Electrophysiologic study of denervational and reinnervational changes of synaptic functions in the skeletal muscle

Full Text

Денервационно-реиннервационные изменения, происходящие в скелетных мышцах, давно привлекают внимание ученых. Этот интерес объясняется прежде всего клинической значимостью синдрома. Однако в большинстве случаев исследования проводят на поздних стадиях де- и реиннервации и носят они в основном морфологический или биохимический характер. В то же время естественные синаптические сигналы отражают весь комплекс процессов, происходящих в нервно-мышечном синапсе. По амплитудновременным характеристикам этих сигналов можно изучать те молекулярные и субклеточные изменения пре- и постсинаптических структур, которые протекают в процессе де- и реиннервации.

В нервно-мышечном синапсе выделяют 3 основных элемента: нервное окончание (НО) с пресинаптической областью, участок мышечного волокна, к которому прилегает терминаль (постсинаптическая область), и разделяющую их синаптическую щель. Деполяризация НО приходящим потенциалом действия (ПД) приводит к входу кальция через кальциевые каналы пресинаптической мембраны и экзоцитозу синаптических везикул, в результате которого происходит освобождение квантов (порций) медиатора. Последний, диффундируя через синаптическую щель, связывается на постсинаптической мембране с холинорецепторами (ХР), что ведет к открытию ионных каналов и появлению на постсинаптической мембране потенциала и токов концевой пластинки (П(КП и ТКП). Если ПКП достигнет порогового значения, он вызовет ПД и соответственно произойдет передача возбуждения. Кванты медиатора освобождаются и без возбуждения. В этом случае регистрируются миниатюрные токи концевой пластинки (МТКП).

В данной работе предпринята попытка на модели нервно-мышечного синапса лягушки изучить синаптические функции в процессе де- и реиннервации. Проведено комплексное электрофизиологическое исследование особенностей ионных токов, характеристик секреции медиатора и постсинаптических сигналов в дегенерирующих и вновь сформированных НО.

Эксперименты были выполнены на синапсах кожно-грудинных мышц взрослых озерных лягушек. Животным под эфирным наркозом производили денервацию левой кожно-грудинной мышцы (правая служила контролем) под визуальным наблюдением с использованием бинокулярной лупы (×25). Двигательный нерв передавливали кончиками пинцета непосредственно перед входом его в мышцу. После операции животные находились в террариуме до эксперимента, где их кормили. Во время опыта нервно-мышечный препарат помещали в ванночку с раствором Рингера: NaCl — 115, KCl — 2,0, CaCl — 0,3, MgCl—0, NaHCO— 2,4 ммоль/л; pH 7,2—7,4; температура — 20°С.

Пспользуя поляризационно - интерференционный микроскоп (×500), находили поверхностно лежащее НО и подводили электрод к разным участкам терминалей. При помощи стеклянных микроэлектродов внеклеточно отводили ответы НО (отражающие совокупность токов формирующих ПД), ТКП и МТКП. Микроэлектрод с сопротивлением 1 —2 мОм заполняли раствором NaCI (2 моль/л). МТКП анализировали при помощи автоматизированной системы на базе микро-ЭВМ. Оценивали амплитуду сигналов, время полуспада (t_пc ) МТКП и квантовый состав (КС) ТКП [2]. НО окрашивали метиленовым синим. Результаты анализировали с применением t-критерия Стьюдента.

