МОНИТОРИНГ МИКРОФЛОРЫ ПАРАНАЗАЛЬНЫХ СИНУСОВ КАК СПОСОБ РАННЕЙ ПРОФИЛАКТИКИ КОЛОНИЗАЦИИ НИЖНИХ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫМИ ШТАММАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ У ПАЦИЕНТОВ С МУКОВИСЦИДОЗОМ

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ Одним из частых осложнений муковисцидоза (МВ) являются заболевания пазух носа. Среди них наиболее часто встречаются хронические риносинуситы, гаймориты, этмоидогаймориты и, конечно же, назальный полипоз. При этом у взрослых пациентов с МВ доля риносинуситов составляет около 63%, а количество случаев назального полипоза около 25% [1]. Доля назального полипоза у детей колеблется по данным различных авторов от 32 до 45% [2]. Клиническая манифестация заболеваний синусов при МВ может осуществляться с обнаружения назальных полипов, изменений по результатам исследований методом компьютерной томографии, а также выявления клинически значимых микроорганизмов при исследовании материала с верхних дыхательных путей (ВДП) при микробиологическом исследовании [3]. Работами зарубежных авторов было показано, что строение клеточных мембран параназальных синусов идентично мембранам в тканях легких. Как и в нижних дыхательных путях (НДП), дефект гена муковисцидозного трансмембранного регулятора (МВТР) приводит к повышенной вязкости секрета в пазухах, что также способствует присоединению микрофлоры и развитию хронических риносинуситов [4, 5]. Исследования микрофлоры ВДП у пациентов с МВ показало, что у них наиболее часто выделяются H.influenzae, P.aeruginosa и S.aureus [6, 7]. Работами ряда исследователей показана возможная связь между микроорганизмами, колонизирующими верхние и нижние дыхательные пути [8]. Так, Майнц и коллеги демонстрировали идентичность генотипов P.aeruginosa и S.aureus, выделенных из ВДП и НДП у пациентов с МВ [9]. В свою очередь, они сделали предположение, что ВДП могут быть резервуаром инфекции при МВ и подтвердили эту гипотезу своими дальнейшими исследованиями [10]. В своей работе авторами приводится описание клинического случая выявления идентичного генотипа P.aeruginosa из ВДП от пациента до и после трансплантации легких. Кроме того, другими исследованиями также отмечена необходимость и значимость обследования и своевременной детекции бактерий в параназальных синусах, особенно для пациентов, готовящихся к трансплантации легких [11]. Многочисленными исследованиями было показано, что присоединение инфекции, ассоциированной с P.aeruginosa, приводит к значительному и быстрому снижению легочной функции у пациентов с МВ [12, 13]. Вероятно, что хроническое инфицирование пазух носа указанными бактериями также может приводить к формированию значительных изменений в пазухах [14]. Помимо этого, Хансен и коллеги показали, что параназальные синусы могут быть защитной зоной для адаптации клонов P.aeruginosa и, время от времени, способствовать распространению этого патогена в легкие, способствуя, тем самым, процессу формирования хронической легочной инфекции и, косвенно объясняя возможную неэффективность проводимой антибактериальной терапии [15]. Исследованиями других ученых показано, что состав микрофлоры из аспиратов синусов до 80% случаев совпадает со структурой микрофлоры, колонизирующей НДП [16]. Исследованиями Вильсона и коллег также показана идентичность штаммов, выделенных из жидкости назального лаважа и мокроты от 54 детей с МВ, при этом авторы отмечают необходимость антибактериальной терапии, направленной на эрадикацию возбудителя из пазух. Показана эффективность проводимой терапии в 67% случаев в течении 3 месяцев после лечения [17]. Таким образом, накоплен значительный практический мировой опыт исследований, отражающий актуальность и неоспоримую практическую значимость исследования микрофлоры назального лаважа у пациентов с МВ в рутинной практике. Однако, обратившись к имеющимся публикациям российских ученых, мы не обнаружили исследований, посвященных этой проблеме. Целью нашей работы было определение качественного и количественного видового состава микрофлоры, выделенной из назального лаважа (НЛ), и оценка корреляции микроорганизмов, выделенных из параназальных синусов (ПС) и НДП. Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи: 1. Оценить видовой состав выделенной микрофлоры, а также количественное содержание возбудителей в пересчете на 1 мл жидкости НЛ; 2. Сопоставить микроорганизмы, выделенные из НЛ с результатами анализов мокроты от этих же пациентов; 3. Выявить пациентов группы риска по колонизации НДП возбудителями, имеющими клиническое значение при МВ. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для реализации поставленных перед нами задач было проведено микробиологическое исследование 61 образца жидкости НЛ, полученной от 44 пациентов с МВ Самарской области. При этом 23 пациента были обследованы однократно, 15 - двукратно, и один пациент троекратно. Сбор и первичный посев биоматериала осуществлялся в соответствии с авторской методикой, описанной в Патенте РФ на изобретение «Техника сбора и первичного посева жидкости назального лаважа от пациентов с муковисцидозом для микробиологического исследования» [18]. При этом полость носа пациента промывалась стерильным 1,5-2% раствором NaCl с помощью индивидуального назального душа с последующим сбором свободно вытекающей лаважной жидкости в стерильный одноразовый контейнер. Собранный материал транспортировался в лабораторию в изотермических условиях не позднее 2 ч после сбора, вортексировался, после этого производился посев 200 мкл собранного материала стерильным тампоном на питательные среды: 5% кровяной агар, шоколадный агар, универсальную хромогенную среду, селективную среду для Burkholderia cepacia (OFPBL-агар), а также агар Сабуро с использованием техники посева «газоном». Затем засеянные чашки с 5% кровяным агаром, универсальной хромогенной средой инкубировались в термостате при температуре 37°С в течение 24-48 ч с ежедневным просмотром посевов. Чашки с шоколадным агаром инкубировались при 35°С в атмосфере 5-7% СО2 в течение 24-48 ч с ежедневным просмотром посевов. Засеянные чашки с селективной средой для Burkholderia cepacia (OFPBL-arap) и агаром Сабуро инкубировались 24-48 ч при температуре 37°С, далее инкубировались до 14 суток при комнатной температуре с ежедневным просмотром посевов. Идентификация выросших колоний осуществлялась с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии на приборе Microflex LT (Bruker). Пересчет выросших колоний осуществлялся на 1 мл лаважной жидкости. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенного исследования выделено 333 штамма микроорганизмов. При этом среднее количество штаммов, выделенных от одного пациента составило 5,44 микроорганизма. Все выделенные штаммы были условно разделены нами на 3 группы. В первую группу вошли микроорганизмы, имеющие доказанное клиническое значение в развитии хронической инфекции легких при МВ. К ним были отнесены такие представители, как B.cepacia complex, P.aeruginosa, A.xylosoxydans, S.aureus, S.maltophilia. Вторую группу составили микроорганизмы, чье клиническое значение при МВ возможно, но не установлено до конца, ввиду отсутствия достаточного опыта ведения пациентов, колонизированных указанными штаммами в мире. К этой группе мы отнесли таких представителей, как энтеробактерии, Pseudomonas spp., не относящиеся к P.aeruginosa, Acinetobacter spp., Brevundimonas spp., Chryseobacterium spp., Achromobacter spp., не относящиеся к видам A.xylosoxydans и A.ruhlandii, Sphingomonas spp., Shewanella spp., Delftia spp., Pseudoxantomonas spp., Ochrobacter spp., Acidovorax spp. и некоторые другие неферментирующие грамотрицательные бактерии (НФГОБ). Штаммы Gordonia spp. и Mycobacterium spp. были также отнесены к этой группе, несмотря на то, что значение Mycobacterium spp. при МВ описано, выделение их только с ВДП не является клинически значимым и может быть результатом транзиторного попадания на слизистую оболочку с объектов окружающей среды. Кроме того, к этой группе были отнесены грибы. Третью группу составили микроорганизмы, не имеющие