Ghrelin levels in different brain regions in  Danio rerio  exposured to stress

Alexandra A. Blazhenko; Блаженко Александра Александровна; Platon P. Khokhlov; Хохлов Платон Платонович; Andrei A. Lebedev; Лебедев Андрей Андреевич; Eugenii R. Bychkov; Бычков Евгений Рудольфович; Sergei V. Kazakov; Казаков Сергей Владимирович; Petr D. Shabanov; Шабанов Петр Дмитриевич

doi:10.17816/phbn267375

Ghrelin levels in different brain regions in Danio rerio exposured to stress

Authors: Blazhenko A.A.¹, Khokhlov P.P.¹, Lebedev A.A.¹, Bychkov E.R.¹, Kazakov S.V.¹, Shabanov P.D.¹
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
Issue: Vol 13, No 3 (2022)
Pages: 37-42
Section: Neuropsychopharmacology
URL: https://journals.eco-vector.com/1606-8181/article/view/267375
DOI: https://doi.org/10.17816/phbn267375
ID: 267375

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

BACKGROUND: Literature data indicated that ghrelin may be a stress neuropeptide in some animals, including Danio rerio.

AIM: The aim of the study was to measure the levels of ghrelin in Danio rerio brain (forebrain, midbrain, and hindbrain) after predator exposure (predator stress test) and administration of ghrelin and oxytocin antagonists to assess the role of ghrelin in stress response.

MATERIALS AND METHODS: The study used 68 Danio rerio, one predator of Cichlasoma nicaraguensis. Ghrelin levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay. The following pharmacological agents were used: 1) ghrelin antagonist hexapeptide [D-Lys3]-GHRP-6 (Tocris, UK); 2) recombinant peptide analog of ghrelin — agrelax — with a molecular weight of 3.5 kDa, developed at the IEM (both compounds in equal dosages of 0.333 mg/L); corticoliberin (Tocris) at a dosage of 0.4 mg/L; and oxytocin (Gedeon Richter, Hungary) at a dosage of 3.8 µL (0.005 IU/µL) per 50 mL of aquarium water (0.019 IU/L).

RESULTS: In the control group, ghrelin level was determined only in the hindbrain, and ghrelin levels in the forebrain and midbrain were <4 pg/mg of total protein. Contact with a predator led to a significant increase in ghrelin levels in the forebrain and midbrain, but not in the hindbrain. Thus, in fish forebrain, ghrelin levels increased to 966 ± 12 pg/mg of protein, which is almost a 250-fold increase in the indicator compared with the level in intact animals. In the presence of agrelax, [D-Lys3]-GHRP-6, and oxytocin, ghrelin levels in the forebrain and midbrain of stressed fish decreased approximately equally to 88 ± 3, 97 ± 1, and 115 ± 1 pg/mg protein, respectively.

CONCLUSION: Thus, stress exposure (contact with a predator) significantly increases ghrelin levels in the forebrain and midbrain but decreases in the hindbrain. Stress-protective peptides (oxytocin, [D-Lys3]-GHRP-6, and agrelax) decreased ghrelin levels in the forebrain and midbrain, and to a lesser extent, in the hindbrain when exposed to stress.

Keywords

Danio rerio, brain, ghrelin, stress, oxytocin, agrelax, [D-Lys3]-GHRP-6

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Различные факторы могут привести к нарушению психического здоровья. Значительная доля людей подвержена тревожным, депрессивным, вызванным стрессом расстройствам. Согласно исследованиям Всемирной организации здравоохранения, в будущем число этих расстройств будет только увеличиваться [1]. Точная причина неизвестна, у некоторых людей они могут появиться без каких-либо стрессовых ситуаций, но у других любой стресс может спровоцировать это состояние [2]. Были предложены различные виды животных моделей для исследования механизмов тревоги и депрессии, но в основном использовались грызуны [3]. Однако, по данным литературы, одна из лучших моделей животных для этой цели — Danio rerio [4]. Доказано, что Danio rerio обладает консервативной нервной системой и является хорошей моделью для тестирования эмоционального и мотивационного поведения, включая реакции на психоактивные вещества [5]. У Danio rerio грелин представляет собой консервативную структуру, именно поэтому мы выбрали эту модель для нашего эксперимента. Согласно литературе, грелин может быть биомаркером стресса [6]. Грелин обладает как анксиолитическим, так и анксиогенным эффектом и играет двойную роль в модуляции тревожного поведения.

