γ-Secretase in the pathogenesis of Alzheimer’s disease and therapeutic potential of its modulators

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Болезнь Альцгеймера (БА) — наиболее распространенная форма деменции [3–5, 52]. Различают 2 формы БА: наследственную (НФБА), которая развивается до 65 лет, чаще до 40–50 лет, и спорадическую (СФБА), которая развивается после 65 лет [2, 12, 72]. Двумя основными патологическими признаками БA являются амилоидные бляшки, возникающие в результате внеклеточного накопления и отложения β-амилоидных пептидов (Aβ), и нейрофибриллярные клубки, содержащие гиперфосфорилированный тау-белок в нейронах [113, 134]. БA с увеличением возраста прогрессирует медленно и, по оценкам исследователей, начинает формироваться за 20–25 лет до появления значимых симптомов заболевания [11, 12].

Согласно гипотезе амилоидного каскада, накопление амилоида Aβ в тканях головного мозга является основной причиной развития БA. Хронический дисбаланс между выработкой и скоростью выведения амилоидов Aβ приводит к повышению уровня изоформ Aβ42 с последующей олигомеризацией Aβ, образованием фибрилл и накоплением амилоида в бляшках [61]. Как олигомеры Aβ, так и амилоидные бляшки повреждают нейроны путем активации астроцитов, окислительного повреждения митохондрий и изменения активности киназы/фосфатазы с последующим образованием нейрофибриллярных клубков [61].

Мутации в гене PSEN1 обусловливают большинство случаев наследственной (семейной) формы БА, вызывая ранние патологические изменения. К настоящему времени идентифицировано 300 мутаций PSEN1, ассоциированных с этой формой БА. Кроме того, продукт гена PSEN1 пресенилин входит в комплекс γ-секретазы — фермента, который отвечает за расщепление АРР. В ходе развития нервной системы γ-секретаза также расщепляет рецептор Notch, определяющий дифференцировку клеток. При этом Notch регулирует количество нейрональных предшественников и зрелых нейронов в развивающемся мозге — это критически важно для правильного развития нервной системы. Мутации гена PSEN1 могут нарушать сигналинг Notch задолго до появления симптомов БА, причем при разных мутациях это заболевание может развиваться по разным механизмам.

Генетически унаследованные гены семейной БА (НФБA), сопровождающейся накоплением амилоида, также подтверждают роль Aβ в качестве ключевого фактора в гипотезе амилоидного каскада. В большинстве случаев НФБA мутации гена APP увеличивают соотношение изоформ Aβ42/Aβ40 и общую продукцию амилоида Aβ. Морфологически амилоидные белки как продукты миссенс-мутации (вставки или делеции) в гене PSEN в основном локализуются в трансмембранных областях или в гидрофильных петлях пресенилина в цитоплазме, что приводит к увеличению соотношения изоформ Aβ42/Aβ40 [16].

Следовательно, лекарственная терапия, направленная на снижение уровня амилоида Aβ, может быть клинически полезной для лечения БA [61]. В настоящее время терапия БA заключается в использовании ингибиторов ацетилхолинэстеразы и мемантина (антагониста N-метил-D-аспартатного рецептора) для улучшения когнитивных симптомов БA [1]. Одобренный Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (США); (US Food and Drug Administration — FDA) в 2016 г. и используемый препарат адуканумаб, нацеленный на агрегаты Aβ в головном мозге, применяется с некоторыми ограничениями [129].

ПРОЦЕССИНГ APP И AΒ

Амилоидные бляшки в тканях мозга пациентов с БA состоят из агрегированных фибрилл, состоящих из Aβ. Показано, что амилоид Aβ образуется из белка — предшественника амилоида (APP) путем его последовательного протеолитического расщепления (рис. 1). В амилоидном пути β-секретаза расщепляет предшественника амилоида APP внеклеточно с высвобождением sAPPβ и связанного с мембраной фрагмента C99, который впоследствии расщепляется γ-секретазой с высвобождением Aβ и внутриклеточного домена AICD с его последующей транслокацией в ядро [127]. По неамилоидному пути амилоидный предшественник АРР расщепляется α-секретазой с высвобождением sAPPa и связанного с мембраной фрагмента C83 (APP-CTF) [24]. Затем C83 расщепляется γ-секретазой с высвобождением субъединиц Р3 и AICD.

 

Рис. 1. Амилоидогенный и неамилоидогенный пути расщепления АРР и фрагментов С99, С83 секретазами (с изменениями по [98])

Fig. 1. Amyloidogenic and non-amyloidogenic pathways of cleavage of APP, and C99, C83 fragments by secretases (adapted from [98])

 

Однако уже на ранних этапах изучения патогенгеза БА было установлено, что основную роль в формировании амилоидных бляшек играет амилоидогенный путь расщепления АРР [43, 65, 133]. Обычно этот процесс называют γ-секретазным расщеплением АРР с высвобождением амилоидных пептидов Aβ40, Aβ42, P3 и AICD. Сайт расщепления γ-секретазой может быть дополнительно разделен на сайты γ-, ζ- и ε-расщепления [162]. γ-Сайт заканчивается на олигомерах Aβ40 или Aβ42, а AICD начинается на олигомерах Aβ49 или Aβ50. Это несоответствие с отсутствующими аминокислотными остатками привело к новой идентификации сайта ε-расщепления в Aβ49 [58, 125, 154, 163].

 

Рис. 2. Схема основных путей расщепления APP секретазами при образовании ключевых олигомеров Аβ. После расщепления APP β-секретазой, APP-CTF обрабатываются путем ε-расщепления, в результате чего образуются Aβ49 и AICD50-99 или Aβ48 и AICD49-99. Aβ49 далее расщепляется до Aβ46, и далее следует линия пептидов Aβ40: Aβ49→46→43→40→37. Процесс образования Aβ42 представляет собой последовательность шагов: Aβ48→45→42→38

Fig. 2. Main pathways of APP cleavage by secretases leading to key Aβ oligomer formation. Following APP cleavage by β-secretase, APP-CTFs undergo ε-cleavage, producing Aβ49 and AICD50-99 or Aβ48 and AICD49-99. Aβ49 is further cleaved to Aβ46, followed by the Aβ40 peptide line: Aβ49→46→43→40→37. The Aβ42 formation proceeds through Aβ48→45→42→38

 

Ответ на вопрос, происходят ли γ- и ε-расщепления последовательно или независимо друг от друга, был дан при идентификации новой позиции сайта ζ-расщепления по фрагменту Aβ46 [117, 167]. Процессинг Aβ происходит главным образом путем последовательной обрезки трипептида начиная с Aβ49 (Aβ49→46→43→40→37) до Aβ37 и последней стадией расщепления путем обрезки тетрапептида Aβ48 до Aβ38 (Aβ48→45→42→38) (рис. 2) [143].