клинического значения при МВ и являющиеся представителями нормальной микрофлоры дыхательных путей, а также микроорганизмы, выделяемые из окружающей среды. В эту группу вошли представители родов Staphylococcus, за исключением S.aureus, Streptococcus, Corynebacterium, Rothia, Kocuria, Micrococcus, Moraxella, Neisseria, Gemella, Haemophillus и некоторые другие. У пациентов, имеющих высев клинически значимых микроорганизмов среднее количество выделенных штаммов составило 5,99 штаммов в посеве. Структура среднего количества штаммов, выделенных от пациентов с различными клинически значимыми патогенами представлена на рисунке 1. У пациентов, не имеющих высев клинически значимых патогенов среднее количество выделенных штаммов в одном посеве составило 4,80. В 41 пробе (85,4%), от пациентов, у которых были выделены клинически значимые микроорганизмы из жидкости НЛ также были выделены микроорганизмы - представители нормальной микрофлоры. В то же время у пациентов, не имеющих клинически значимых микроорганизмов в жидкости НЛ этот показатель составил 100%.Среди всех выделенных штаммов 54 (16,2%) имеют доказанное клиническое значение при МВ. Данные представители выделены в 48 пробах. Было выделено 112 (33,6%) штаммов представителей второй группы. Данные микроорганизмы выделены в 43 пробах. Кроме этого, выделено 167 (50,2%) штаммов микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры дыхательных путей. Данные штаммы выделены в 54 пробах. У 33 пациентов (48 проб) выделены клинически значимые микроорганизмы из жидкости НЛ. Структура выделенных штаммов представлена на рисунке 2. При этом в 42 пробах указанные возбудители были выделены в монокультуре, а в 6 пробах в виде комбинации двух штаммов. Структура штаммов, выделенных в виде монокультур представлена на рисунке 3. Среди комбинаций штаммов отмечались варианты, представленные на рисунке 4. При этом в 35 (45,7%) случаев из 35 пациентов, с высевом S.aureus из НДП в анамнезе отмечался высев идентичного штамма из ВДП. В 19 (54,35) случаях отмечался высев S.aureus из НДП в анамнезе, но микроорганизм не был выделен из жидкости НЛ. В 16 (76,2%) случаев из 21, штаммы S.aureus выделены из ВДП и НДП. В 5 (23,8%) случаях отмечался высев штаммов S.aureus только в ВДП, без выделения из НДП в анамнезе. Эта категория пациентов рассматривается нами как группа риска по колонизации НДП штаммами S.aureus с ВДП при отсутствии своевременной санации назальных пазух. В 8 случаях (44,4%) из 18 пациентов с высевом P.aeruginosa из НДП в анамнезе, отмечался высев данного возбудителя из жидкости НЛ. При этом в 10 (55,6%) случаях штамм был выделен только в НДП. В 8 (88,9%) случаях у пациентов с высевом P.aeruginosa из жидкости НЛ отмечался высев из ВДП в анамнезе. У 2 (4,5%) пациентов выделены штаммы A.xylosoxydans из жидкости НЛ. При этом у 1 пациента (50,0%) отмечалась хроническая инфекция НДП, ассоциированная с данным возбудителем. У другого пациента отмечался только высев из жидкости НЛ без выделения штамма из мокроты в анамнезе. Этот пациент рассматривался нами как находящийся в группе риска по формированию инфекции НДП, ассоциированной с A.xylosoxydans. У 2 (4,5%) пациентов выделены штаммы S.maltophilia из жидкости НЛ. При этом ни у одного пациента не было предшествующих положительных высевов из НДП. Данные пациенты рассматриваются нами как группа риска по колонизации НДП указанными штаммами. В 20 (90,9%) случаях из 22 у пациентов с высевом B.cenocepacia из НДП в анамнезе отмечался высев из ВДП. При этом в 2 (9,1%) случаях штаммы выделены только из НДП, но не выделены из жидкости НЛ. В 20 случаях из 20 (100%) пациентов с высевом указанных штаммов из жидкости НЛ отмечался положительный высев из НДП. Нами не было выделено ни одного пациента, у кого бы возбудитель присутствовал бы в жидкости НЛ, но отсутствовал при посеве отделяемого из НДП. Таким образом, у пациентов инфицированных B.cenocepacia возбудитель присутствовал как в пазухах носа, так и в НДП. Это обстоятельство необходимо учитывать при назначении этиотропной терапии, т.