Engineering recombinant proteins: from structure to function and biological activity

全文:

Становление и развитие белковой инженерии – относительно новой отрасли науки и технологии – происходило у нас на глазах. Число работ, в которых применяются подходы белковой инженерии, стремительно растёт. Если ввести термин “protein engineering” в поисковую строку базы данных NCBI, получим свыше 30 000 результатов. Очевидно, в коротком обзоре невозможно охватить всё разнообразие этих работ.

В нашей стране очень много лабораторий, в которых ведутся исследования в области белковой инженерии, – они есть практически в каждом институте направления физико-химической биологии. Это и ИБХ РАН, и Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, и Институт биологии гена РАН, Институт белка РАН и многие-многие другие. Я остановлюсь на одном направлении, которое мне особенно близко и, на мой взгляд, наиболее интересно – получении новых белков или “белков de novo”, о важности которого свидетельствует Нобелевская премия 2024 г. по химии – я имею в виду работы Д. Бейкера.

Белковая инженерия включает в себя два возможных подхода к получению новых белков – рациональный дизайн и направленную эволюцию. В первом случае конструирование белка опирается на знание его структурно-функциональных свойств, во втором – идёт случайный мутагенез с последующим отбором нужных вариантов. Сочетание этих подходов позволяет эффективно получать новые белки с заданными свойствами.

Современная белковая инженерия может очень многое: это и изменение каталитических свойств ферментов, и изменение структурных свойств белков и их функциональных свойств, в том числе, улучшение эффективности белковых лекарственных препаратов. Наконец, это создание совершенно новых белков, или “белков de novo”, – направление, которое прямо связано, если говорить в современных терминах, с синтетической биологией биомолекулярных систем. Именно о нём здесь и пойдёт речь.

В этих исследованиях особенно ярко проявляется уровень наших знаний о принципах формирования структуры белковых молекул: если правильно понимать эти принципы, можно создавать белки, обладающие заданной структурой. Задача конструирования таких белков была поставлена на самых ранних этапах развития белковой инженерии. Вначале исследователи пробовали повторять небольшие простые структуры, имеющиеся в природных белках. То есть задачей было придумать такую аминокислотную последовательность белка (первичную структуру), которая приобретёт требуемую вторичную структуру и свернётся в заданную пространственную. Первая успешная работа в этом направлении была выполнена Л. Риган и В. ДеГрадо, которые получили белок de novo – тетраспиральный комплекс, состоящий из 4 спиралей, образующих гидрофобное ядро. Получить заданную вторичную структуру было достаточно легко, расположив в соответствующих позициях альфа-образующие аминокислотные остатки и задав расположение перетяжек, а вот обеспечить правильное пространственное расположение спиралей удалось не сразу. Пришлось разбить аминокислотную последовательность на две части, состоящие из двух спиралей (своего рода “шпилька”, одна сторона которой гидрофобная, а другая гидрофильная), закристаллизовать их, посмотреть, как они укладываются в пространстве, и на основе этого подобрать правильное расположение перетяжки между шпильками. Подобные конструкции на основе природных белков были позднее получены в нескольких лабораториях. Однако более амбициозной задачей было попытаться получить пространственную структуру с такой топологией, которая не наблюдается в природных белках, но не противоречит известным принципам формирования пространственных структур белков.

Первая такая структура, показанная на рисунке 1, была предложена, получена и исследована в нашей работе в “Докладах Академии наук” [1]. Этот белок мы назвали альбебетином, так как он состоит из двух повторяющихся элементов альфа-бета-бета. Дизайн этого белка был разработан под руководством О.Б. Птицына, выдающегося учёного, к сожалению, рано ушедшего из жизни.

 

Рис. 1. Заданная пространственная структура искусственного белка альбебетина

 

Дизайн альбебетина включал следующее: использование α- и β-образующих аминокислотных остатков – Leu для α-спиралей (в положениях i, i+3, i+4, i+7) и Val для β-участков (в положениях i, i+2, i+4); введение разноимённых зарядов на концы α-спиралей (Glu и Asp на N- и Arg на C-конец) для их стабилизации; введение гидрофильных заряженных остатков в крайние β-участки для правильного взаимного расположения β-участков; использование перетяжек минимальной длины между α- и β-участками для предотвращения образования других пространственных структур; использование в перетяжках Pro и Gly, разрушающих α- и β-структуру. Благодаря такому дизайну заданная структура альбебетина, включающая взаимное расположение регулярных элементов и петлевых участков (топология), стала энергетически более выгодной, чем другие возможные топологии. Был синтезирован соответствующий ген, после чего альбебетин удалось наработать в микрограммовых количествах в бесклеточной системе экспрессии, а затем уже в препаративных количествах в E.coli.