Временной ход денервационно-реиннервационных изменений в нервно-мышечном синапсе, В результате исследования было установлено, что денервационно-рёиннервационный процесс складывается из нескольких последовательных этапов. Передавливание нерва приводит к выключению передачи возбуждения с нерва на мышцу, однако спонтанное освобождение медиатора сохраняется. На первом этапе (ближайшие часы после передавливания двигательного нерва) характеристики МТКП не изменялись, на втором (2-й день) — происходило уменьшение амплитуды и частоты МТКП. Через 4 — 5 дней (третий этап) постсинаптические сигналы полностью исчезали. Четвертый этап — период «молчания» (5—10-й день)—характеризовался полным отсутствием каких-либо сигналов. В течение этого времени НО не выявлялись, они дегенерировали. На пятом этапе (10—15-й день) имела место реоккупация старых концевых пластинок новыми НО при отсутствии секреции медиатора, на шестом (15 — 20-й день) —в синапсе появлялись МТКП, которые характеризовались большой вариабельностью длительности, низкой амплитудой и частотой. ПД, зарегистрированный в миелинизированных аксонах, не проникал в НО. Седьмой (20 — 25-й день) этап начинался с появления в нервной терминали ответа НО, отражающего распространяющийся ПД и ТКП.

Амплитудно-временные параметры МТКП в процессе де- и реиннервации. В норме амплитуда МТКП в проксимальном участке НО составляет 1,68+0,098 мВ. По длительности сигналы были достаточно однородными. Гистограмма распределения t_пc МТКП в интактных НО имела одномодальный (1_псмоды— 1,94+0,08 мс) и компактный характер (п = 8).

После денервации происходило уменьшение амплитуды и частоты МТКП. Длительность сигналов изменялась в две фазы. В самом начале происходило уменьшение _tпc МТКП (на 18,1%), со 2 —3 -го дня денервации — удлинение спада МТКП. На 4-й день среднее значение t_пc возрастало на 52,9% по сравнению с таковым на 2-й день. С 5 по 15-й день наступал период «молчания». В это время никаких сигналов зарегистрировать не удавалось. На 15-й день после передавливания нерва мы вновь отмечали первые после периода «молчания» МТКП, характеризовавшие начало реокупации старых концевых пластинок новыми НО.

Средняя амплитуда МТКП на 15-й день в проксимальной части вновь сформированного НО составляла 0,31+0,04 мВ. По длительности МТКП характеризовались большим разбросом значений t_пc, и их можно было разделить на две группы: на первую — с модой t_пc, равной 1,56 мс, и на вторую — 3,96 мс. С увеличением времени после передавливания нерва спонтанные синаптические сигналы регистрировались более однородными по амплитуде и длительности (гистограммы распределений становились одномодальными). К 30 — 32-му дню параметры сигналов сближались с таковыми в интактных НО (рис. 1).

 

Рис. 1. Амплитудно-временные характеристики МТКП в процессе де- и реиннервации.

А — изменение МТКП в ходе денервации: 1 — гистограмма распределения t_пc в норме; 2 — гистограмма распределения t_пc в норме; 2 — гистограмма распределения t_пc на 4-й день после передавливания нерва; по оси абсцисс — t_пc (ж), по оси ординат — количество МТКП; 3 — изменение средней амплитуды МТКП (оплошная линия) и среднего t_пc (пунктирная); по оси абсцисс — дни после передавливания нерва, по оси ординат — средняя амплитуда МТКП, мВ (слева) и среднее t_пc , мс (справа). Б — изменение МТКП в ходе реиннервации: 1 —гистограмма распределения t_пc на 28-й день после передавливания нерва; по оси абсцисс — t_пc (мс), по оси ординат — количество МТКП; 3 — изменение средней амплитуды МТКП (сплошная линия) и среднего t_пc(пунктирная линия); по оси абсцисс — дни после передавливания нерва, по оси ординат—средняя амплитуда МТКП, мВ (слева) и среднее t_пc , мс (справа).

 

Особенности ионных токов по ходу регенерирующей терминали. Первые вызваннные ответы НО были зафиксированы на 25 — 26-й день после передавливания нерва. В проксимальных и центральных частях, регенерирующих НО, регистрировался низкоамплитудный двухфазный ответ, а в дистальных частях — монофазный (рис. 2). В интактной мышце ответы НО, выявляемые в проксимальных частях терминалей имели трехфазную форму, в центральных — двухфазную, а в дистальных — монофазную (рис. 2). Амплитуда второй фазы характеризовала величину входящего натриевого тока, которая уменьшалась при перемещении электрода от проксимального к дистальному участку терминали [3, 13]. Обращали на себя внимание отсутствие третьей фазы в ответе, зарегистрированном в проксимальной точке регенерирующей терминали, и более длительная (примерно в два раза) вторая фаза. По ходу регенерирующей терминали амплитуда второй фазы ответа менялась незначительно. В интактных НО величина второй фазы сильно уменьшалась (рис. 2). Из сравнения видно, что величина второй фазы в интактных НО значительно выше, а спад значительно круче, чем во вновь сформированных.