Кроме того, другие пептиды Aβ различной длины распределяются между 2 основными линиями производства изоформ Aβ40 и Aβ42 и множеством взаимодействующих путей высвобождения три-, тетра-, пента- и гексапептидов [100, 109] (рис. 3).

 

Рис. 3. Схема образования амилоидных бляшек из амилоидных пептидов и пептидных фибрилл

Fig. 3. Amyloid plaque formation from amyloid peptides and peptide fibrils

 

Однако до сих пор физиологическая роль разных форм амилоидов Aβ в деталях не ясна. При этом показано, что размер олигопептидов Aβ, обнаруживаемых в ликворе или в тканях головного мозга, варьирует от 37 до 43 аминокислотных остатков [114, 115, 152]. Олигомер Aβ42 более склонен к агрегации и более токсичен, чем Aβ40, хотя соотношение олигомеров Aβ42 и Aβ40 в тканях головного мозга составляет приблизительно 1 : 9 [74]. Установлено, что Aβ42 является основным компонентом амилоидных бляшек [74, 122, 123], а олигомер Aβ43 присутствует в амилоидных бляшках в тканях головного мозга человека при БА [151, 155].

Структурный состав γ-секретазы

Детальными исследованиями установлено, что γ-секретаза представляет собой трансмембранный белковый комплекс из 4 субъединиц: пресенилина, никастрина, а также компонентов Aph-1 и Pen-2 (рис. 4). γ-Секретаза относится к особому классу внутримембранных аспартатпротеаз I типа (I-CliPs), расщепляющих АРР, и ее необычное расщепление перерабатывает субстраты непосредственно в липидном бислое мембран [154].

 

Рис. 4. Основные субъединицы комплекса γ-секретазы и сайты связывания ингибиторов и модуляторов γ-секретазы: а — 3D-структура комплекса: пресенилинa, никастринa, Aph-1 и Pen-2. Данные криоэлектронных микроскопических снимков, полученных G. Yang и соавт. [161]; b — каталитические аминокислотные остатки Asp257 и Asp385 обозначены как PS-NTF и PS-CTF. Пресенилин подвергается эндопротеолизу (обозначено стрелкой) и превращается в гетеродимер PS-NTF/PS-CTF

Fig. 4. Main γ-secretase complex subunits and γ-secretase inhibitor/modulator binding sites: (a) 3D structure of the complex: presenilin, nicastrin, Aph-1, and Pen-2, based on cryogenic electron microscopy data by Yang et al. [161]; (b) catalytic amino acid residues Asp257 and Asp385 labeled as PS-NTF and PS-CTF. Presenilin undergoes endoproteolysis (indicated by the arrow), converting into the PS-NTF/PS-CTF heterodimer

 

При этом γ-секретаза осуществляет последовательное расщепление субстрата C99 с образованием различных олигомеров Aβ [127]. В связи с этим γ-секретазу считают потенциальной мишенью для терапевтического лечения БA. Однако проведенные ранее исследования ингибиторов γ-секретазы показали, что это достаточно сложная задача и необходимы дополнительные исследования, чтобы полностью понять детали функционирования γ-секретазы [108].

Функциональная роль субъединиц (пресенилина, никастрина, Aph-1 и Pen-2) в общей регуляции активности γ-секретазы

По сравнению с β-секретазой γ-секретаза не является строго сайт-специфичной и расщепляет амилоид Aβ на пептиды размером 37–43 аминокислотных остатков [114, 115, 153]. При этом 3D-структура субъединицы пресенилина в составе γ-секретазы представлена 9 трансмембранными охватывающими доменами [89]. У млекопитающих пресенилин представлен 2 гомологами: PS1 и PS2, которые гомологичны на 67 % [93]. В результате детальных биохимических исследований установлено, что γ-секретаза представляет собой аспартатпротеазу с каталитическими остатками аспарагиновой кислоты в положениях 257 и 385 в трансмембранных доменах 6 и 7 пресенилина (в обеих изоформах PS1 и PS2), которые составляют функционально активный сайт γ-секретазы (рис. 4, b) [76, 146]. При образовании функциональной формы пресенилина из АРР он расщепляется эндопротеолитически между 6-м и 7-м трансмембранными доменами на N-концевой и С-концевой фрагменты (PS1-NTF и PS1-CTF). Образовавшийся гетеродимер PS1-NTF/PS1-CTF образует каталитический центр γ-секретазы [46, 68, 95]. В экспериментах установили, что более 300 мутаций семейной БA, содержащих ген PSEN, вызывали увеличение амилоидного соотношения Aβ42/Aβ40, а нокаут по гену PSEN1 снижал расщепление APP γ-секретазой и соответственно снижал продукцию амилоида Aβ [33].

Вспомогательная субъединица никастрин была обнаружена по ее связи с пресенилином методом иммуноаффинной фильтрации с использованием антител к пресенилину [167]. Было установлено, что никастрин представляет собой трансмембранный белок с большим внеклеточным доменом. Незрелый никастрин имеет размер ~110 кДа, а после процессинга при N-гликозилировании в компартментах аппарата Гольджи его молекулярная масса увеличивается до ~130 кДа [92]. Эта зрелая форма никастрина связана с активным центром γ-секретазы [9, 41, 77].

Первоначально 2 другие субъединицы, Aph-1 и Pen-2, были обнаружены путем генетического скрининга у Caenorhabditis elegans [50, 54]. Позже было показано, что Aph-1 необходим для локализации никастрина на клеточной поверхности [54], а Pen-2 требуется как для экспрессии пресенилина, так и для процессинга никастрина [134].

Экспрессия мРНК субъединиц комплекса γ-секретазы широко представлена в организме [58]. Физиологические функции субъединиц комплекса γ-секретазы изучали с использованием нокаутных мышей. Мыши с нокаутом по PS1 летальны, что приводит к дефициту передачи клеточных сигналов Notch, в то время как фенотип мышей с нокаутом по PS2 нормальный, однако двойной нокаут эмбрионов по PS1 и PS2 приводит к летальному исходу, демонстрируя серьезный дефицит у них рецепторов Notch [37, 67]. Мыши с нокаутом по никастрину продемонстрировали фенотип Notch с летальностью эмбрионов [105]. Мыши с нокаутом по Aph-1a показали эмбриональную летальность, а мыши с нокаунтом по Aph-1b/c (что эквивалентно потере Aph-1b у человека) показали снижение производства APP в тканях нескольких областей головного мозга взрослого человека [128]. Нокаутные исследования на рыбках Zebrafish показали, что субъединица Pen-2 важна для выживания нейронов и защищает их от апоптоза [21].

