Significance of diphtheria toxin in neuropathy development and protective effect of nerves growth factor

Full Text

Эпидемический подъем дифтерии в 90-е годы в нашей стране [2] закономерно привел к изучения дифтерийных нейропатий (ДНП). Новый уровень научных знаний о дифтерийной коринобактерии, строении дифтерийного токсина (ДТ) и путях воздействия его на клетки позволяют продолжить исследование патогенеза развития ДНП как в клинике, так и в эксперименте.

На секционном материале [5], а также в опытах in vivo [12, 15] было показано, что при дифтерии происходит поражение нейронов и клеток глии центральной и периферической нервной системы, первично связанное с воздействием ДТ. В настоящее время известно, что ДТ секретируется бактерией в форме проэнзима, состоящего из А и В фрагментов; оба они токсичны по отношению к чувствительным клеткам и ферментативно активны [4, 8, 16, 17]. Фрагмент В специфически взаимодействует с рецепторами, расположенными на поверхности ряда эукариотических клеток и участвует в образовании канала в мембране клетки, через который фрагмент А транспортируется в цитоплазму. Основной Токсический эффект обусловлен фрагментом А, который катализирует перенос АДФ-ри- бозного остатка с НАДФ на фактор элонгации 2 (ЕФ-2). Последнее приводит к его инактивации, следовательно, к нарушению элонгации пептида в клетке и останавливает синтез белка. В конечном итоге это вызывает либо гибель клетки, либо нарушение ее функции. Так, швановские клетки перестают вырабатывать миелинспецифические белки, в результате происходят деградация миелиновых оболочек, их демиелинизация. Воздействие ДТ на Нейрон приводит к альтерации сомы и аксона.

Не вызывает сомнений первичная роль ДТ в развитии у больных ранних ДНП. Одним Из доказательств является корреляция частоты И тяжести развития неврологических симптомов в зависимости от степени токсичности Дифтерии [6]. Аспекты клинических проявлений ДНП достаточно изучены, но предстоит выяснить, сохраняется ли этот же механизм Повреждения нервов и при поздних ДНП или, как считают большинство авторов, в генезе их лежит аутоиммунный процесс, обусловленный демиелинизацией. Несмотря на раскрытый механизм повреждения клетки ДТ, нет работ, в которых на молекулярном уровне было бы предложено конкурентное воздействие факторов, нейтрализующих действие ДТ.

Поиск подобных веществ привел нас к изучению фактора роста нервов (ФРН), являющегося незаменимым биологическим нейромедиатором, вырабатывающимся клетками организма [3]. ФРН в процессе онтогенеза непосредственно воздействует на сенсорные и симпатические нервы периферической нервной системы, улучшая их выживание, дифференцировку, стимулируя рост нейритов и синтез нейрофиламенов. Во взрослом организме ФРН влияет на регуляцию синтеза нейропептидов, играет активную роль при развитии патологических процессов непосредственно в нерве [14]. Установлено, что один из трофических эффектов ФРН на нейроны обусловлен его воздействием на фактор элонгации трансляции [11, 13]. В экспериментах на культуре нервной ткани было показано, что ФРН способен предотвращать развитие нейротоксического эффекта при воздействии таксоля [18] на спинномозговые ганглии и оказывать лечебный эффект при экспериментальных периферических нейропатиях [8].

Целью исследования являлось определение значения ДТ в генезе повреждения нервной ткани и выявление защитного воздействия ФРН при ДНП в эксперименте и клинике. Экспериментальные исследования проведены in vitro и in vivo. Исследования in vitro выполнены на 300 эксплантатах спинномозгового ганглия в 4 сериях опытов: изолированного воздействия ДТ, ФРН и одновременного воздействия ДТ+ФРН на рост нейритов с постановкой контроля (по методу Н.О.Чалисовой, 1991). Использовали стандартный ДТ серии 312, содержащий 150 lf/мл, изготовленный ЦНИИСТ им. Тарасевича. ФРН афинно-очищенный мышиный получали в НИИ физиологии БАН (Минск). Экспериментальные исследования in vivo были проведены на 126 белых крысах: в первой серии опытов (60 животных) создана модель ДНП путем подбора адекватной дозы (0,05 lf/100 г массы), которая при однократном внутримышечном введении в левую заднюю лапу, аналогично известному способу [9], создавала на 15—е сутки картину стойкого неврологического поражения n. ischiaticus sinister при отсутствии летальных исходов. Во второй серии опытов (66 крыс) оценивали результат воздействия изолированного и сочетанного введения ДТ, ФРН (1 мг/кг) по сравнению с контролем при ежедневной оценке степени развития пареза по шкале [9], а также патоморфологических и электрофизиологических данных.