Действие 4-аминопиридина на форму ответа НО. Для дальнейшей идентификации ионных токов регенерирующего НО нами было исследовано действие блокатора потенциалозависимых калиевых каналов — 4-аминопиридина (АП) на форму ответа НО. Регистрацию осуществляли в растворе Рингера с содержанием ионов Са, равным 1,8 ммоль/л. Оказалось, что эффект АП в регенерирующих НО коренным образом отличается от интактных. После добавления в перфузируемый раствор АП в концентрации 0,2 ммоль/л происходило значительное расширение второй фазы ответа (рис. 3 а). Добавление АП в тех же концентрациях к интактным НО в проксимальном отделе приводило к ревкому увеличению третьей фазы ответа НО (рис. 3 б), что соответствовало результатам наших ранних исследований [4].

Скорость проведения возбуждения в регенерирующей терминали. Для определения скорости проведения ПД подбирали пары НО одинаковой длины (регенерирующее и нормальное), не имеющие вторичных веточек [2]. Оказалось, что V_ср для интактного НО составило 0,44 м/с, для регенерирующего— 0,24 м/с, при длине, равной 135 мкм.

Вызванное освобождение медиатора во вновь сформированных НО. Вместе с восстановлением ответов НО происходило восстановление вызванного освобождения медиатора (регистрировались ТКП). Для оценки освобождения медиатора из регенерирующих НО мы определяли профиль КС ТКП по ходу терминали. В каждой точке отведения высчитывали КС ТКП. Общий уровень секреции во вновь сформированных НО оказался намного ниже такового в интактных, а спад по ходу терминали практически отсутствовал (рис. 4). В нормальных НО зависимость КС ТКП от длины носила характер кривой, которая нарастала на протяжении 1/3 длины, а затем прогрессивно снижалась [1, 2].

Постсинаптические изменения в процессе де- и реиннервации. Согласно нашим и литературным данным [8, 9, 10], денервация приводит к изменению амплитудно-временных характеристик МТКП, что объясняется процессом смены ХР. Нормальные ХР находятся только в синаптической области и имеют субъединичный состав α₂βεδ (εХР). Они характеризуются высокой проводимостью и коротким временем открытого состояния [11]. Известно, что длительность МТКП зависит от времени открытого состояния ионного канала и плотности ХР. После денервации плотность нормальных ХР снижается и появляются внесинаптические ХР с включением их в синаптическую область. Такие, свойственные для денервированной мышцы ХР имеют субъединичный состав—α₂βεδ (εХР). Они характеризуются малой проводимостью и большим временем открытого состояния [11]. Эти изменения как раз и отражают двухфазный характер изменения длительности МТКП при денервации и появление сигналов с большой длительностью (рис. 1). В процессе реиннервации при реоккупации старых концевых пластинок, в первую очередь, происходит восстановление спонтанного освобождения медиатора в виде проявления редких низкоамплитудных МТКП. Их длительность значительно варьирует, что объясняется обратным процессом смены γХР постсинаптической мембраны на нормальные γХР [11]. Это приводит к уменьшению длительности МТКП, которая приближается к нормальным значениям. Одновременно растут частота и амплитуда МТКП.

