FUNCTIONAL DIVERSITY OF MICROBIAL COMMUNITIES IN PERMAFROST AFFECTED PEAT SOILS OF FOREST-TUNDRA PEATLANDS

Full Text

Изучение функциональных характеристик микробных сообществ и их структуры в настоящее время представляет особый интерес для оценки экологического состояния наземных и водных экосистем [1, 2, 3, 4]. Основными объектами, которые активно используют в качестве тест-систем при исследовании природных экосистем, являются бактерии, микроскопические грибы, актиномицеты, водоросли [5, 6, 7]. К одним из современных методов, позволяющих охарактеризовать и провести сравнительный анализ функционального (трофического) разнообразия, функционального потенциала и метаболической активности гетеротрофного микробного сообщества, следует отнести метод мультисубстратного тестирования (МСТ) [8]. Изначально этот метод был предложен для идентификации патогенных микроорганизмов [9], но в настоящее время он широко применяется в области экотоксикологии, агрономии, мониторинга естественных [10, 11, 4] и антропогенно нарушенных почв [12, 13] для изучения микробных сообществ и оценки их изменения под влиянием как природных, так и техногенных факторов. Этот метод может быть весьма перспективным при исследовании и характеристике особенностей функционирования микроорганизмов в мерзлотных почвах для выявления долгосрочных (длительных) климатических изменений и антропогенных воздействий на компоненты арктических экосистем [14]. Цель работы: оценить функциональное разнообразие бактериальных сообществ в сезонно-талых и многолетнемерзлых слоях торфяных почв плоскобугристых торфяников лесотундры. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследования проводили в бассейне нижнего течения р. Печоры, на территории Ненецкого автономного округа. В ботанико-географическом отношении район исследования относится к зоне лесотундры с массивно-островным распространением многолетнемерзлых пород (ММП). Здесь на плоских надпойменных террасах в долине р. Печора и на слабо дренированных водоразделах распространены бугристо-мочажинные, бугристо-грядово-мочажинные и грядово-мочажинные болота с присутствием ММП в торфяной залежи. Один из таких плоскобугристо-мочажинных комплексов, расположенный в пределах правобережной надпойменной террасы р. Печора (67°39′ с.ш.; 53°23′ в.д.), в 15 км к востоку от г. Нарьян-Мара (рис. 1), послужил объектом наших исследований. Детальная характеристика климатических и почвенно-растительных условий района исследования дана в работе [15]. В рассматриваемом регионе верхняя граница мерзлоты в пределах бугристо-мочажинных комплексов залегает в торфяных буграх на глубине 30-60 см, в мочажинах (топях) - на глубине 140 см и ниже. В период проведения наших исследований (август 2015 г.) глубина сезонной оттайки торфа на буграх составила 50-55 см. Отбор образцов из сезонно-талого слоя (СТС) и верхней части мерзлых отложений осуществляли из опорного разреза, который заглубляли до 115 см методом ручной выемки мерзлой толщи торфа. Образцы торфа для микробиологических исследований отбирали послойно с учетом изменения в профиле торфяной залежи ботанического состава торфа, степени его разложенности и с соблюдением условий, препятствующих биологической контаминации. Образцы торфа до начала микробиологических исследований хранили при температуре -18 … 20 °С. Физико-химические исследования образцов торфа выполняли общепринятыми в почвоведении методами [16]. Влажность образцов торфа из СТС и ММП определяли гравиметрическим методом; зольность - прокаливанием при температуре 800 °С; содержание органического углерода (Собщ.) и азота (Nобщ.) - на элементном анализаторе ЕА-1110 (Carlo Erba, Италия) в ЦКП «Хроматография» Института биологии Коми НЦ УрО РАН; рН водной вытяжки - потенциометрически при соотношении «почва : раствор» 1 : 25. Углерод (ТС) и азот (ТN) в водных вытяжках определяли на анализаторе TOC-VCPN (Япония, Shimadzu) c модулем TNM-1. Органический углерод водорастворимых соединений (TOC) - рассчитывали по разнице общего (TC) и неорганического (IC) углерода. Полученные результаты пересчитывали на навеску почв. Содержание потенциально