Был выполнен ряд исследований, чтобы установить, являются ли эти 4 субъединицы γ-секретазы существенными для ее функциональной активности. Суммарная активность γ-секретазы восстанавливалась в клетках Saccharomyces cerevisiae за счет совместной экспрессии пресенилина, никастрина, Aph-1 и Pen-2, у которых перед этим отсутствовала эндогенная активность γ-секретазы [44]. Таким образом, эти 4 субъединицы, по-видимому, необходимы и достаточны для функциональной активности γ-секретазы [40]. Этот факт также был продемонстрирован на клетках не только дрозофил, но и млекопитающих [64, 78, 165]. Совместная экспрессия всех 4 субъединиц также увеличивала гетеродимерную форму полностью гликозилированного никастрина и активность γ-секретазы в клетках млекопитающих [76]. При исследовании посмертных образцов мозга человека было показано, что γ-секретаза в них присутствует в виде высокомолекулярного белкового комплекса, содержащего пренесилин, никастрин, Aph-1 и Pen-2, и что эти белки связаны с активностью γ-секретазы [47], ингибированной специфическим ингибитором L-685,458, что позволяет предположить, что комплекс γ-секретазы, выделенный из тканей мозга человека, является функциональным [47].

Сборка функционального комплекса γ-секретазы инициируется в цистернах ЭПР [22], где взаимодействуют Aph-1 и никастрин, с последующим связыванием пресенилина. После этого Pen-2 связывается с другими элементами комплекса и облегчает эндопротеолиз пресенилина до фрагментов PS-NTF и PS-CTF, в результате чего образуется активный центр γ-секретазы [22]. В исследовании активности γ-секретазы с использованием биотинированного лиганда было подтверждено, что гетеродимеры пресенилина и зрелый никастрин совместно функционируют в активированном ферментном комплексе [13]. В эксперименте было продемонстрировано также, что синтезированные в бактериях рекомбинантные белки PS1-ΔE9 (мутация FAD с делецией экзона 9 PS1) по отдельности или PS1 с мутацией FL/Pen-2, заключенные в липосомы, обладали функциональной активностью γ-секретазы [7].

Внутриклеточное перемещение и локализация γ-секретазы

Было установлено, что при производстве Aβ из предшественника APP β-секретаза и γ-секретаза транспортируются и функционируют в субклеточных компартментах в клетках головного мозга. При этом амилоид Aβ был обнаружен в цистернах аппарата Гольджи [56] и в эндосомах [134]. Позднее установлено, что субклеточная локализация Aβ в тканях мозга в основном представлена в эндосомах [23, 142]. АРР расщепляется α-секретазой на поверхности клетки [132], в то время как расщепление при помощи β-секретазы происходит в основном на поздних стадиях в аппарате Гольджи / транспортных пузырьках и эндосомах [79]. Субъединицы γ-секретазы были обнаружены во многих субклеточных компартментах, в том числе в эндоплазматическом ретикулуме, в цистернах аппарата Гольджи, TGN, эндосомах, фагосомах и плазматической мембране [28, 51, 75, 82]. Интересно, что субъединица пресенилин была обнаружена и в компартментах синапсов [14, 42, 83, 121]. Кроме того, все 4 субъединицы γ-секретазы были обнаружены и в фагосомах [90]. S.H. Pasternak и соавт. [112]. показали, что пресенилин 1, никастрин и APP локализованы во внешнем слое мембран лизосом.

При помощи биотинированного зонда исследовались сайты активности γ-секретазы, которые были обнаружены в плазматической мембране клеток [27, 28]. Небольшая доля функционально активной γ-секретазы была обнаружена в митохондриях [60]. Находясь в обогащенных эндосомах, плазматических мембранах и синапсах, γ-секретаза функционально активна при продуцировании амилоида Aβ и AICD, кроме того, активная γ-секретаза была обнаружена в первичных нейронах коры головного мозга [31, 51, 60].

Липидный состав мембран также может влиять на активность ферментов. Поскольку γ-секретаза является трансмембранно-связанным белком, для извлечения белков из мембран и изучения секретазного комплекса использовались различные детергенты. Однако γ-секретазу также можно изучать и в мембранной среде, сохраняя некоторые из ее естественных взаимодействий с липидами. Известно, что холестерин и сфинголипиды в клеточных мембранах являются основными липидными составляющими упорядоченных микродоменов, называемых липидными рафтами (ЛР) — это динамические платформы для передачи клеточных сигналов, сортировки мембранных белков и их транспорта. Некоторые из обнаруженных в клеточной мембране компонентов свидетельствуют о том, что незаконный оборот и обработка cубстратов строго регулируются в ЛР [62, 147, 150]. Показано, что APP, β-секретаза и γ-секретаза локализуются в ЛР. При этом APP и β-секретаза, находящиеся в отдельных ЛР, могут объединяться в эндосомах, где и происходит амилоидный процессинг [39]. Активная γ-секретаза также была обнаружена в ЛР мембран клеток головного мозга [69, 147] и была активна в ЛР мембран полученных из компартментов аппарата Гольджи и эндосом [148]. Исследование функционирования γ-секретазы с различными липидными смесями показало, что состояние, подобное ЛР мембран, обеспечивает самую высокую функциональную активность γ-секретазы [110].

Высокопроизводительный функциональный геномный скрининг с использованием библиотеки кДНК FlexSelect human FL позволил выявить рецептор Р3, связанный с G-белком (GPR3) [145]. По-видимому, белок GPR3 способствует комплексной сборке γ-секретазы, что приводит к увеличению доставки субъединиц γ-секретазы и зрелого комплекса γ-секретазы на поверхность клетки и увеличению локализации их в ЛР мембраны, в конечном итоге это приводит к увеличению генерации амилоида Aβ [145]. Следовательно, специфическое ингибирование γ-секретазы в определенных клеточных органеллах или микродоменах может быть привлекательным подходом для поиска терапевтических мишеней [26, 110, 119], а закрепленная на мембране разновидность ингибитора переходного состояния β-секретазы снижает активность этого фермента [118].

Структурные особенности комплекса γ-секретазы

Основная субъединица комплекса γ-секретазы пресенилин (PS) имеет 2 гомолога, PS1 и PS2. Вспомогательная субъединица Aph-1 имеет 2 гомолога у людей, Aph-1a и Aph-1b, и один дополнительный гомолог, Aph-1c, у грызунов. Aph-1a имеет 2 альтернативно сплайсированные формы, Aph-1aL (длинная форма) и Aph-1aS (короткая форма). В общей сложности γ-секретаза может образовывать 6 различных комплексов [66].

