Synergid activity of lysozyme and carnosine with antimicrobial drugs in relation to Klebsiella pneumoniae

Full Text

В последнее время в России и мире заметно возрастает количество случаев бактериальных пневмоний [1, 2], которые на протяжении уже более 100 лет ассоциируются с культурами Klebsiella pneumoniae. Клебсиеллы – широко распространённые в природе условно-патогенные микроорганизмы, колонизирующие желудочно-кишечный тракт человека [3]. Со слизистой оболочки ослабленного организма бактерии могут распространяться в различные ткани и системы, становясь причиной развития серьёзных инфекций, прежде всего пневмоний [1, 4]. По данным Всемирной организации здравоохранения, клебсиеллы представляют угрозу для жизни и здоровья населения, что стало актуальной проблемой современной медицины [4].

Появляется всё больше работ, где обсуждается распространение в популяции K. pneumoniae гипервирулентных и антибиотикорезистентных штаммов, поэтому возникают определённые сложности при подборе эффективных методов борьбы с данным возбудителем [3–5]. Учёные активно занимаются поиском новых средств на основе бактериофагов, ферментобиотиков и антител против поверхностных структур клебсиелл, но пока соединения-кандидаты с выраженной эффективностью не выявлены [4].

Результатом совместных исследований оренбургских микробиологов и педиатров стало получение в конце XX в. синергидной комбинации лизоцима с антимикробными препаратами для лечения бактериальной пневмонии у детей [6]. Это был принципиально новый подход в борьбе с возбудителями острых поражений лёгких у детей, который успешно прошёл клинические испытания.

Как известно, “новое – это хорошо забытое старое”. Эта цитата не случайна, поскольку переосмысление принципов, которые использовались прежде в терапии бактериальных инфекций, позволило нам рассмотреть новую синергидную комбинацию с противомикробными препаратами. Благодаря этому подходу можно расширить спектр эффективных средств борьбы с клебсиеллёзными инфекциями.

Штаммы Klebsiella pneumoniae – условно-патогенные микроорганизмы и опасные возбудители инфекций человека. Штаммы K. pneumoniae относятся к семейству Enterobacteriaceae и являются условно-патогенными микроорганизмами, которые колонизируют поверхность слизистых желудочно-кишечного тракта человека и встречаются повсеместно в природе, включая воду, почву и животных [3]. Вместе с тем некоторые виды Klebsiella spp. могут контаминировать медицинское оборудование и объекты в учреждениях здравоохранения, вызывая внутригоспитальные инфекции [7]. Впервые культура K. pneumoniae была описана К. Фридлендером в 1882 г. как бактерия (палочка Фридлендера), выделенная из лёгких умерших от пневмонии. В настоящее время клебсиеллы по-прежнему считаются наиболее частой причиной тяжёлых пневмоний, особенно среди детского контингента [1, 8].

У людей с иммунокомпроментированным статусом (грипп и COVID-19, приём антибактериальных препаратов, соматическая патология, врождённая патология иммунной системы, детский или пожилой возраст) клебсиеллы способны преодолевать кишечный барьер и, проникая в кровь, распространяться в различные ткани и системы организма. Они вызывают широкий спектр тяжёлых заболеваний (острое поражение лёгких, инфекции мочевыводящих путей и кровотока, сепсис) и часто служат причиной летального исхода [4, 9]. По данным масштабного исследования “Глобальное бремя болезней” (Global Burden of Diseases, Injuries, and Risk Factors Study, GBD), треть летальных исходов в мире ассоциирована с инфекцией лёгких, желудочно-кишечного тракта и сепсисом. В 2019 г. было зафиксировано почти 2.5 млн летальных исходов, связанных с пневмонией. Более того, пневмония по-прежнему остаётся основной причиной смерти детей младшего возраста в странах с низким уровнем дохода и пожилых людей в развитых странах [10]. В половине случаев возбудителями являются условно-патогенные микроорганизмы, к которым относятся штаммы K. pneumoniae.