жизнеспособных клеток бактерий определяли методом люминесцентной микроскопии [17] с использованием флуоресцентного двухкомпонентного красителя L 7012 [18]. Оценку функционального состояния микробных сообществ проводили с использованием метода МСТ [19]. При проведении анализа оценивали спектры потребления субстратов (СПС) микробными сообществами. В работе использовали стандартные 96-луночные планшеты с 47 источниками органического углерода (сахара, спирты, соли органических кислот, аминокислоты, амины, амиды, нуклеозиды). Планшеты инкубировали в термостате в течение 5 суток при температуре 28 °С до появления визуально регистрируемой окраски ячеек. Изменение окраски субстратов вызвано развитием микроорганизмов, способных потреблять тест-субстрат, содержащийся в ячейке планшета, и восстанавливать бесцветный трифенил-тетразолий в бордово-красный формазан. После окончания инкубации осуществляли фотометрическое считывание оптической плотности ячеек при длине волны 510 нм на фотометре «Униплан». На основании совокупности полученных данных рассчитывали коэффициенты биоразнообразия (индекс Шеннона, индекс выравненности Пиелу), параметр рангового распределения потребления субстратов (d), а также удельную метаболическую работу (W) [20]. Параметр рангового распределения потребления субстратов d позволяет оценить благополучие и стабильность микробных сообществ [8]. В благополучных системах, имеющих максимальный запас прочности, величина d принимает значения 0,01-0,1, в устойчивых стабильных - 0,1-0,4. В системах с истощенными ресурсами или в системах, находящихся под обратимым воздействием какого-либо нарушающего фактора, параметр d характеризуется величинами 0,4-0,8, в кризисных дестабилизированных системах - 0,8-1,0, в необратимо нарушенных системах, потерявших исходную функциональную целостность, величина d >1. Для сравнения спектров потребляемых субстратов применяли кластерный анализ (кластеризация - по Варду, мера расстояния - Манхеттеновское расстояние) [21]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Для оценки функционального разнообразия микробных сообществ и влияния многолетней мерзлоты на их метаболическую активность в торфяных почвах плоскобугристых болот лесотундры использовали образцы торфа из различных слоев СТС и ММП торфяного бугра. В данной работе представлены данные исследования 5 образцов торфа, наиболее контрастных по условиям залегания в торфяной залежи. Образцы Т1 и Т2 (глубина 0-4 и 4-10 см) характеризуют верхние слои СТС. Торф темно-коричневый, переплетен корнями кустарничков Betula nana L., Ledum decumbens L., Empetrum hermaphroditum L., Vaccinium vitis-idaea L., представлен в основном среднеразложенными остатками дикрановых мхов, листовых пластинок и фрагментов отпада ветвей и корней кустарничков, а также продуктами разложения талломов лишайников из рр. Cladonia, Cetraria, Flavocetraria, входящих в состав растительных сообществ торфяных бугров. Образец Т5 (глубина 47-55 см) соответствует границе сезонного оттаивания торфяной залежи. Торф надмерзлотного слоя Т5 мокрый, желтовато-бурого цвета, с включением слаборазложенных остатков сфагновых мхов. Нижележащие слои Т6^ (55-70 см) и Т7^ (95-115 см) находятся в мерзлом состоянии, мерзлота льдистая. По ботаническому составу образцы торфа Т6^ и Т7^, близки к слою Т5, но образец, отобранный с глубины 95-115 см, отличается возрастанием степени разложенности торфа и его льдистости. При близких значениях зольности образцов торфа из слоев Т5, Т6^ и Т7^, надмерзлотный слой характеризуется наиболее кислой реакцией среды (табл. 1). Величина актуальной кислотности здесь 3,85±0,10 ед. рН, что может быть обусловлено преимущественно сфагновым составом растительных остатков в этой части торфяной залежи. Высокие значения зольности поверхностных слоев торфа, особенно, верхнего слоя Т1, и более низкие показатели в них содержания Собщ. и Nобщ. (табл. 1) связаны со спецификой месторасположения рассматриваемого объекта и аэротехногенным поступлением минеральных частиц на поверхность болотного массива при эксплуатации близлежащих автодорог с грунтовым покрытием [17]. При анализе