Молекулярная масса cубъединиц γ-секретазы составляет: PS1-NTF (~30 кДа), PS1-CTF (~20 кДа), полностью гликозилированный никастрин (~130 кДа), Aph-1 (~30 кДа) и Pen-2 (~12 кДа). Молекулярная масса комплекса γ-секретазы, по расчетам, составляет ~220 кДа при стехиометрии 1 : 1 : 1 : 1 (пренесилин, гликозилированный никастрин, Aph-1, Pen-2 соответственно). Для получения и анализа комплекса использовались различные методы, в результате чего наблюдались молекулярные массы в диапазоне 200–2000 кДа [40, 44, 47, 49, 78]. Самая низкая зарегистрированная молекулярная масса комплекса составляет 200–250 кДа, что соответствует мономерному комплексу [76]. Комплекс с молекулярной массой ~440 кДа предполагает возможную стехиометрию 2 : 2 : 2 : 2 [36]. Визуализация со сверхразрешением показала, что стехиометрия 1 : 1 (PS1 : NCT) на поверхности клетки и гель BN-PAGE показали комплексы γ-секретазы при ~440 кДа [44]. В мембранах из посмертного человеческого мозга компоненты γ-секретазы были элюированы во фракции >1000 кДа [47]. Т. Satо и соавт. [126] сообщили о стехиометрии активных комплексов γ-секретазы как 1 : 1 : 1 : 1. Различия в молекулярной массе комплекса γ-секретазы могут указывать на возможности дополнительных белков, либо новых основных компонентов, либо временно связывающихся белков (γ-секретазомодулирующий белок, GSMP). Сообщалось, что молекулярная масса комплекса γ-секретазы с TMP21 составляет приблизительно 660 кДа [27]. Другой связывающий белок, GSAP, совместно элюирован с компонентами комплекса γ-секретазы при ~670 кДа [65]. Активные комплексы γ-секретазы, захваченные соединением 3, показали наличие GSMP, Hif-1α, с комплексами γ-секретазы в высокомолекулярных фракциях [149].

Каталитические сайты I-CliPs расположены в трансмембранных областях, они гидролизуют пептидные связи своих субстратов в этих же трансмембранных областях [49]. Семейство I-CliP можно разделить на аспартатные протеазы (включая γ-секретазу и сигнальную пептидазу), металлопротеазы (сайт-2 протеаза Eep) и сериновые протеазы (ромбовидная, AarA) [80].

Исследование 3-мерной структуры γ-секретазы с помощью электронной микроскопии показало, что в комплексе имеется внутренняя камера низкой плотности и 2 поры (апикальная и базальная), которые обеспечивают проникновение молекул воды в структуру фермента [106]. Поры для молекул воды могут объяснить это необычное внутримембранное расщепление (гидролиз пептидных связей) γ-секретазой [90]. Aβ и AICD могут высвобождаться через 2 поры во внешние пространства (внеклеточное и цитозольное пространства соответственно) [90]. В 2015 г. одночастичная криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) выявила атомную структуру γ-секретазы в свободном от субстрата состоянии с разрешением 3,4 Å [8]. В последние годы крио-ЭМ-структуры комплекса γ-секретазы, связанного либо с APP (C83) с разрешением 2,6 Å, либо с Notch (Notch-100) с разрешением 2,7 Å, показали, что PS1 претерпевает конформационные изменения при связывании с субстратом [164, 172, 173]. Связанная с субстратом γ-секретаза показала, что β-цепь с С-конца APP вместе с 2 APP-индуцированными β-цепями PS1 образует гибридный β-слой, который направляет расщепление γ-секретазы для захвата субстратов [169].

Никастрин действует как привратник перед проникновением субстратов к активным сайтам γ-секретазы, блокируя субстраты с длинными внеклеточными доменами [17]. APP может проникать, полностью или частично, в сайт стыковки субстрата между PS-NTF и PS-CTF для доступа к внутреннему активному сайту [156]. Другими словами, после того как субстрат связывается с сайтом стыковки на PS, субстрат перемещается в сайты S1’, S2’ и S3’ (три кармана связывания субстрата) в активном сайте PS путем латерального стробирования, и образуются длинные пептиды Aβ [156]. Затем длинные пептиды Aβ расщепляли путем обрезки трипептида (Aβ49→46→43→40→37 или Aβ48→45→42→38) с высвобождением коротких пептидов Aβ [143] (рис. 5).

Особенности субстратов γ-секретазы

В настоящее время установлено, что γ-секретаза взаимодействует с более чем 140 субстратами, включая основные APP и Notch, которые представляют собой трансмембранные белки 1-го типа [59, 68]. Наиболее изученные субстраты включают APLP1 и APLP2, которые вместе с APP регулируют синаптическую пластичность и возбудимость нейронов, а также белки, участвующие в клеточной адгезии (N-кадгерин, E-кадгерин, CD44), рецептор CSF1 (протеинтирозинкиназа), рецептор Netrin-1, белок ErbB4 (зависимая от фактора роста рецепторная тирозинкиназа), белок, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (эндоцитарный рецептор), Нектин-1α (способствует образованию адгезивных соединений), Notch 1–4 (сигнальные рецепторы), Dеltа и Jagged (лиганды для Notch), р75 (корецептор нейротрофина), синдекан-3 (корецептор протеогликана клеточной поверхности) и множество других малоизученных субстратов [37, 69, 80, 91]. Расщепление γ-секретазой зависит не от конкретной последовательности субстрата, а, скорее, от вырезания эктодомена из конкретного субстрата [139]. Во многих случаях внутриклеточные домены (ICD), высвобождающиеся при расщеплении γ-секретазой, участвуют в регуляции транскрипции генов [80].

 

Рис. 5. Активация рецептора Notch (c изменениями по [80]). Лиганды Notch (Delta, Jagged) из клеток, передающих сигнал, связываются с рецепторами Notch (Notch 1–4) в клетках, принимающих сигнал. Notch подвергается высвобождению эктодомена металлопротеазами ADAM (ADAM10, TACE) на внеклеточном участке S2 (расщепление в позиции S2). Связанный с мембраной отсеченный фрагмент NotchΔE в качестве субстрата γ-секретазы дополнительно расщепляется протеазой в позиции S3 (расщепление S3), при этом высвобождаются фрагмент Nβ и внутриклеточный фрагмент NICD, который транслоцируется в ядро и регулирует транскрипцию целевых генов Hes и Hey

Fig. 5.Notch receptor activation (adapted from [80]). Notch ligands (Delta, Jagged) from signal-transmitting cells bind to Notch receptors (Notch 1–4) on signal-receiving cells. Notch undergoes ectodomain shedding by ADAM metalloproteases (ADAM10, TACE) at the extracellular S2 site (S2 cleavage site). The membrane-bound truncated NotchΔE fragment then serves as a γ-secretase substrate, undergoing further proteolytic cleavage at S3 (S3 cleavage), releasing Nβ and the intracellular NICD fragment, which translocates to the nucleus and regulates Hes and Hey gene transcription

 

Один из хорошо известных субстратов γ-секретазы, Notch, подвергается высвобождению эктодомена металлопротеазой в сайте S2, который далее расщепляется γ-секретазой в сайте S3 и высвобождает из Notch∆Е внутриклеточный домен NICD [80] (рис. 5).