Пресинаптические изменения в процессе де-и реиннервации. На 25-й день после передавливания нерва в регенерирующем НО нами были зарегистрированы ответы НО. Однако эти ответы значительно отличались от таковых в интактных терминалях. Во-первых, низкая амплитуда второй фазы ответа НО, отражающая входящий натриевый ток, свидетельствовала о том, что плотность натриевых каналов в мембране вновь образованных терминалей мала, а ПД резко снижен по амплитуде. На это еще указывала низкая скорость проведения возбуждения в регенерирующих терминалях, зависимая от плотности натриевых каналов [5]. Анализ динамики изменения второй фазы ответа НО показал, что в регенерирующем НО натриевый ток от проксимального к дистальному отделу уменьшается в 2 — 2,5 раза, в то время как в интактном НО — в 4 — 5 раз (рис. 2). Следовательно, в начале реиннервации встраивание натриевых каналов в мембрану вновь сформированных НО происходит равномерно по всей длине терминали, а позже имеет место их концентрация в самом проксимальном отделе, что коррелирует с данными других авторов [7].

 

Рис. 2. Ответы регенерирующих нервных окончаний.

Примеры ответов по ходу регенерирующего (а) НО и интактного (б) НО. Результаты отдельных экспериментов. На графике—изменение амплитуд второй фазы ответов регенерирующего НО (пунктирная линия) и интактного (сплошная). По оси абсцисс—длина терминали (в %), по оси ординат — амплитуда второй фазы (в %).

 

Большая длительность второй фазы в ответе НО регенерирующей терминали и отсутствие третьей фазы в проксимальном отделе могут указывать на то, что в мембране вновь образованного НО нет калыций-активируемых калиевых каналов [4]. В пользу этого предположения свидетельствовал эффект АП на ответ регенерирующего НО. Действие АП приводило к расширению второй фазы ответа регенерирующей терминали. В интактном НО АП вызывал резкое увеличение третьей фазы ответа (рис. 3), что связано с тем, что блокирование потенциалзависимых калиевых каналов затягивает ПД, увеличивает кальциевый ток и выходящий кальций-активируемый калиевый ток [4]. Наши данные позволяют предположить, что потенциалзависимые калиевые каналы встраиваются в мембрану вместе с натриевыми. В то же время на ранних ста- днях регенерации отсутствуют кальций-активируемые калиевые каналы, которые встраиваются в мембрану значительно позже.

 

Рис. 3. Действие аминопиридина (АП) на ответ регенерирующего нервного окончания.

а — ответ регенерирующего НО до и через 20 минут после действия АП; б — ответ интактного НО до и через 20 минут после действия АП. Эффекты указаны стрелками. Результаты отдельных экспериментов.

 

Согласно нашим и литературным данным [8, 9], уровень секреции медиатора в первое время после появления проведения ПД в НО достаточно низок. КС ТКП вдоль регенерирующей терминали от проксимальных к дистальным отделам НО меняется мало, в отличие от интактных, где вероятность секреции медиатора имеет максимальное значение на расстоянии 1/3 длины терминали с последующим уменьшением к дистальному отделу (рис. 4) [1, 2].

 

Рис. 4. Секреция медиатора по ходу регенерирующего нервного окончания.

Изменение КС ТКП по ходу регенерирующего НО (пунктирная линия) и интактного (сплошная). По оси абсцисс — длина терминалей (в %), по оси ординат—КС ТКП. Доверительные интервалы 95%.

 

На основании этого можно предположить, что вход кальция по ходу регенерирующей терминали слабо изменяется и имеет низкое значение. Последнее может быть связано с указанными выше отличиями распределения ионных каналов по терминали, особенностями амплитудно-временных параметров ПД, а также с морфофункциональными особенностями вновь образующихся активных зон [12], что ведет к уменьшению входа кальция в нервную терминаль и к сниженному выбросу медиатора.

About the authors

A. L. Zefirov

Imperial Kazan University

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com

Professor, Head of the Department of Normal Physiology

Russian Federation, Kazan

R. S. Kurtasanov

Imperial Kazan University

Email: info@eco-vector.com

Department of Normal Physiology

Russian Federation, Kazan

S. N. Zemskova

Imperial Kazan University

Email: info@eco-vector.com

Department of Normal Physiology

Russian Federation, Kazan

References

Supplementary files