Клебсиеллы привлекают всё больше внимания исследователей в связи с их способностью быстро приобретать устойчивость к антимикробным препаратам. Более трети штаммов возбудителей клебсиеллёзной инфекции демонстрируют резистентность по крайней мере к одной группе антибиотиков, при этом наиболее распространённый фенотип характеризуется комбинированной устойчивостью к фторхинолонам, цефалоспоринам третьего поколения и аминогликозидам [10]. Известно, что среди грамотрицательных бактерий клебсиеллы выступают основным продуцентом и резервуаром карбапенемаз – бактериальных ферментов, способных расщеплять все типы бета-лактамных антибиотиков, в том числе карбапенемы (антибиотики из группы резерва¹) [4].

Молекулярно-генетическому анализу полирезистентных изолятов K. рneumoniae, выявленных при мониторинге резистентных грамотрицательных бактерий в НМИЦ здоровья детей в 2014–2021 гг., была посвящена одна из последних работ коллектива Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи (НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) [11]. Выявлено большое разнообразие генотипов штаммов K. рneumoniae с множественной резистентностью, выделенных из ликвора (спинномозговая жидкость) и крови детей. Авторы приводят данные за 2020 г. о циркуляции на территории России полирезистентных штаммов K. рneumoniae клональных групп CG395, CG11, CG147 и CG307, относящихся к международным клонам особого риска [11, 12].

Актуальность проблемы клебсиеллёзных инфекций возрастает и в связи с распространением в популяции K. pneumoniae гипервирулентных штаммов, представляющих собой более вирулентный патотип, чем классический штамм клебсиелл [4, 13]. Д. Джу с соавторами описали явление конвергенции признаков двух генетических линий K. pneumoniae: с множественной резистентностью к антимикробным препаратам и гипервирулентностью [14]. К генетическим факторам, которые придают штаммам гипервирулентный фенотип, относят присутствующие в мобильных элементах их генома (плазмидах и хромосомных мобильных генетических элементах) детерминанты сидерофорных систем, продукцию капсул (типы капсул K1 и K2) и токсина колибактина. Эти элементы обусловливают генерализацию инфекции и развитие сепсиса [15] и считаются незаменимыми факторами вирулентности бактерий.

В лаборатории инфекционной симбиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (ИКВС УрО РАН) разработаны оригинальные праймеры для детекции аэробактина (iucBC) и колибактина (clbBN), использование которых, наряду с детерминантами специфических ингибиторов лизоцима (белки семейства Ivy и Pli/Mli), позволяют с помощью тест-системы ПЦР единовременно выявлять штаммы с вирулентным и персистентным потенциалом. Как и многие другие бактериальные патогены, штаммы K. pneumoniae в процессе эволюции выработали различные стратегии резистентности к защитным антимикробным пептидам, определяющие их персистенцию и выживание в организме хозяина [16]. Благодаря многочисленным экспериментальным и клиническим наблюдениям в ИКВС УрО РАН были получены данные об адаптивных возможностях патогена во внутренней среде хозяина, реализуемых через персистентный потенциал, что способствовало отнесению факторов персистенции к малым факторам патогенности и нашло воплощение в разработке и создании диагностических, прогностических и терапевтических технологий в инфекционной клинической практике [17].

Учитывая, что основным резервуаром штаммов K. pneumoniae служит кишечная микробиота, в изучении клебсиеллёзных инфекций, с одной стороны, важно исследовать защитную роль индигенной микробиоты – бифидобактерий. Существует множество доказательств роли кишечной микробиоты в предотвращении заражения патогенными бактериями и экспансии условно-патогенных микроорганизмов, что реализуется через симбиотические взаимодействия как внутри микросимбиоценоза, так и с иммунными факторами хозяина. С другой стороны, индигенная микробиота, принимая участие в метаболических превращениях лекарственных препаратов, существенно влияет на их эффективность.

В целом рост в популяции клебсиелл штаммов, устойчивых к противомикробным препаратам (в том числе из группы резерва), значительно сузил, а в некоторых случаях и вовсе ликвидировал возможности для лечения клебсиеллёзных инфекций. Кроме того, появление гипервирулентых вариантов в популяции антибиотикорезистентных штаммов K. pneumoniae обусловливает генерализованные формы заболеваний и высокую смертность от пневмонии, инфекции кровотока и сепсиса. Всемирная организация здравоохранения включила клебсиеллу в критический список микроорганизмов, для противодействия которым необходимы современные терапевтические подходы. Одним из них служит комбинация лизоцима с антимикробными препаратами, которая была успешно апробирована на базе детских стационаров Оренбурга.