Редкие генетические варианты TREM2 (например, R47H) связаны с БA [57]. Поверхностный рецептор микроглии TREM2 и его адаптерный белок DAP12 (TYROBP) передают сигналы TREM2, что способствует фагоцитозу [57]. Сообщалось, что после того, как TREM2 подвергается выделению эктодомена ADAM10, TREM2-CTF может расщепляться γ-секретазой в клетках [161]. Процессинг нескольких субстратов γ-секретазой исследовали на предмет образования ICD и накопления фрагментов субстрат-С-конца (CTF) методом вестерн-блоттинга [15]. В идеальном случае анализ in vitro может подтвердить расщепление субстрата [59]. Структурно область β-цепей нескольких субстратов (CD43, CD44, N-кадгерина, ErbB4 и CD33) была выровнена с последовательностями β-цепей APP и Notch [161]. CD43 и CD44 очень похожи на Notch 1, тогда как N-кадгерин, ErbB4 и CD33 имеют сходные характеристики с APP (фрагмент C99) [161].

Регуляция каталитической активности пресенилина

Общей особенностью мутаций в генах PSEN1 или PSEN2 при семейной БА (FAD) является повышенное соотношение олигомеров Aβ42/40. Обсуждается функциональное значение пресенилина, и связано ли оно с усилением или потерей основной функции пресенилина [34]. Увеличение соотношения Aβ42/40 может быть обусловлено повышенной продукцией олигомера Aβ42, сниженной продукцией олигомера Aβ40 или сочетанием того и другого [15]. Анализ образования субстратных CTF, ICD и разновидностей Aβ как эффекта FAD-мутаций гена PSEN1 или гена PSEN2 на расщепление различных субстратов γ-секретазы, таких как APP, Notch, синдекан-3, N-кадгерин и β1-интегрин, показал, что различные мутации по-разному влияют на процессинг субстрата, указывая на «переменную» или «частичную» потерю функции белка пресенилина, причем PS2 был менее эффективным, чем PS1 [15]. Восстановление субъединицы пресенилина с помощью Aph-1aL, содержащей γ-секретазу, в основном снижало продукцию олигомеров Aβ42 и Aβ40, но увеличивало соотношение Aβ42/Aβ40, а наличие 138 мутаций PS1 FAD предполагало потерю функции PS1 [141]. Изучая подробно эти 138 мутаций PS1 FAD, исследователи показали, что разные мутации демонстрируют разные вариации в продукции олигомеров Aβ42 или Aβ40 (увеличение или уменьшение) [141]. Авторы сделали вывод, что необходимо продолжить изучение того, как влияют мутации PS FAD на структуру γ-секретазы и как эти конформационные изменения могут влиять на расщепление γ-секретазой различных субстратов. Например, продемонстрировано, что мутация E280 в PS1 образует водородные связи с соединениями Y159 и Y154 [173], PS1 с мутацией E280A (колумбийская мутация) разрушает водородные связи и вызывает локальное конформационное изменение пресенилина [173].

 

Рис. 6. Перспективы терапевтических стратегий для эффективного лечения болезни Альцгеймера

Fig. 6. Future therapeutic strategies for effective Alzheimer’s disease treatment

 

В норме активированная γ-секретаза расщепляет АРР с высвобождением амилоидов Aβ. Известно, что при воспалительных состояниях и инфекциях провоспалительные цитокины индуцируются микроглией и астроцитами и усиливают экспрессию белка IFITM3 в астроцитах и в нейронах, что, в свою очередь, увеличивает процессинг фрагмента C99 активными комплексами IFITM3-γ-секретаза с образованием изоформ Aβ40 и Aβ42. Таким образом, главная цель разработок новых лекарственных средств для лечения БА состоит в том, чтобы иметь мишенью γ-сeкретазу (рис. 6).

Терапевтический потенциал γ-секретазы

Значительный вклад в изучение перспективности γ-секретазы в качестве мишени для разработки лекарственных средств для лечения БА внесла группа исследователей во главе с известным фармкологом B. De Strooper [35, 129].

Ингибитoры γ-секретазы. Ингибиторы γ-секретазы блокируют ее активность при связывании с активным сайтом пресенилина и ингибируют функцию расщепления, тем самым снижая общую продукцию Aβ. Для изучения активности γ-секретазы широко использовались ингибиторы, прежде всего L-685,458 [95, 129], BrA-1-Bt [45], III-31C [45], DAPT [39], imatinib [25, 73], begacestat [99], Merck C [13], а также химические зонды на основе ингибиторов. Фотоаффинный зонд, включенный в ингибитор, позволил продемонстрировать, что менее чем 14 % пресенилина 1 включено в активные комплексы γ-секретазы и каталитически активно, в то время как остальная часть субъединиц пресенилина 1 остается неактивной в комплексах γ-секретазы [84]. Таким образом, химические зонды, включенные в ингибиторы, имеют решающее значение для дифференциации ферментативно активных комплексов γ-секретазы от неактивных [107]. С другой стороны, исследование совместной иммунопреципитации против компонентов комплекса γ-секретазы также хорошо выявляет как активные, так и неактивные комплексы γ-секретазы.

В исследованиях на животных было показано, что ингибиторы γ-секретазы успешно снижали выработку Aβ. В частности, ингибитор DAPT снижал уровни Aβ в плазме, ликворе или в тканях головного мозга трансгенных мышей с БA [39, 86]. Продолжительное (хроническое) лечение ингибитором LY-411,575 трансгенных мышей с БA понижало уровень амилоидов Aβ, одновременно с этим ингибировалась передача сигналов Notch, что вызывало побочные эффекты [157]. Однако введение семагацестата (LY-450,139) и авагацестата (BMS-708,163) мышам фенотипа Tg2576 вызывало снижение продукции Aβ при одновременном увеличении образования фрагментов APP-CTF [120]. Введение этих ингибиторов мышам дикого типа нарушало их нормальные когнитивные способности [102], однако введение бегацестата (GSI-953) мышам фенотипа Tg2576 снижало у них уровень Aβ [99].