Исследование альбебетина различными физико-химическими методами показало, что он компактен, стабилен к разворачиванию мочевиной, обладает заданной вторичной структурой и динамикой расщепления трипсином, соответствующей заданной пространственной структуре. В то же время его структура обладает значительной подвижностью, она лабильна, поэтому альбебетин находится в состоянии, которое в природных белках называется состоянием расплавленной глобулы.

Здесь я немного остановлюсь на свойствах этого состояния, тем более что оно было впервые в мире обнаружено и описано в наших работах по альфа-лактальбумину и карбоангидразе. Это состояние наблюдается в присутствии слабоденатурирующих агентов или даже в нативных или близких к нативным условиях, а также во многих белках как промежуточная фаза при их сворачивании. Иначе говоря, это состояние обычно для многих белков и, как мы показали в своей недавней работе в журнале “Molecules” [2], является, скорее, правилом, чем исключением. Сейчас для белков (или их фрагментов), находящихся в этом состоянии, широко используется термин “natively unfolded” или “intrinsically disordered”. Такие белки могут приобретать жёсткую структуру при взаимодействии с другими макромолекулами. Поэтому тот факт, что альбебетин находится в состоянии расплавленной глобулы, не помешал нам попробовать получить на основе этого белка с заданной пространственной структурой искусственные белки с заданной биологической активностью.

Вначале мы получили альбеферон – искусственный белок с некоторой модельной активностью, добавив на N-конец альбебетина фрагмент интерферона альфа-2 (рис. 2а) и показали, что такой белок в полной мере обладает этой заданной модельной активностью – эффективно направляет бласт-трансформацию тимоцитов мыши. Таким образом, альбеферон стал первым в мире искусственным белком, на который была привита биологическая активность. Логическим развитием этих работ стало получение подобным образом ряда искусственных белков, обладающих заданной биологической активностью, представляющей медицинский интерес, – противораковой, инсулин-подобной и противовирусной (рис. 2, б–д). При этом в одном случае активность была опосредована не линейным фрагментом, а пространственно-организованным центром интерферона, который моделировался двумя разнесёнными по первичной структуре участками белковой цепи (рис. 2г).

 

Рис. 2. Искусственные белки на основе альбебетина с заданными биологическими активностями: А – бласт-трансформирующая активность (альбеферон), Б – противораковая активность, В – инсулин-подобная активность, Г и Д – противовирусная активность

 

Перейдём от этих первых работ по белкам de novo к современным исследованиям в рамках этого направления, за которые была присуждена Нобелевская премия по химии 2024 г. Д. Бейкеру. Единственная работа, прямо упомянутая в пресс-релизе Нобелевского комитета, – получение искусственного белка Top7 с заданной структурой, не встречающейся в природных белках (рис. 3). Структура отличается от нашего альбебетина наличием ещё одного бета-стрэнда. Бейкер и его сотрудники использовали при конструировании Top7 разработанную ими программу Rosetta, которая позволяет с высокой точностью рассчитывать энергетические параметры белков, анализировать различные варианты возможных мутаций и таким образом находить оптимальные варианты последовательностей. Они смогли закристаллизовать Top7 и получить точную структуру этого белка, которая, как было показано, соответствует заданной [3]. Но, конечно, Нобелевская премия была получена не только за Top7, а за создание компьютерной платформы Rosetta, позволившей учёным проводить многие подобные работы. Только за последние два года в ведущих журналах опубликованы работы по белкам de novo с различными пространственными структурами – это и альфа-структурные белки, и бета-белки, и альфа/бета белки, и бета-бочонки, которые не обнаружены в природных белках.

 

Рис. 3. Из пресс-релиза Нобелевского комитета о присуждении Нобелевской премии по химии 2024 года Дэвиду Бейкеру. Внизу – структура искусственного белка Тор7 (слева) и альбебетина (справа)

 

Чтобы наглядно показать, насколько возрастают возможности белковой инженерии с появлением компьютерных методов, я хочу привести пример антител, точнее, антителомиметиков. Инженерия антител – это наиболее коммерциализированная область белковой инженерии. Очень многие фирмы и лаборатории активно ведут работы в данной области: только в нашей небольшой лаборатории за последние годы получены десятки антител против самых различных антигенов. Но если мы говорим о возможностях направленной доставки эффекторных молекул, то вместо антител лучше использовать малые белки/полипептиды – скаффолды, обладающие свойством связываться с антигенами. В ИБХ РАН подобные работы ведут в лабораториях С.М. Деева, А.Г. Габибова, нашей лаборатории и других. Скаффолды, как правило, основаны на природных белках, структура которых может быть похожа на иммуноглобулиновую. Однако использование других, неприродных, скафффолдов, открывает совершенно новые возможности для белковых инженеров. Так, Д. Бейкер и его коллеги с помощью разработанной ими платформы Rosetta рассмотрели сотни подобных мини-белковых конформаций, рассчитали более 20 000 последовательностей и показали, что лучшие из них – а лучших десятки – связываются с двумя антигенами с наномолярными константами. Были синтезированы и исследованы 14 самых лучших вариантов и показано, что они стабильны, не теряют активности после нагревания до 70^оС или выше, в экспериментах на мышах обладают протективной активностью и неиммуногенны [4]. Можно упомянуть также работу этого года В. ДеГрадо, где с помощью Rosetta проанализированы 75 000 вариантов пептидов, которые, по замыслу, должны связывать амилоиды альфа-синуклеина; в результате найден вариант, который делает это очень эффективно, различая даже конформеры амилоидов [5].