Синергидная комбинация лизоцима и противомикробных препаратов в отношении возбудителей пневмонии у детей. Рост резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам в своё время повлёк за собой использование больших доз антибиотиков и способствовал увеличению длительности курсов лечения, что в свою очередь привело к выраженным негативным последствиям и снижению эффективности терапии [5]. Кроме того, использование антимикробных средств уменьшает естественную резистентность организма человека, что во многом определяет тяжесть протекания и исход инфекций у детей [6].

В начале 1980-х годов на кафедре микробиологии и педиатрии Оренбургского государственного медицинского института (ныне ОрГМУ) под руководством О.В. Бухарина и Г.П. Бондаренко была выполнена диссертационная работа Н.Ф. Тарасевич, которая позволила разработать принципиально новый подход в борьбе с возбудителями инфекций. В условиях in vitro установлена синергидная комбинация лизоцима и антибиотиков против возбудителей острых пневмоний у детей (табл. 1) [6]. Использование лизоцима при лечении пневмонии привлекло внимание клиницистов, поскольку данный природный антисептик является важным компонентом врождённой иммунной системы слизистой оболочки хозяина и обладает литическими эффектами в отношении широкого спектра микроорганизмов.

 

Таблица 1. Сравнительная характеристика синергидного эффекта лизоцима в комбинации с антибиотиками против возбудителей пневмонии (метод двойных градиентных пластинок)

Возбудитель Лизоцим с антибиотиком	Стафилококки	Пневмококки	Стрепто- кокки гемолитические	Стрепто- кокки зеленящие	Клебсиеллы
Бензилпенициллин	++	+++	++++	++++	+
Ампициллин	–	+	+	+	+
Ампиокс	++++	+++	++++	+++	+
Оксациллин	++	+	+	+	–
Диклоксациллин	+++	+	++	++	–
Метициллин	+++	++	+++	++	–
Линкомицин	++	+	+	+	–
Карбенициллин	++	+	+	++	+
Фузидин	+++	–	–	–	–
Цепорин	++++	++	++	+	–
Кефзол	+++	++	+	+	+
Морфоциклин	++	++++	++++	+++	–
Тетраолеан	+++	+	+	+	–
Олеандомицин	++	+	+	+	+
Эритромицин	+++	+++	+++	+++	–
Левомицетин	+	+	+	+	++
Стрептомицин	++	–	–	–	–
Ристомицин	+++	++	+	+	–
Гентамицин	+	+	+	+	++
Мономицин	+++	–	+	+	++
Канамицин	++++	–	–	–	++
Неомицин	++	–	–	–	++
Экмолин	++	+	+	+	–
Полимиксин	+++	–	–	–	–

Примечание: (+) – кратность усиления антимикробного действия антибактериальных препаратов под влиянием лизоцима до 4; (++) – 4–8; (+++) – 8–16; (++++) – 16 и более; (–) – отсутствие синергидного эффекта.

 

Известно, что лизоцим в высоких концентрациях содержится в секрете дыхательных путей млекопитающих (>500 мкг/мл), а также в грудном молоке, вакуолях фагоцитарных клеток, интерстициальной жидкости и слюне. Данный белок воздействует на клеточную стенку как мурамидаза (гликозидгидролаза), которая катализирует гидролиз 1,4-β-гликозидной связи между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетил-D-глюкозамином в пептидогликане – основном компоненте клеточной стенки грамположительных бактерий. Установлена и немурамидазная функция лизоцима как катионного антимикробного пептида, приводящего к изменению проницаемости микробной мембраны [18]. Лизоцим вездесущ в качестве первой линии иммунной защиты млекопитающих от патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [19].