Нацеливание на γ-секретазу в качестве терапевтической стратегии для лечения БА является сложной задачей из-за наличия большого количества субстратов γ-секретазы. Функционально γ-секретаза расщепляет интегральные трансмембранные белки I типа после удаления их эктодоменов. Несмотря на то что в настоящее время уже зарегистрировано более 149 предполагаемых субстратов γ-секретазы [59], главные субстраты APP и Notch являются наиболее охарактеризованными. Передача сигналов Notch имеет решающее значение в судьбе клеток во время развития, поддержания и дифференцировки нейрональных стволовых клеток [4, 69]. После расщепления фуриноподобной протеазой металлопротеаз Гольджи и ADAM в позициях S1 и S2, Notch расщепляется γ-секретазой в позиции S3 (аналогично позиции ε-расщепления APP) с высвобождением внутриклеточного домена Notch, который транслоцируется в ядро и затем действует как фактор транскрипции для активации различных генов-мишеней [33].

В клинических испытаниях ингибиторов семагацестата (LY-450 139) (Eli Lilly, США) и авагацестата (BMS-708,163) (Bristol-Myers Squibb, США) на пациентах с БА вызывало у них снижение выработки Аβ [38, 125]. Однако наличие большого количества субстратов γ-секретазы затрудняет разработку клинически полезных ингибиторов. Кроме того, снижение передачи сигналов Notch и накопление фрагментов APP-CTF [102], а также появление побочных эффектов, включая риск рака кожи и инфекции, желудочно-кишечные кровотечения и ухудшение когнитивных функций, привели к приостановке дальнейших клинических испытаний этих ингибиторов [35, 38, 131]. Был сделан вывод, что такие ингибиторы являются неселективными и ингибируют не только APP, но и сигналы Notch [38, 131, 157]. В отдельных исследованиях представлены данные, что авагацестат является «Notch-щадящим» ингибитором, и даже было показано, что он обладает более высокой селективностью в отношении APP по сравнению с расщеплением Notch [53]. Однако позже было высказано предположение, основанное на низкой «Notch-щадящей» активности, что авагацестат является неселективным [30, 102], несмотря на наличие сайта связывания для PS1-NTF [30]. Другой «Notch-щадящий» ингибитор, бегацестат (GSI-953), был использован в ходе фазы I клинического испытания, но причины последующей отмены этих исследований неясны [70]. Важная проблема, связанная с лечебным применением ингибиторов γ-секретазы, — появление эффекта восстановления уровня производства токсичных амилоидов Aβ после отмены препарата. Причем применение этих ингибиторов в более низких дозах вызывало повышение выработки Aβ, но после прекращения терапевтического лечения наблюдалось восстановление исходных уровней Aβ [85, 87]. Тем не менее эти ингибиторы γ-секретазы были повторно использованы для лечения рака, а также для ингибирования передачи сигналов Notch, и в настоящее время проходят клинические испытания именно с этой целью [30].

Модуляторы γ-секретазы. Таким образом, вместо ингибирования общей активности комплекса γ-секретазы были протестированы препараты, модулирующие активность отдельных ее субъединиц, которым дали название «модуляторы γ-секретазы» [71]. По мнению исследователей, модуляторы являются более привлекательными соединениями, модифицирующими заболевание, чем ингибиторы, так как:

• избирательно ингибируют продукцию Aβ42, склонную к агрегации;
• увеличивают производство более коротких изоформ Aβ37 и Aβ38;
• не влияют на общую продукцию Aβ и накопление фрагментов APP-CTF;
• сохраняют процессинг сигналов Notch [102].

В результате таких исследований было обнаружено, что нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), такие как ибупрофен, индометацин и сульфид сулиндака, модулируют активность γ-секретазы и представляют собой модуляторы первого поколения [102]. Они понижали уровень производства пептидов Aβ42 и повышали уровень производства пептидов Aβ38, не влияя на расщепление Notch [153]. Установлено, что эта модуляция амилоидов Aβ не была обусловлена ингибированием активности циклооксигеназы, известной фармакологической мишени препаратов НПВП [153]. При лечебном применении сульфида сулиндака была показана различная степень снижения уровня амилоида Aβ42 при одновременном увеличении повышенных уровней Aβ38 в клетках, сверхэкспрессирующих мутантный пресенилин PS1 семейной БA [111].

Для повышения лечебной эффективности in vivo и улучшения проникновения соединений в кровь и мозг были разработаны модуляторы второго поколения, включая GSM карбоновой кислоты на основе НПВП, имидазола на основе НПВП, а также модуляторы естественного происхождения [153]. Исследователи показали, что кислые модуляторы снижают Aβ42, повышают Aβ38 и оказывают незначительное влияние на уровни Aβ40, общие уровни Aβ и выработку NICD [36]. GSM-1 (кислые GSM, GSM-2 и GSM-10h как близкие аналоги) снижали Aβ42 в клетках с мутациями PS, но не снижали уровень Aβ42 в клетках, сверхэкспрессирующих мутации PS1 L166P или PS2 N141I [81, 111]. Модулятор GSM-2 улучшал память у мышей фенотипа Tg2576 и не влиял на когнитивные способности у мышей дикого типа [101]. Острое и субхроническое введение GSM-10h снижало Aβ42 без влияния на передачу сигналов Notch, отсутствовал эффект отскока Aβ и накопления APP-CTF (C83 и C99) [63, 94]. E2012 (имидазол GSM) снижал Aβ42, Aβ40 и Aβ39 и немного повышал Aβ37 и Aβ38, не влияя на процессинг Notch [18].

Клинические испытания ингибиторов и модуляторов γ-секретазы

Расширенные клинические испытания ингибиторов γ-секретазы не выявили в них существенного лечебного эффекта из-за неселективного ингибирования (как установили позже, из-за подавления сигнализации Notch). Применение семагацестата и авагацестата является одним из наиболее широко известных примеров отсутствия приемлемого эффекта (рис. 7). В связи с этим использование семагацестата (препарат LY-450,139) было прекращено в фазе III из-за повышенного риска развития рака кожи, связанного с ингибированием передачи сигналов Notch1, сопровождавшегося ухудшением когнитивных функций у пациентов с БА [38, 102, 106]. Причем применяемые дозировки, высокая концентрация семагацестата, вводимого 1 раз в день, и его кинетика, вероятно, приводила к «всплескам» полной инактивации, что вызывало ингибирование Notch и других субстратов [36].

 

Рис. 7. Структура ингибиторов γ-секретазы, применяемых в клинических испытаниях для лечения болезни Альцгеймера

Fig. 7. Structure of γ-secretase inhibitors in clinical trials for Alzheimer’s disease

 

На ранней стадии исследований авагацестат (BMS-708,163) упоминается как «Notch-щадящий» ингибитор. Однако последующее применение препарата при лечении БА было прекращено в фазе II из-за повышенного риска развития рака кожи и желудочно-кишечных расстройств [8, 29, 53]. Специфичность авагацестата в отношении APP и Notch также была поставлена под сомнение [10, 30]. Несмотря на то что применение для лечения БА не увенчалось успехом в клинических испытаниях из-за ингибирования передачи сигналов Notch, несколько таких ингибиторов были использованы в клинических испытаниях для лечения различных видов раковых заболеваний [48, 88, 140]. Кроме того, использование их в качестве химических зондов оказалось ценным методом для улучшения нашего понимания структуры и регуляции γ-секретазы [107]. В эксперименте на моделях мышей визуализирующий зонд на основе семагацестата продемонстрировал его высокую специфичность и повышенное поглощение опухолевыми клетками, что предполагает, что такие индикаторы на основе ингибиторов γ-секретазы могут быть использованы для целевого мониторинга действия препаратов-ингибиторов γ-секретазы и регистрации клинических реакций [107].