В клинике прослежено течение ДНП у 25 больных с различной степенью токсичности дифтерии. Помимо клинико-неврологического обследования, у больных определяли ДТ в свободном состоянии и в составе иммунных комплексов по методу О.А. Аксенова (1995) в КФ-тесте. ФРН в сыворотке крови больных выявляли по модифицированному методу Murase К. et al. [15] прямым радиоиммунным методом и с использованием моноклональных антител к ФРН.

В результате исследований in vitro было установлено, что добавление в культуральную среду ДТ вызывало выраженное угнетение роста нейритов, а при высоких концентрациях (0,1-01 lf/мл) рост нейритов вообще отсутствовал, наблюдалась лишь миграция глиоцитов. Добавление же ФРН (60 нг/мл) в культуральную среду приводило к интенсивному росту нейритов, достоверно превышающему контроль (Р<0,01). При одновременном внесении в культуру ганглия ФРН и ДТ выявлено достоверное блокирование ингибирующего эффекта ДТ, выражавшееся в достаточно интенсивном и равномерном росте нейритов [1]. Исчезновение ингибирующего эффекта ДТ под влиянием ФРН происходило при всех рассматриваемых концентрациях ДТ (0,1-0,0001 lf/мл).

Для дальнейшего углубленного изучения повреждающего действия ДТ и защитного эффекта ФРН были выполнены эксперименты на белых крысах. Клиническое наблюдение за животными проводилось в течение 60 дней. В 1-й группе (контрольной) все животные остались здоровыми. Во 2-й группе (введение ДТ в дозе 0,5 lf/100 г веса) к 15-м суткам заболело 60% крыс, к 25-му дню - 81%, из них у половины наблюдались тяжелые неврологические нарушения в сочетании с общими нейротрофическими нарушениями. В 3-й группе животных, получивших ДТ+ФРН (доза — 1мг/кг), к 25-м суткам только у одного животного из 16 отмечались нестойкие неврологические нарушения до одного балла.

Сравнение полученных данных (Р<0,001) показало, что при одновременном введении ДТ+ФРН дифтерийная нейропатия либо не развивается вообще, либо проявляется в легкой форме в единичных случаях.

Патоморфологические исследования у животных 2-й группы выявили картину прогрессирующего поражения периферического нерва, спинномозгового ганглия и корешков спинного мозга. Более ранними и глубокими были дегенеративные изменения миелиновых оболочек аксонов и поражения сомы нейронов в спинномозговых ганглиях. На 20-30-й дни в нерве определялись отек, очаги деструкции, скопления гипертрофированных швановских клеток, в СМГ были выражены дегенеративные процессы. В 3-й группе животных, получивших ФРН+ДТ, морфологически на тех же сроках наблюдалась сохранность миелиновых оболочек, осевых цилиндров нервов и ганглионарных клеток СМГ. В нерве имела место реактивная пролиферация швановских клеток, возможно, вследствие вызываемой ФРН стимуляции процессов ремиелинизации после повреждения.

Клинические исследования ДНП у детей показали корреляцию тяжести неврологических поражений и течения ДНП, нарастающую при токсических формах дифтерии. У 12 из 25 обследованных больных наблюдалась ранняя ДНП, у остальных 13 больных заболевание прогрессировало в виде поздних ДНП на 3-6-й неделе болезни. При использовании разработанного комплекса тестов по оценке токсинемии при дифтерии было установлено, что в остром периоде инфекции в крови циркулируют как свободный токсин, так и специфические иммунные комплексы.