физико-химических свойств рассматриваемых слоев торфяной залежи наиболее четко различия между ними проявились при оценке абсолютного и относительного содержания углерода (ТОС) и азота (ТN) водорастворимых органических соединений. Минимальные концентрации ТОС и TN (табл. 1), а также наиболее низкие значения их доли от Собщ. и Nобщ. соответственно (рис. 2А), отмечены в надмерзлотном слое торфа Т5. Наряду с повышенным уровнем увлажнения (верхняя граница мерзлоты является водоупором в профиле торфяной залежи бугра), околонулевыми температурами торфа на границе мерзлоты в летний период [22] и бактерицидным действием сфагнолов [23], низкая обеспеченность водорастворимыми и легкодоступными органическими соединениями может определять невысокое содержание здесь потенциально жизнеспособных клеток бактерий - 0,56±0,19 млрд кл. г-1 а.с.п. (рис. 2В). Для сравнения, в верхних слоях СТС численность прокариот с неповрежденной мембраной варьирует, в зависимости от глубины отбора, от 1,04±0,13 до 1,67±0,20 млрд кл. г-1 а.с.п., в мерзлых слоях торфа - от 1,48±0,79 до 1,82±0,29 млрд кл. г-1 а.с.п. Микробные сообщества различных слоев торфа значительно отличаются друг от друга по своему функциональному (трофическому) разнообразию и метаболическому потенциалу (табл. 2). Верхний, наиболее прогреваемый слой торфа Т1 (глубина 0-4 см) характеризуется максимальным количеством потребляемых источников органического углерода (29 из 47 субстратов). Ниже по профилю, несмотря на более высокие значения в слое Т2 (4-10 см) численности жизнеспособных клеток бактерий (рис. 2А), их функциональная активность резко снижена. Это проявилось как в уменьшении общего количества ассимилируемых бактериями источников органического углерода (11 из 47), так и в снижении активности их потребления - показатель удельной метаболической работы W в слое Т2 (4-10 см) в 3,5 раза ниже по сравнению со слоем Т1 (0-4 см). Микробные сообщества, приуроченные к слою торфа Т5 (47-55 см), расположенному на контакте с верхней границей мерзлоты, ассимилируют наименьшее количество органических субстратов (3 из 47). Низкая численность здесь бактерий (рис. 2В), невысокий уровень их функционального разнообразия (индекс Шеннона 2,41) и активности в процессах утилизации органических соединений (величина удельной метаболической работы W в слое Т5 снижена по сравнению с Т1 в 7 раз) детерминированы преимущественно олиготрофным характером торфяной залежи (присутствие большого количества остатков сфагновых мхов) в этой части профиля торфяного бугра и складывающимися здесь крайне неблагоприятными экологическими условиями функционирования микробиоты (высокая кислотность, избыточная влажность, температура ниже биологически активной). Следует отметить, что микробные сообщества мерзлой толщи торфяной залежи близки по функциональному разнообразию и метаболической активности к микробным сообществам верхней части СТС (табл. 2). По всей видимости, естественная, природная криоконсервация клеток прокариот в жизнеспособном состоянии, позволяет сохранять в ММП достаточно высокий уровень их метаболической активности (W=1556-1778) и разнообразия в потреблении различных источников углерода (индекс Шеннона 4,37-4,51), которые проявляются при изменении экологических условий (размораживание). Полученные нами результаты по функциональному разнообразию микробных сообществ ММП торфяной залежи полоскобугристого болота лесотундры согласуются с данными литературы. Проведенные ранее исследования [23] показали, что низкие температуры, складывающиеся в глубоких слоях торфяных отложений болотных экосистем, не препятствуют сохранению жизнеспособных компонентов микробных комплексов, которые активизируются и начинают функционировать при наступлении благоприятных условий. Анализ спектров потребления субстратов микробными сообществами свидетельствует о существенной перестройке их метаболического профиля в пределах деятельного слоя торфяной мерзлотной почвы плоскобугристого болота лесотундры. Наибольшей суммарной интенсивностью потребления субстратов характеризуются микробные сообщества, сосредоточенные в самой верхней части