)00252-x.
  19. Khare, V., and Eckert, K. A. (2002) The proofreading 3′→5′ exonuclease activity of DNA polymerases: a kinetic barrier to translesion DNA synthesis, Mutat. Res., 510, 45-54, https://doi.org/10.1016/s0027-5107(02)00251-8.
  20. Obeid, S., Schnur, A., Gloeckner, C., Blatter, N., Welte, W., Diederichs, K., and Marx, A. (2011) Learning from directed evolution: Thermus aquaticus DNA polymerase mutants with translesion synthesis activity, Chembiochem., 12, 1574-1580, https://doi.org/10.1002/cbic.201000783.
  21. Evdokimov, A., Popov, A., Ryabchikova, E., Koval, O., Romanenko, S., Trifonov, V., Petruseva, I., Lavrik, I., and Lavrik, O. (2021) Uncovering molecular mechanisms of regulated cell death in the naked mole rat, Aging (Albany NY), 13, 3239-3253, https://doi.org/10.18632/aging.202577.
  22. Yamamura, Y., Kawamura, Y., Oka, K., and Miura, K. (2022) Carcinogenesis resistance in the longest-lived rodent, the naked mole-rat, Cancer Sci., 113, 4030-4036, https://doi.org/10.1111/cas.15570.
  23. Boughey, H., Jurga, M., and El-Khamisy, S. F. (2021) DNA homeostasis and senescence: lessons from the naked mole rat, Int. J. Mol. Sci., 22, 11, 6011, https://doi.org/10.3390/ijms22116011.
  24. Hadj-Moussa, H., Eaton, L., Cheng, H., Pamenter, M. E., and Storey, K. B. (2022) Naked mole-rats resist the accumulation of hypoxia-induced oxidative damage, Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol., 273, 111282, https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2022.111282.
  25. Buffenstein R. (2005) The naked mole-rat: a new long-living model for human aging research, J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci., 60, 1369-1377, https://doi.org/10.1093/gerona/60.11.1369.
  26. Gorbunova, V., Seluanov, A., Zhang, Z., Gladyshev, V. N., and Vijg, J. (2014) Comparative genetics of longevity and cancer: insights from long-lived rodents, Nat. Rev. Genet., 15, 531-540, https://doi.org/10.1038/nrg3728.
  27. MacRae, S. L., Croken, M. M., Calder, R. B., Aliper, A., Milholland, B., White, R. R., Zhavoronkov, A., Gladyshev, V. N., Seluanov, A., Gorbunova, V., Zhang, Z. D., and Vijg, J. (2015) DNA repair in species with extreme lifespan differences, Aging (Albany NY), 7, 1171-1184, https://doi.org/10.18632/aging.100866.
  28. Gautam, A., Fawcett, H., Burdova, K., Brazina, J., and Caldecott, K. W. (2023) APE1-dependent base excision repair of DNA photodimers in human cells, Mol. Cell, 83, 3669-3678.e7, https://doi.org/10.1016/j.molcel.2023.09.013.
  29. Saha, L. K., Wakasugi, M., Akter, S., Prasad, R., Wilson, S. H., Shimizu, N., Sasanuma, H., Huang, S. N., Agama, K., Pommier, Y., Matsunaga, T., Hirota, K., Iwai, S., Nakazawa, Y., Ogi, T., and Takeda, S. (2020) Topoisomerase I-driven repair of UV-induced damage in NER-deficient cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 117, 14412-14420, https:// doi.org/10.1073/pnas.1920165117.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Химические структуры nFlu (а) и TEG (б)

Скачать (77KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Схематическое изображение предлагаемого подхода для оценки эффективности удаления объемных повреждений in vitro с помощью qPCR

Скачать (258KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Анализ результатов амплификации nFlu/TEG- и nm/TEG-ДНК. Представлены кривые амплификации стандартных образцов nm/TEG-ДНК (а), калибровочный график (б) и результаты расчета эффективности амплификации nm/TEG-ДНК (в). г – Пример кривых амплификации nm/TEG- и nFlu/TEG-ДНК; д – средние значения С(t) и стандартное отклонение для nm/TEG- и nFlu/TEG-ДНК, полученные по результатам трех измерений; е – кривые плавления продуктов амплификации nm/TEG- и nFlu/TEG-ДНК

Скачать (382KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Сравнительная оценка эффективности репарации nFlu/TEG-ДНК белками экстракта клеток Heterocephalus glaber и Mus musculus с помощью qPCR. Кривые амплификации nm/TEG-ДНК (фиолетовый цвет), nFlu/TEG-ДНК (зеленый цвет) и nFlu/TEG-ДНК после 30 мин инкубации с белками экстракта (темно-зеленый цвет), полученные для H. glaber (а) и M. musculus (б); в – сравнение эффективности репарации nFlu/TEG-ДНК белками NER экстракта клеток H. glaber (синий цвет) и M. musculus (красный цвет) в зависимости от времени инкубации; г – диаграмма, демонстрирующая различия в эффективности репарации nFlu/TEG-ДНК белками экстракта H. glaber (синий цвет) и M. musculus (красный цвет) после 30 мин инкубации; д – оценка воздействия белков экстрактов клеток H. glaber и M. musculus на nm/TEG-ДНК, не содержащей объемного повреждения, после 30 мин инкубации; е – пример кривых плавления продуктов амплификации nm/TEG-ДНК (фиолетовый цвет), nFlu/TEG-ДНК (зеленый цвет) и nFlu/TEG-ДНК после 30 мин инкубации с белками NER (темно-зеленый цвет) экстракта клеток M. musculus. Представлены результаты трех биологических повторов со стандартным отклонением, *** p < 0,001

Скачать (456KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024