Выявление РНК SARS-CoV2 с помощью мультиплексной изотермической петлевой амплификации с обратной транскрипцией методом анализа кривых плавления
- Авторы: Оскорбин И.П1, Шевелёв Г.Ю1, Проняева К.А1, Степанов А.А1, Пышный Д.В1, Филипенко М.Л1
-
Учреждения:
- Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
- Выпуск: Том 23, № 12 (2020)
- Страницы: 3-10
- Раздел: Статьи
- URL: https://journals.eco-vector.com/1560-9596/article/view/112800
- DOI: https://doi.org/10.29296/25877313-2020-12-01
- ID: 112800
Цитировать
Полный текст
Открытый доступ
Доступ предоставлен
Доступ платный или только для подписчиков
Аннотация
Актуальность. В связи с продолжающейся пандемией COVID-19, вызванной коронавирусом SARS-CoV2, существует острая потребность в диагностических тестах для выявления РНК вируса SARS-CoV2. Наиболее широко используемый метод ОТ-ПЦР позволяет получить результаты тестирования в течение 1,5-2 часов. Вместе с тем в связи с нехваткой пропускной способности диагностических лабораторий представляется необходимой разработка более быстрых методов тестирования. Цель исследования. Создание метода выявления РНК коронавируса SARS-CoV2 с помощью мультиплексной изотермической петлевой амплификации (LAMP) с обратной транскрипцией посредством анализа кривых плавления. Материал и методы. В качестве стандартных образцов использовали сконструированную плазмиду с фрагментом генома SARS-CoV2 и фага MS2, фрагменты геномной РНК SARS-CoV2 и фага MS2. Клинические образцы (назофарингеальные мазки), получали от пациентов ЦНМТ ИХБФМ СО РАН; РНК выделяли с помощью набора «РИБО-преп» ЦНИИ Эпидемиологии (Москва, Россия). LAMP проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad; США). Аналитические характеристики LAMP определяли с помощью разведений стандартных образцов. Клиническую чувствительность и специфичность мультиплексной LAMP оценивали, проводя тестирование клинических образцов одновременно LAMP и ОТ-ПЦР. Результаты. Подобраны праймеры и оптимизированы условия для проводения детекции с помощью LAMP участков РНК SARS-CoV2 и фага MS2, который служил внутренним контролем выделения РНК и амплификации. Мультиплексирование было основано на анализе кривых плавления продуктов амплификации. Предел чувствительности мультиплескной LAMP составил 20 молекул РНК SARS-CoV2 на реакцию. Конкордантность результатов тестирования 40 клинических образцов сравнительно с ОТ-ПЦР в реальном времени составила 92%. Выводы. Разработан метод для выявления РНК коронавируса SARS-CoV2 на основе мультиплексной изотермической петлевой амплификации. Метод, основанный на мультиплексной LAMP, может быть использован как альтернатива ПЦР в диагностической практике для экономии машинного времени и времени персонала.
Ключевые слова
Полный текст
Об авторах
И. П Оскорбин
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАНк.б.н., мл. науч. сотрудник г. Новосибирск
Г. Ю Шевелёв
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН
Email: osc.igor@gmail.com
к.х.н., зав. лабораторией г. Новосибирск
К. А Проняева
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАНлаборант г. Новосибирск
А. А Степанов
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАНк.м.н., зав. лабораторией г. Новосибирск
Д. В Пышный
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАНд.х.н., чл.-корр. РАН, директор института г. Новосибирск
М. Л Филипенко
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАНк.б.н, зав. лабораторией г. Новосибирск
Список литературы
- Notomi T., Okayama H., Masubuchi H. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12): E63.
- Yongkiettrakul S., Kampeera J., Chareanchim W. et al. Simple detection of single nucleotide polymorphism in Plasmodium falciparum by SNP-LAMP assay combined with lateral flow dipstick. Parasitol. Int. 2011; 66(1): 964-911.
- Global Tuberculosis Programme. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis : policy guidance. 38 p.
- Guo X.G., Zhou Y.Z., Li Q. et al. Rapid and reliable diagnostic method to detect Zika virus by real-time fluorescence reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. AMB Express. Springer Verlag. 2018; 8(1).
- Poon L.L.M., Leung C.S., Chan K.H., et al. Detection of human influenza A viruses by loop-mediated isothermal amplification. J. Clin. Microbiol. 2005; 43(1): 421-430.
- Park G.S., Ku K., Baek S.H. et al. Development of Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assays Targeting Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). J. Mol. Diagnostics. Elsevier B.V. 2020; 22(6): 129-135.
- Kitagawa Y., Orihara Y., Kawamura R. et al. Evaluation of rapid diagnosis of novel coronavirus disease (COVID-19) using loop-mediated isothermal amplification. J. Clin. Virol. Elsevier B.V. 2020; 129.
- Dong J., Xu Q., Li Ch. et al. Single-color multiplexing by the integration of high-resolution melting pattern recognition with loop-mediated isothermal amplification. Chem. Commun. Royal Society of Chemistry. 2019; 55(11): 2451-2460.
- Xu G., Gunson R.N., Cooper J.M., Reboud J. Rapid ultrasonic isothermal amplification of DNA with multiplexed melting analysis-applications in the clinical diagnosis of sexually transmitted diseases. Chem. Commun. Royal Society of Chemistry. 2015; 51(13):2589-2592.
- Corman V., Landt O., Kaiser M. et al. Diagnostic detection of Wuhan coronavirus 2019 by real-time RT-PCR. Euro Surveill. 2020; 25(3): 2000045. doi: 10.2801/1560- 1911.ES.2020.25.3.2000045.
Дополнительные файлы