Особенности действия препаратов-модуляторов γ-секретазы

Переход от общего ингибирования к тонкой модуляции γ-секретазы привел к разработке новых лечебных препаратов-модуляторов γ-секретазы (MГС). S. Weggеn и соавт. [151] впервые охарактеризовали подвиды НПВП, включая ибупрофен, индометацин, таренфлурбил и сулиндак сульфид, которые избирательно снижают уровень бляшкообразущей изоформы Aβ42 в пользу более короткой и менее бляшкообразущей изоформы Aβ38 без ингибирования сигнализации Notch (рис. 8).

 

Рис. 8. Структура препаратов-модуляторов γ-секретазы первого поколения

Fig. 8. Structure of first-generation γ-secretase modulators

 

Эти эффекты были отделены от ингибирующих эффектов активности циклооксигеназы и поэтому считаются модуляторами первого поколения. Однако эти НПВП показали в эксперименте слабую эффективность, а также плохое проникновение в ткани мозга и применялись в клинических испытаниях с ограниченным успехом [32]. Таренфлурбил (R-флурбипрофен) с Aβ42 IC50 ~200–300 мкМ замедлял снижение когнитивных функций у пациентов с легкой формой БА в фазе II, но не достигал клинического результата в фазе III [55].

Для улучшения лечебных эффектов таких препаратов разработаны модуляторы второго поколения. Их подразделяют на 2 категории:

1. MГС, полученные из НПВП на основе карбоновой кислоты;
2. гетероциклические MГС (рис. 9).

Этапы разработки модуляторов второго поколения подробно рассмотрены в ряде публикаций [20, 32, 101]. Обобщая их данные, отметим, что модуляторы на основе карбоновой кислоты снижают уровень амилоидов изоформ Aβ42, не влияя на Aβ40, и одновременно повышают уровень амилоидов Aβ38. С точки зрения химической структуры они были разработаны путем замены основного арильного кольца на пиперидиновое кольцо и оптимизации заместителей на пиперидине для получения серии модуляторов на основе пиперидина уксусной кислоты (см. рис. 9).

 

Рис. 9. Структура модуляторов γ-секретазы второго поколения

Fig. 9. Structure of second-generation γ-secretase modulators

 

Гетероциклические модуляторы снижают уровни Aβ40 и Aβ42, одновременно повышая уровни Aβ37 и Aβ38. E2012 стал первым не относящимся к НПВП модулятором, испытания которого были проведены в клинических условиях.

Дальнейшее лечение пациентов этим препаратом было временно приостановлено из-за появления катаракты на глазах животных в ходе 13-недельного исследования безопасности на крысах, но после того, как в последующих расширенных исследованиях безопасности на крысах и обезьянах не было обнаружено глазной токсичности, клинические исследования было разрешено продолжить [103]. E2012 дозозависимо снижал уровни Aβ40 и Aβ42 в плазме крови у здоровых пациентов [97], но исследование не было продолжено. Соединение обладает ключевой арилимидазольной частью, которая с тех пор послужила основой для синтеза других модуляторов на основе имидазола (см. рис. 5) [20, 101]. Промышленные группы также исследовали каркасы вне арилимидазола для улучшения лечебных свойств, подобных лекарственному средству [18, 114]. Общие проблемы при разработке низкомолекулярных модуляторов — повышение эффективности и проникновение в мозг при одновременном снижении высокой липофильности, ингибирование цитохрома Р (CYP) и генов, связанных с эфиром человека (hERG) [20, 101]. На рис. 10 представлены несколько перспективных препаратов-модуляторов. В фармацевтической компании Pfizer (Германия) изучили препарат PF-06648671, полученный из бициклических пиридинонов, в 3 клинических испытаниях фазы I [6]. При однократном приеме в течение 14 дней и многократном увеличении суточных доз у здоровых нормальных субъектов пероральный ГСМ хорошо переносился. PF-06648671 дозозависимо снижал концентрации Aβ40 и Aβ42 в ликворе и повышал концентрации Aβ37 и Aβ38 без изменения общего содержания Aβ в ликворе [6]. Эти результаты подтверждают необходимость исследования дозирования PF-06648671, однако дальнейшие клинические разработки в настоящее время неизвестны.

Исследователи H.D. Soares и соавт. и сотрудники фирмы Bristol-Myers Squibb (США) в 2016 г. представили данные о разработке и исследованиях клинической фазы I модулятора BMS-932,481 (бициклический пиримидин) [19, 135] (риc. 10). Исследования однократного и длительного ежедневного приема препарата продемонстрировали дозозависимое увеличение содержания амилоидов Aβ37 и Aβ38 в ликворе и соответствующее снижение содержания Aβ40 и Aβ42 в ликворе без изменений общего содержания β-амилоида. Однако при испытаниях наблюдалось повышение уровня аланинаминотрансферазы, что указывало на токсичность препарата для печени, поэтому дальнейшая разработка BMS-932,481 была прекращена [141]. В 2020 г. исследователи Y. Zhang и соавт. [166], изучая препарат BMS-932,481 обнаружили один из продуктов его окисления, который был ими идентифицирован как основной метаболит в микросомах печени крысы и человека. Авторы выдвинули гипотезу, что превращение препарата BMS-932,481 в этот метаболит приводит к образованию побочных реакционноспособных частиц, которые и вызывают повреждение печени. Пока нет данных о разработке других производных модуляторов из этой группы.

В результате сотрудничества ученых Калифорнийского университета в Сан-Диего и врачей Массачусетской больницы был синтезирован и охарактеризован ряд модуляторов — производных пиридазина [124]. Лучший из этих препаратов UCSD-776,890 снижал уровень пептидов Aβ40 и Aβ42 дозозависимым образом при использовании острых, субхронических и хронических доз для лечения пациентов с различными формами БА. В экспериментах на животных при моделировании БА этот препарат вводили трансгенным мышам для профилактики и модификации заболевания по схеме, на 3-й и 6-й месяц выраженной симптоматики БA. Показали, что препарат UCSD-776,890 снижал уровень Aβ40 и Aβ42 в плазме и мозге животных, а также отложения амилоида в микроглии. На основе сравнения системного воздействия предположили, что этот препарат при 50 % эффективной эквивалентной дозе для человека будет иметь более чем 130-кратный запас безопасности. Эти исследования продемонстрировали возможность безопасного введения низкомолекулярных модуляторов в качестве вторичной профилактики генетически предрасположенным к БА людям или субъектам из группы риска, у которых выявлен амилоидоз, основанный на PET-визуализации [107]. В настоящее время препарат UCSD-776,890 подготовлен к первой фазе клинических исследований.