В работе Н.Ф. Тарасевич была установлена способность лизоцима усиливать антимикробное действие антибиотиков в отношении бактериальных возбудителей пневмонии, а его выявленный дефицит в сыворотке крови и лейкоцитов обусловил целесообразность применения этой комбинации при комплексной терапии пневмонии у детей. Лечение больных острой пневмонией экспериментально подобранными комбинациями лизоцима с антибактериальными препаратами оказалось эффективнее обычной антибактериальной терапии, что проявлялось в более быстрой ликвидации (на 5–8 день) клинико-лабораторных признаков пневмонии и нормализации уровня показателей естественной резистентности (лизоцим сыворотки крови и лейкоцитов, фагоцитарная активность нейтрофилов), более редком развитии затяжных пневмоний. Включение лизоцима в комплексную терапию позволило вдвое уменьшить дозы вводимых антибиотиков, что значительно снижало побочные эффекты у детей. Эта комбинированная схема была успешно апробирована при острой пневмонии на базе детских стационаров Оренбурга, а результаты диссертационной работы Н.Ф. Тарасевич высоко оценили в НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.

Разработка эффективных средств борьбы с возбудителями клебсиеллёзных инфекций очень важна по причине усугубления этой проблемы и появления её новых аспектов, связанных, в частности, с распространением в популяции клебсиелл гипервирулентных вариантов. Благодаря многолетней работе мы актуализировали использование лизоцима с антимикробными препаратами в отношении штаммов K. pneumoniae, сравнив эту комбинацию с природным антиоксидантом карнозином в условиях in vitro.

Карнозин – природный антиоксидант в борьбе с клебсиеллёзной инфекцией. Карнозин был открыт в 1900 г. русским биохимиком B.C. Гулевичем в составе безбелкового мышечного экстракта и стал первым известным биогенным пептидом. Это природное соединение в больших количествах содержится в мышечной и нервной ткани млекопитающих. Карнозин (β-аланил-L-гистидин) – дипептид с выраженными антиоксидантными и антиокислительными свойствами, который может быть перспективен при инфекции лёгких на этапе борьбы с процессами окислительного стресса, индуцируемого гидроксильными и свободными радикалами. Антиоксидантная активность карнозина подобна эффекту антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы и включает способность улавливать свободные радикалы, что позволяет бороться с окислительным стрессом и уменьшает воспалительные процессы в организме человека [20].

Роль про- и антиоксидантов в обеспечении стабильного существования и функционирования симбиотических систем человека установлена на примере формирования механизмов защиты вагинального биотопа, благодаря этому возникают новые перспективы в регуляции инфекционного процесса [21, 22]. Биологическая активность карнозина продемонстрирована для самых разных систем организма [20]. Выявлена его эффективность на моделях острых поражений лёгких (вирусных и вызванных липополисахаридами), а также лёгочного фиброза [23, 24]. Известно, что окислительный стресс – важный механизм патогенеза поражений лёгких у пациентов, поэтому противовоспалительная терапия в данном случае не всегда эффективна. Лёгкие относятся к органам с низким содержанием карнозина, в то же время в условиях in vitro установлен его защитный и регенерирующий эффект на модели культивированных фибробластов лёгких человека [25]. Всё это определяет актуальность и привлекает внимание исследователей к потенциальному использованию карнозина с антиоксидантным эффектом при лечении заболеваний лёгких.

Терапевтическое применение карнозина в эксперименте и при клинических испытаниях позволило охарактеризовать его как эффективный иммуномодулятор и противовоспалительный агент. Наблюдавшиеся эффекты могли быть объяснены на основании присущих карнозину антиоксидантных, мембраностабилизирующих и рН-буферных свойств. Карнозин нетоксичен и удобен для клинической практики [20].

Мы повторили опыты с использованием лизоцима с современными антимикробными препаратами в отношении штаммов K. pneumoniae, сравнив эту комбинацию с карнозином в условиях in vitro (табл. 2). Полученные результаты позволили установить стабильность синергидного влияния лизоцима и гентамицина, канамицина, а также определить новые комбинации с цефуроксимом. Достоверного увеличения чувствительности штаммов не отмечалось в комбинации с β-лактамами (ампициллин, цефтриаксон) и фторхинолонами.