Нельзя не упомянуть ещё одно событие, имеющее прямое отношение к белковой инженерии. Это успешное применение искусственного интеллекта для определения пространственной структуры белков по первичной структуре – я имею в виду платформу AlphaFold [6]. Вторая половина Нобелевской премии 2024 г. была присуждена сотрудникам компании Google DeepMind Д. Хассабису и Д. Джамперу за использование искусственного интеллекта в данной области. Как сказано в пресс-релизе Нобелевского комитета, они “взломали код белков”. Решена задача, поставленная 50 лет назад: как из первичной структуры белка получить его пространственную структуру. Это действительно достижение нобелевского масштаба: исследователи, занимающиеся белками, получили мощный инструмент, который позволяет вывести работы по физико-химии белков на качественно новый уровень.

Однако означает ли это, что определение структурно-функциональных отношений в белках и белковая инженерия перешли в статус чисто технологических задач? И да, и нет. Очевидно, что эффективное применение искусственного интеллекта стало возможным только после того, как в базах данных было накоплено огромное количество экспериментальных данных о белковых структурах, на основе которых работают методы машинного обучения – до этого такие подходы были если не невозможны, то существенно менее эффективны. В недавней работе А.В. Финкельштейна и Д.Н. Иванкова в “Journal of Molecular Biology” показано, что при меньшем количестве известных белковых структур точность предсказания падает, и это неудивительно, так как фактически искусственный интеллект предсказывает пространственную структуру белков на основе гомологии с уже имеющимися структурами [7]. Если задать вопрос о том, насколько эти подходы учитывают физические законы формирования белковых структур, ответ очевиден: искусственному интеллекту не нужно знать физические законы – он решает задачу распознавания образов по известным шаблонам. И если в какой-то необычной группе белков число её элементов пока относительно невелико, задача отнесения к этой группе новых белков вряд ли может быть решена такими методами. В работе Д. Чакраварти и Л.Л. Портера [8] показано, что если взять три группы белков, а именно, белки, обладающие единственной нативной структурой, белки, могущие менять структуру в зависимости от условий, и белки неструктурированные, то есть белки/фрагменты белков в состоянии расплавленной глобулы, то, как и следовало ожидать, хуже всего предсказываются структуры последних. Но это нисколько не умаляет того вклада, который обеспечило применение искусственного интеллекта, вклада, который важен для всех исследователей, занимающихся белками.

Хотелось бы вспомнить один забавный эпизод, связанный с программой AlphaFold. Программа сейчас очень популярна, и года полтора назад к нам обратился молодой исследователь, использующий AlphaFold2, который прочитал нашу первую статью по альбебетину, взял его аминокислотную последовательность, ввёл в программу и с удивлением увидел, что AlphaFold выдал пространственную структуру искусственного белка, соответствующую заданной. Он не знал, что мы уже получили и исследовали альбебетин и экспериментально подтвердили заданную структуру, поэтому предложил экспрессировать и исследовать наш белок. Мы рассказали ему, что это уже сделано и предложили какие-то другие варианты сотрудничества. К сожалению, его интерес заметно угас, но нам всё равно было приятно, что наши первые работы находят подтверждение в современных методах – значит, мы выбрали правильное направление.

В заключение хочу ещё раз подчеркнуть, что белковая инженерия, зародившаяся сорок лет тому назад, прошла большой путь от первых работ по мутагенезу природных и созданию простых искусственных белков до использования современных компьютерных программ, позволяющих решать комплексные задачи по созданию сложных белков с заданными полезными свойствами для нужд человека. Мощные компьютерные платформы, в которых используются методы машинного обучения и искусственный интеллект, в последнее время находят самое широкое применение, поднимают белковую инженерию на совершенно новый уровень, и Нобелевская премия по химии 2024 г. свидетельствует о признании выдающегося прогресса в этой научной области.

作者简介

D. Dolgikh

Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; Lomonosov Moscow State University

编辑信件的主要联系方式.
Email: dolgikh@nmr.ru

доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории инженерии белка ИБХ РАН, профессор кафедры биоинженерии биофака МГУ

俄罗斯联邦, Moscow; Moscow

参考

补充文件