Цель исследования — измерить уровень грелина в головном мозге Danio rerio (переднем, среднем и заднем мозге) после воздействия хищника (стресс-тест с хищником) и после введения антагонистов грелина и окситоцина, чтобы оценить функцию грелина в реакции на стресс.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В нашем исследовании было использовано 68 особей Danio rerio, один хищник Cichlasoma nicaraguensis. Рыб содержали при нормальной комнатной температуре (22–23 °C) со стандартным временем кормления (2 раза в день). Уровень грелина измеряли тестом ELISA. Хирургическим путем выполнен забор головного мозга Danio rerio. После этого был изготовлен материал для иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве фармакологических агентов использовали два антагониста грелина: 1) гексапептид [D-Lys3]-GHRP-6 (Tocris, Великобритания); 2) рекомбинантный пептидный аналог грелина с молекулярной массой 3,5 кДа, который разработан в ФГБНУ «ИЭМ», рабочее название «агрелакс». Оба соединения использовали для инкубации в равных дозировках 0,333 мг/л. Кортиколиберин (КРГ; Tocris, Великобритания) применяли в дозировке 0,4 мг/л при инкубации или 0,0004 мкг/мкл в случае внутрисосудистого введения. Окситоцин (Gedeon Richter, Венгрия) использовали в дозировке 3,8 мкл (0,005 МЕ/мкл) на 50 мл аквариумной воды (0,019 МЕ/л). В качестве внутривенного контроля вводили 1 мкл 0,9 % раствора хлорида натрия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У интактных рыб уровень грелина в переднем мозге Danio rerio, определенный с помощью ИФА, не превышал 4 пг/мг, то есть по сути находился за пределами чувствительности тест-системы. Поэтому у рыб инициировали стрессовую реакцию, подсаживая в аквариум с хищником-резидентом Cichlasoma nicaraguensis на 5 мин. Контакт с хищником приводил к значительному повышению содержания грелина в переднем мозге рыб. У стрессированых рыб концентрация грелина в головном мозге достигала 966 ± 12 пг/мг белка, что составляет почти 250-кратное увеличение показателя в сравнении с незначительным уровнем у интактных животных. Сходный со стрессом эффект на содержание грелина в переднем мозге Danio rerio оказывала 5-минутная экспозиция рыб с КРГ. На фоне КРГ уровень грелина повышался до 986 ± 13 пг/мг белка. Подобные эффекты мы наблюдали при исследовании содержания периферического кортизола в условиях стресса и экспозиции с КРГ.

Таким образом, КРГ оказывает сходный со стрессом мощный стимулирующий эффект на содержание грелина в переднем мозге и уровень кортизола в мышечной ткани Danio rerio.

В следующей серии экспериментов изучали влияние стресс-протекторных пептидов на содержание грелина в переднем мозге Danio rerio, подвергнутых стрессорному воздействию. Оказалось, что все исследуемые препараты приводят к значительному (более чем в 7 раз) снижению уровня грелина. На фоне агрелакса, [D-Lys3]-GHRP-6, и окситоцина содержание грелина у стрессированных рыб составляло 88 ± 3, 97 ± 1, 115 ± 1 пг/мг белка соответственно. Полученные результаты свидетельствуют, что грелиновая система переднего мозга Danio rerio отвечает на стрессорное раздражение повышением концентрации грелина, которая, в свою очередь, значительно снижается после применения антагонистов грелина и окситоцина (см. рисунок, а).

Рисунок. Содержание грелина в переднем (a), среднем (b) и заднем (c) мозге Danio rerio после контакта с хищником и инкубации с окситоцином и антагонистами грелина: 1 — контакт с хищником (в группе В — введение кортиколиберина); 2 — хищник + окситоцин; 3 — хищник + агрелакс; 4 — хищник + [D-Lys3]-GHRP-6. *p < 0,05 относительно группы 1 / Figure. Ghrelin levels in the forebrain (a), midbrain (b), and hindbrain (c) of Danio rerio (pg/mg total protein) after contact with a predator and incubation with oxytocin and ghrelin antagonists: 1 — contact with a predator (in group B, administration of corticotrophin-releasing hormone); 2 — predator + oxytocin; 3 — predator + agrelax; 4 — predator + [D-Lys3]-GHRP-6. *, ** p < 0.05 relative to group 1

Таким образом, в состоянии покоя (при отсутствии стресса) уровень грелина в ткани переднего мозга Danio rerio не определяется методом ИФА. Острый витальный стресс и КРГ стимулируют подъем уровня грелина, тогда как стресс-протекторные пептиды (окситоцин, [D-Lys3]-GHRP-6, агрелакс) при инкубационном воздействии на стрессированных животных снижают.