Образование специфического иммунного комплекса проходит несколько этапов: частичное — со свободными участками антигена (эпитопами), образование полного, но слабо авидного, наконец, высокоавидного комплекса с минимальной константой диссеминации. Данные 4-го этапа отражали инактивацию ДТ у больных как при ранней, так и при поздней ДНП - от свободного токсина до высокоавидного иммунного комплекса. Уже в остром периоде дифтерии при локализованных формах свободный токсин наблюдался в 51,5% случаев, а слабоавидный иммунный комплекс - в 48,5%, тогда как при токсической форме преобладал свободный токсин или его эпитопы (67,5%), а инактивированный - только в 31,5% случаев. Максимальные значения ДТ наблюдались при субтоксической и токсической дифтерии 1 степени, резко уменьшаясь при токсической дифтерии II и III степени, что, вероятно, связано с фиксацией иммунных комплексов в органах-мишенях, в частности в периферической нервной системе. При тяжелом течении ДНП с волнообразными периодами ухудшения, клинически проявлявшимися не только усилением бульбарного синдрома, но и развитием генерализованных двигательных нарушений на 3-6-й неделе заболевания, в крови периодически выявлялись свободный токсин и иммунные комплексы, содержащие ДТ, а также неспецифические комплексы, отражавшие иммунопатологические процессы в организме. Можно полагать, что образование ДТ в поздние сроки являлось следствием распада слабоавидных комплексов со свободными эпитопами и «вымывания» специфических фиксированных комплексов из тканей, прежде всего нервной. Нарастание последних наблюдалось в период уменьшения неврологической симптоматики и было прогностически благоприятным, свидетельствуя о процессах саногенеза.

О репаративных процессах судили по содержанию ФРН у больных ДНП. Выделены 3 основных варианта динамики изменения ФРН в сыворотке крови в зависимости от тяжести и исходов ДНП: 1-й — повышение ФРН до 3600— 6800 пг/мл в острой фазе с последующим снижением до 2000 пг/мл в периоде ранней реконвалесценции и благоприятном течении болезни; 2-й — отсутствие существенных колебаний ФРН на протяжении всей болезни (2000 пг/мл), что было характерно для легких случаев; 3-й — низкие значения ФРН на протяжении заболевания (0—75 пг/мл), что наблюдалось при ДНП в случаях летального исхода на поздних сроках или при крайне тяжелом течении ДНП, сопровождающейся развитием не только вегетативных, чувствительных, но и генерализованных двигательных нарушений. Зависимость содержания ФРН от тяжести течения и исходов ДНП свидетельствовала о существенной защитной роли ФРН, направленной на восстановление функций нервной системы.

Итак, в генезе поражения периферической нервной системы при дифтерии ДТ играет ведущую роль. Показано защитное действие ФРН, предотвращающее повреждение нервной ткани в эксперименте как на культуре нервного ганглия, так и при моделировании ДНП у животных. В течении ДНП у детей выявлялось содержание ДТ в крови в свободном состоянии или в составе иммунных комплексов в ранние и поздние сроки заболевания. Восстановительные же процессы и исходы ДНП, напротив, коррелировали с динамикой содержания ФРН в сыворотке крови, что свидетельствует о защитной роли данного нейротрофического фактора. Возможным объяснением полученных результатов является конкурирующее влияние ДТ и ФРН на синтез белка на уровне рибосом: если фрагмент А ДТ приводит к блокированию синтеза белка в клетке путем воздействия на фактор элангации 2 [17], то ФРН, наоборот, направлен на поддержание синтеза белка в нейронах на оптимальном уровне [10, 13]. В условиях целого организма ФРН усиливает процесс регенерации периферических нервов за счет стимуляции миграции швановских клеток [7]. Полученные данные могут быть использованы для разработки нового подхода к терапии заболеваний периферической нервной системы.

About the authors

М. N. Sorokina

Research Institute of Children's Infections

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

М. V. Davydovskay

Research Institute of Children's Infections

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

А. V. Romanjuk

Research Institute of Children's Infections

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

N. I. Chalisova

Research Institute of Children's Infections

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

N. V. Skripchenko

Research Institute of Children's Infections

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

R. А. Nasyrov

Research Institute of Children's Infections

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

О. A. Aksenov

Research Institute of Children's Infections

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

О. А. Markova

Research Institute of Children's Infections

Email: info@eco-vector.com
Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files