 

Таблица 2. Сравнительная характеристика синергидного эффекта лизоцима и карнозина в комбинации с антибиотиками против штаммов K. pneumoniae (диско-диффузионный метод)

Диски с препаратами	Содержание препарата в диске, мкг	Диаметры зон подавления роста культур K. pneumoniae (n=33), мм и интерпретация результатов (S/I/R)
		Контроль чистой культуры	S/I/R	Опыт с лизоцимом	S/I/R	Опыт с карнозином	S/I/R
Гентамицин	10	20–21	S	29–32*	S	30–32*	S
Ампициллин	10	7–7.5	R	10–12	R	14–16*	I/S
Цефуроксим	30	16–18	S	21–22*	S	22–24*	S
Цефтриаксон	30	30–32	S	31–32	S	30–32	S
Ципрофлоксацин	5	24–25	S	28–29	S	30–33	S
Офлоксацин	5	20–21	S	25–27	S	32–34*	S
Норфлоксацин	10	22–23	S	27–28	S	30–33*	S
Канамицин	5	20–21	S	25–28	S	31–32*	S

Примечание: S – чувствительность; I – промежуточная чувствительность; R – устойчивость к действию препарата; * – р≤0.05 в сравнении с контролем.

 

Сравнительный анализ комбинаций с карнозином показал его способность усиливать действие антибиотиков в отношении штаммов K. pneumoniae. Оптимальные комбинации установлены для гентамицина, канамицина, цефуроксима, офлоксацина и норфлоксацина. В комбинации с ампициллином отмечалось изменение резистентности культур к антибиотику на чувствительный и промежуточный варианты. Таким образом, сочетание карнозина с антимикробными препаратами может оказывать значительное ингибирующее действие на патогенные микроорганизмы, что подтверждает его потенциал в борьбе против возбудителей заболеваний человека.

***

Проблема клебсиеллёзных инфекций актуальна и активно обсуждается в научном сообществе, появляется всё больше работ по данной теме, ведётся поиск современных терапевтических подходов. На примере данных инфекций ярко прослеживается несоответствие между потребностями здравоохранения и текущими разработками в области противомикробных препаратов, что в свою очередь ставит на передний план в современном здравоохранении разработку профилактических и терапевтических мер борьбы с этими инфекциями.

Оптимальная схема лечения больных острой пневмонии на основе установленной синергидной комбинации лизоцима с антибиотиками, разработанная в Оренбурге, продемонстрировала стабильность данного подхода. Кроме того, сочетанное применение карнозина (природный дипептид с антиоксидантыми, антиокислительными и противовоспалительными свойствами) с противомикробными препаратами позволило получить эффективную комбинацию в отношении штаммов K. pneumoniae.

Анализируя полученные данные, нетрудно понять, что карнозин как природное средство может служить альтернативой при усилении антимикробного эффекта в борьбе с клебсиеллёзной инфекцией. Мы пришли к выводу, что это, вероятно, связано с реакцией Фентона². Совершенно очевидно, что для протекания реакции сложились все подходящие условия – формирование окислительного стресса при воспалении лёгких и наличие собственных антиоксидантов (карнозин, супероксиддисмутаза и др.), усиливающих защитные силы организма человека. Дальнейшее продвижение исследований карнозина открывает перспективы разработки эффективных и безопасных антимикробных средств, но это требует экспериментальных доказательств, времени и смелости ума.

ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ

Работа выполнена в рамках Государственного задания ИКВС УрО РАН “Исследование симбиотических систем про- и эукариот в биологии и медицине” (№ FUUG-2022-0007).

 

¹ Группа резерва – антибиотики и их классы, которые применяются исключительно для лечения подтверждённых или подозреваемых инфекций, вызванных бактериальными возбудителями с множественной лекарственной резистентностью. Антибиотики данной группы применяются в качестве крайней меры.

² Реакция Фентона – реакция пероксида водорода с ионами железа, которая используется для разрушения органических веществ.

About the authors

O. V. Bukharin

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: ofrc@list.ru

академик РАН, научный руководитель

Russian Federation, Orenburg

E. V. Ivanova

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: walerewna13@gmail.com

доктор медицинских наук, заведующая лабораторией инфекционной симбиологии

Russian Federation, Orenburg

I. A. Zdvizhkova

Institute of Cellular and Intracellular Symbiosis, Ural Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: zdvizhkova.irina@gmail.com

научный сотрудник лаборатории биомониторинга
и молекулярно-генетических исследований

Russian Federation, Orenburg

References

Supplementary files