Способность визуализировать амилоид в РЕТ-пробе в качестве биомаркера в головном мозге и ликворе у людей имеет решающее значение для мониторинга хода клинических исследований при лечении БА [107]. Y. Xu и соавт. [160], используя препараты на основе модулятора BPN-15606, продемонстрировали хорошее поглощение препаратов мозгом и селективность для визуализации активности пресенилина 1 / γ-секретазы в мозге трансгенных мышей при моделировании БA. Повышенное поглощение препарата мозгом мышей с БA наблюдалось в нескольких критически важных областях, включая кору, гиппокамп и средний мозг, по сравнению с мозгом мышей дикого типа. Интересно, что исследования визуализации амилоида в мозге грызунов и человеческих приматов выявили перекрывающиеся области более высокого поглощения, указывающие на сохранение активности γ-секретазы. Таким образом, зонд на основе модулятора является ценным инструментом молекулярной визуализации, который может быть применен для дальнейшего изучения физиологической структуры и функции γ-секретазы и потенциально оптимизирован в качестве рентгенологического индикатора для пациентов с БА.

Снимки комплексов γ-секретазы с помощью криоэлектронной микроскопии — ключевые источники информации для разработки лекарственных средств

Детальные снимки, полученные с помощью метода крио-ЭМ, позволили получить подробные структурные особенности комплекса γ-секретазы с четким назначением трансмембранных доменов и точным расположением активного сайта [8, 161, 169]. Структурные сайты γ-секретазы, связанные с APP и Notch, выявили ключевые особенности распознавания субстрата ферментом. При перемещении в активный сайт α-спираль субстратного трансмембранного домена раскручивается и вытягивается в β-цепь, готовясь к протеолитическому расщеплению. Сравнение сайта 2 связанных структур, APP и Notch, показало заметные различия в распознавании APP и Notch, что может быть использовано в качестве основы для разработки субстратно-селективных ингибиторов.

В работе G. Yang и соавт. [161] представлены данные о структурах комплекса γ-секретазы, связанных с семагацестатом, авагацестатом L458 и GSM E2012. Идентификация сайтов их связывания помогла уточнить распознавание и молекулярные механизмы этих небольших молекул. Семагацестат, авагацестат и L458 занимают один и тот же связывающий карман в PS1 (см. рис. 8) и перекрываются β-цепью APP и Notch. Их расположение позволяет предположить, что ингибиторы блокируют привлечение субстрата в каталитический сайт. Вытеснение β-цепи субстрата может быть ключевой стратегией для разработки более селективных к субстрату ингибитора γ-секретазы. Ключевые различия также наблюдались в распознавании структурно различных ингибиторов. При сравнении семагацестата и авагацестата, связывание более объемного авагацестата вызывало больше конформационных изменений в PS1, чем связывание семагацестата. Кроме того, L458 напрямую координировался с каталитическими остатками аспартата в PS1, подтверждая его роль в качестве ингибитора переходного состояния.

Ранее было известно, что E2012 связывается с аллостерическим сайтом PS1 и усиливает связывание L458 [116]. Распознавание E2012 продемонстрировало наличие метилимидазольной и фенильной групп, расположенных в гидрофобном кармане между PS1 и NCT. E2012 был стабилизирован водородной связью между метилимидазолом и Tyr106 на петле-1 PS1 [97] (см. рис. 9). Известно, что петля-1 взаимодействует с белками-субстратами и координирует работу сайта стыковки субстрата и каталитического сайта, что позволяет предположить, каким образом модуляторы γ-секретазы могут влиять на активный сайт γ-секретазы. Параллельные исследования мутагенным анализом показали, что петля-1 необходима для процессивного расщепления γ-секретазы и критического сайта связывания гетероциклическими структурами модуляторов [96].

 

Рис. 10. Структура модуляторов γ-секретазы, проходящих клинические испытания в последние годы

Fig. 10. Structure of γ-secretase modulators in recent clinical trials

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время препараты-модуляторы активно разрабатываются в качестве перспективного метода лечения БА [32], во всяком случае в исследованиях на животных показано, что эти препараты могут обеспечить преимущества перед обычными ингибиторами γ-секретазы [102]. Следует отметить, что и другие методы лечения на основе механизма патогенеза БА, включая иммунотерапию и восстановление механизма аутофагии, также продолжают изучаться на разных стадиях БА [144, 149]. В дополнение к экспериментальным исследованиям недавно были представлены доказательства, что обнаруживаемый в спинномозговой жидкости больного спектр амилоидных пептидов, продуктов γ-секретазы, может служить биомаркером БА [32]. Несомненно, лучшее понимание роли γ-секретазы в механизме патогенеза БА будет способствовать открытию не только надежных биомаркеров, но и эффективных и безопасных методов лечения. Многофакторные уровни регуляции γ-секретазы, которые появляются в настоящее время, могут улучшить наши возможности по разработке таргетных методов лечения БА.

Следует отметить также перспективность исследований по поиску новых иммуномодуляторов (например, леканемаба, адуканумаба [130, 136, 146]), применяемых на ранних стадиях развития БА. Необходимо продолжить работы по выяснению влияния модуляторов секретазы и пресенилина на процессинг других естественных субстратов γ-секретазы.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Личный вклад каждого автора: В.Н. Вильянинов, В.И. Ващенко — написание статьи, анализ данных; В.И. Ващенко, П.Д. Шабанов — редактирование статьи, разработка общей концепции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFO

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. The contribution of each author: V.N. Velianinov, V.I. Vashchenko — manuscript drafting, writing and pilot data analyses; V.I. Vashchenko, P.D. Shabanov — paper reconceptualization and general concept discussion.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

About the authors

Vladimir N. Vilyaninov

Kirov Military Medical Academy

Email: vilyaninov@mail.ru

MD, Cand. Sci. (Medicine), Assistant Professor

Russian Federation, 6, Akademika Lebedeva st., Saint Petersburg, 194044

Vladimir I. Vashchenko

Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: vladimir-vaschenko@yandex.ru

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, 6, Akademika Lebedeva st., Saint Petersburg, 194044

Petr D. Shabanov

Kirov Military Medical Academy

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-code: 8974-7477

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, 6, Akademika Lebedeva st., Saint Petersburg, 194044

References

Supplementary files