Средний мозг Danio rerio является наибольшей структурой по массе по сравнению с другими отделами. Так же как и в переднем мозге, концентрация грелина в контрольной группе рыб была меньше, чем чувствительная возможность тест-системы (менее 4 пг/мг общего белка). В группе стрессированных животных концентрация грелина в среднем мозге выросла до 922 ± 3 пг/мг общего белка. Далее, после инкубационного метода применения фармакологических субстанций (окситоцина, агрелакса и [D-Lys3]-GHRP-6), концентрация грелина понизилась в несколько раз и составляла 99 ± 1, 88 ± 1 и 100 ± 2 пг/мг соответственно. Примечательно, что концентрация грелина при применении окситоцина и ([D-Lys3]-GHRP-6) понизилась практически до одинаковых значений, что может свидетельствовать о перекрестных ответных механизмах на стрессорное воздействие у грелиновой и окситоциновой систем.

При сравнении действия антагонистов грелина видно, что в среднем мозге, так же как и в переднем, наименьшую концентрацию грелина отмечали после применения агрелакса, она равнялась 100 ± 2 пг/мг общего белка.

После применения антагонистов грелина на стрессированных животных, концентрация грелина сохранялась, однако была более чем в 7 раз ниже, чем после эксперимента с хищником (см. рисунок, b).

Показатели концентрации грелина после применения антагонистов его рецепторов значимо отличаются от концентрации грелина у стрессированных животных. Так же как и в переднем мозге, в состоянии покоя (без стресса) содержание грелина в ткани среднего мозга Danio rerio находится на уровне следовых значений. Острый витальный стресс или введение КРГ увеличивали концентрацию грелина в несколько раз по сравнению с группой активного контроля (контакт с хищником), она превысила 1 мкг/мг и составила 1004 ± 2 пг/мг общего белка.

После применения окситоцина концентрация грелина понизилась по сравнению с группой, где применяли КРГ, более чем в 8 раз, практически достигнув уровня интактных животных. Количественные значения грелина при применении окситоцина и [D-Lys3]-GHRP-6 были примерно равны.

Филогенетически задний мозг у Danio rerio является самой древней структурой. В отличие от переднего и среднего мозга, в заднем мозге изначально определялся грелин в концентрации 663 ± 29 пг/мг общего белка. После экспозиции хищнику эта концентрация понизилась в несколько раз, до 81 ± 1 пг/мг общего белка. Сходное действие оказывали стресс-протекторные нейропептиды (окситоцин, [D-Lys3]-GHRP-6, агрелакс), снижая уровень грелина до 97–98 пг/мг общего белка. В отличие от показателей концентраций грелина переднего и среднего мозга, в группе использования агрелакса концентрация грелина была наибольшей по сравнению с группами, где применялись другие антагонисты (см. рисунок, с).

Таким образом, в заднем мозге Danio rerio в состоянии покоя определяется высокое содержание нейропептида грелина, которое снижается в условиях стресса и возрастает в 2 раза при воздействии КРГ. При инкубационном воздействии на стрессированных рыб (с низким уровнем грелина) стресс-протекторные пептиды (окситоцин, [D-Lys3]-GHRP-6 и агрелакс) не оказывают выраженных эффектов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование высокочувствительного ИФА позволило нам идентифицировать пептид грелин в различных частях мозга Danio rerio.

Состояние психоэмоционального стресса привело к значительному изменению концентрации грелина в разных отделах мозга Danio rerio. Воздействие антагонистов грелина и окситоцина наглядно привело к снижению уровня грелина в мозге Danio rerio.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: А.А. Блаженко, П.П. Хохлов, А.А. Лебедев, Е.Р. Бычков, С.В. Казаков — написание статьи, анализ данных; П.Д. Шабанов — редактирование статьи, разработка общей концепции.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. The contribution of each author: A.A. Blazhenko, P.P. Khokhlov, A.A. Lebedev, E.R. Bychkov, S.V. Kazakov — manuscript drafting, writing and pilot data analyses; P.D. Shabanov — paper reconceptualization and general concept discussion.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.