СТС - в слое Т1 (рис. 3). Микроорганизмы, функционирующие в этом слое, ассимилируют практически все группы органических субстратов, использованных нами при проведении МСТ. Разнообразие физиологических (трофических) функций, выполняемых микробными сообществами верхнего слоя торфяной залежи и оцениваемых по активности утилизации ими отдельных органических соединений, в первую очередь обусловлено разнообразием растительного покрова торфяных бугров (мхи, лишайники, сосудистые растения), определяющим широкий спектр поступающих в почву органических веществ и создание природного разнообразия экологических ниш для функционирования почвенных микроорганизмов [14]. Ниже по профилю торфяной залежи, наряду с резким снижением в пределах СТС интенсивности потребления органических субстратов, наблюдается выпадение отдельных групп органических соединений из состава используемых почвенными микроорганизмами источников энергии. В частности, микроорганизмы слоя Т2 (4-10 см) не проявили свою активность в утилизации азотсодержащих органических соединений, таких как креатин и мочевина, а список источников органического углерода, утилизируемых микробными сообществами в надмерзлотном слое Т5 (47-55 см), ограничен пентозами, полимерными соединениями (крахмал) и низкомолекулярными органическими кислотами (НМОК). Наличие в нижней части СТС ассоциаций микроорганизмов, утилизирующих именно эти вещества, может быть обусловлено повышенным содержанием углеводов в сфагновых торфах [24], их миграционной активностью в профилях почв [25] и аккумуляцией водорастворимых органических веществ в нижних горизонтах криогенных почв [26]. Метаболический профиль микробных сообществ ММП, благодаря консервации здесь потенциально жизнеспособных клеток, относящихся к различным филумам прокариот [15], близок по количеству используемых групп органических соединений к микробному сообществу, функционирующему в поверхностном слое торфа Т1. В отличие от последнего, в мерзлой толще торфа повышается относительный вклад процессов потребления микроорганизмами в качестве источника энергии пентоз и олигосахаридов при уменьшении утилизации спиртов и аминокислот. Специфичность микробных сообществ, функционирующих в различных слоях СТС и ММП торфяной почвы плоскобугристого болота лесотундры, подтверждается статистической обработкой спектров поглощения органических субстратов с использованием кластерного анализа. Как видно (рис. 4), наиболее близки между собой по качественному составу используемых источников органического углерода и активности их утилизации бактериальные сообщества мерзлых слоев торфа Т6^ (55-70 см) и Т7^ (95-115 см). По этим параметрам к ним приближается микробное сообщество поверхностного слоя торфа Т1. Нижележащие слои Т2 и Т5, несмотря на значимую разницу в них численности потенциально жизнеспособных бактерий (рис. 2В), характеризуются близкой связью по функциональному разнообразию и активности ассимиляции источников энергии. Одним из наиболее информативных показателей при анализе СПС является параметр d [8, 20]. Согласно полученным нами данным, наиболее функционально разнообразны и, соответственно, стабильны бактериальные сообщества самой верхней части СТС (Т1; d=0,1), где в почве торфяного бугра максимальна представленность различных источников органического вещества - отмершие части мхов, лишайников, опад и отпад сосудистых растений, корневые выделения, продукты жизнедеятельности почвенных водорослей, беспозвоночных животных, микроскопических и базидиальных грибов. Микробные сообщества ММП также могут быть отнесены, в соответствии с расчетным параметром d, к устойчивой стабильной системе (d=0,1-0,2), что обусловлено присутствием здесь значительного количества жизнеспособных клеток бактерий. Крайне неустойчивыми (нестабильными) микробными сообществами в профиле торфяной залежи являются микробные сообщества подповерхностного горизонт Т2 торфяной почвы, приуроченного к глубине 4-10 см (d=1,1), и надмерзлотного слоя Т5 (глубина 47-55 см), расположенного на контакте с верхней границей мерзлоты (d=2,96). ВЫВОДЫ Определены закономерности изменения численности жизнеспособных клеток бактерий и их функционального (трофического) разнообразия в торфяной мерзлотной почве плоскобугристого болота лесотундры. Показано, что микробные сообщества, функционирующие в СТС и ММП торфяной залежи, а также на границе их контакта, различаются по количеству используемых для жизнедеятельности источников энергии (органических субстратов) и активности их потребления. Экологические условия, складывающиеся в поверхностных слоях почвы торфяного бугра и обусловленные поступлением широкого спектра органических веществ с опадом и отпадом растений, корневыми выделениями, жизнедеятельностью почвенной биоты, определяют высокую активность и значительное функциональное разнообразие представленных здесь микробных сообществ (индекс Шеннона H=4,63, удельная метаболическая работа W=2472). В мерзлых слоях торфяной залежи, благодаря криоконсервации жизнеспособных клеток бактерий, сохраняется высокий уровень трофического разнообразия почвенных микробных сообществ (индекс Шеннона 4,37-4,51) при незначительном снижении (в 1,4-1,6 раза) показателя удельной метаболической роботы (W=1556-2108) относительно поверхностного слоя почвы. Изменение климатических условий при потеплении и снижение кровли вечной мерзлоты будут способствовать активизации микробных сообществ, находящихся в настоящее время в соях ММП торфяных почв, и их включению в процессы биологической трансформации растительного материала торфяной залежи бугристых болот. Наиболее неблагоприятные условия для функционирования почвенных микробных сообществ в торфяной залежи бугристых болот лесотундры складываются на контакте с верхней границей мерзлоты, что фиксируется по показателям низкой численности здесь жизнеспособных клеток бактерий (0,56±0,19 млрд кл. г-1 а.с.п.), их функционального разнообразия (Н=2,41) и удельной метаболической работы (W=363). В пределах торфяной залежи плоскобугристого болота лесотундры наиболее устойчивы и стабильны (d=0,05-0,23) микробные комплексы верхнего слоя торфяной мерзлотной почвы и ее нижних слоев, находящихся в постоянно мерзлом состоянии, что обусловлено значительным функциональным разнообразием представленных здесь ассоциаций бактерий. Рис. 1. Месторасположение и ландшафт участка проведения исследований Таблица 1. Изменение физико-химических показателей в профиле мерзлотной торфяной почвы плоскобугристого болота лесотундры Примечание. Знаком «^» отмечены образцы торфа, находящиеся в мерзлом состоянии; ТОС - содержание углерода водорастворимых органических соединений; ТN - содержание азота водорастворимых органических соединений Рис. 2. Относительное содержание (А) углерода (1) и азота (2) водорастворимых органических соединений на различных глубинах торфяной залежи плоскобугристого болота лесотундры и численность в них потенциально живых бактерий (В) Таблица 2. Параметры биоразнообразия и метаболической активности микробных сообществ торфяной мерзлотной почвы бугристого болота лесотундры (по данным мультисубстратного тестирования) Рис. 3. Абсолютная (А) и относительная (В) интенсивность потребления микробными сообществами различных групп субстратов: I - пентозы; II - гексозы; III - олигосахариды; IV - спирты; V - аминокислоты; VI - низкомолекулярные органические кислоты; VII - полимеры; VIII - азотсодержащие органические соединения Рис. 4. Дендрограмма сходства в потреблении органических субстратов микробными сообществами, функционирующими в различных слоях почвы торфяного бугра плоскобугристого болота лесотундры (кластеризация - по Варду, мера расстояния - Манхеттеновское расстояние)

About the authors

Elena Morisovna Lapteva

Institite of Biology Komi SC UrD RAS

Email: lapteva@ib.komisc.ru
Candidate of Biology, Chief of the Soil Science Department Syktyvkar

Yulia Alekseevna Vinogradova

Institite of Biology Komi SC UrD RAS

Email: vinogradova@ib.komisc.ru
Candidate of Biology, Researcher of the Soil Science Department Syktyvkar

Michail Vladimirovich Gorlenko

M.V. Lomonosov Moscow State University

Email: gorlenko@nm.ru
Candidate of Biology, Senior Researcher of the Soil Science Faculty of the MSU

References

Supplementary files