к. применение ингаляционной антибактериальной терапии с помощью небулайзера может не затрагивать популяцию бактерий в назальных пазухах, и, таким образом, препятствовать эффективной терапии и возможной эрадикации (особенно у пациентов с первым высевом возбудителя). Таким образом, в результате проведенного исследования нами выявлено 8 пациентов, находящихся в группе риска по инфицированию штаммами, имеющими доказанное клиническое значение при МВ из ВДП. Нами выделено 112 штаммов микроорганизмов из жидкости НЛ, клиническое значение которых при МВ не установлено до конца. При этом лидирующее положение в структуре занимали представители НФГОБ -70 (62,5%) штаммов. На втором месте по распространенности были представители семейства Enterobacteriaceae - 21 (18,8%) штамм, реже грибы - 14 (12,5%) штаммов, и грамположительные палочки семейства Actinomycetales - 7 (6,2%) штаммов. Структурное разнообразие штаммов НФГОБ представлено на рисунке 5. В структуре бактерий рода Pseudomonas были виды, представленные в таблице 1. Видовое разнообразие бактерий рода Acinetobacter, выделенных из жидкости НЛ, представлено в таблице 2. Структурное разнообразие бактерий рода Brevundimonas, выделенных из жидкости НЛ, представлено в таблице 3. Кроме этого, было выделено 3 штамма бактерий рода Chryseobacterium, из них 2 (66,7%) штамма C.gleum и 1 (33,3%) штамм C.hamamense. Также выделено 4 штамма Sphingobacterium spp., из них 1 (25,0%) штамм S.muzitaii, 2 (50,0%) штамма S.spiritivorum и 1 (25,0%) штамм S.multivorum. Среди представителей рода Ochrobacter выделено 2 штамма, по одному штамму (50,0%) O.tritici и O.antropi соответственно. Кроме этого выделены по 3 штамма D.acidovorans и R.radiobacter, по 2 штамма A.delafiensi, A.polychromogenes, и по 1 штамму S.putrifaciens, S.paucimobilis, P.kaosiungensis, S.terra и R.respiraculis соответственно. В результате исследования выделен 21 штамм энтеробактерий. Структура выделенных штаммов представлена на рисунке 6. Среди 5 выделенных штаммов бактерий рода Klebsiella 1 (20,0%) штамм - K.pneumoniae и 4 (80,0%) штамма K.oxytoca. Среди 5 выделенных штаммов бактерий рода Citrobacter 3 (60,0%) штамма C.freundii, и по 1 (20,0%) штамму C.koseri и C.braaki соответственно. Кроме того, выделено 3 штамма бактерий рода Enterobacter, среди которых 2 (66,7%) штамма E.cloacae и 1 (33,3%) штамм E.kobei. Помимо этого выделено 3 штамма E.coli, по 2 штамма P.ceptica и M.morganii соответственно, и 1 штамм A.media. Отдельный интерес, на наш взгляд, представляют случаи выделения штаммов - представителей семейства Actinomycetales, в частности родов Mycobacterium и Gordonia. Среди представителей рода Mycobacterium выделено 5 штаммов. Из них 3 (60,0%) штамма M.boenikei, и по 1 (20,0%) штамму M.pseudoschotsii и Mycobacterium spp. Все выделенные штаммы не являются патогенными и не имеют клинического значения для пациентов. Штаммы микобактерий выделены из 5 проб от 5 пациентов. Все пациенты имели высев клинически значимых микроорганизмов в мокроте в анамнезе. При этом 3 пациента имели хроническую инфекцию дыхательных путей, ассоциированную с B. cenocepacia, а один был контактный по данному возбудителю, но, несмотря на это, ни разу не имел положительных высевов указанного микроорганизма, но имеет высевы S.maltophilia. Еще 1 пациент имеет хроническую инфекцию дыхательных путей, ассоциированную с P.aeruginosa. У 2 пациентов отмечался высев G.rubripertincta. При этом у обоих пациентов отмечался высев клинически значимых микроорганизмов в мокроте: у 1 пациента отмечалась хроническая инфекция дыхательных путей, ассоциированная с B.cenocepacia, а у другого с S.aureus. Указанные штаммы выделялись из жидкости НЛ в сочетании с НФГОБ, среди которых P.orizihabitans, P.montelli, P.alcaligenes, A.ursungii, B.aurantiaca, A.delafiensii, S.paucimobilis. Таким образом, возможно, что хроническая колонизация дыхательных путей штаммами, имеющими доказанное клиническое значение при МВ, и особенно штаммами НФГОБ, коррелирует с уровнем колонизации ВДП штаммами бактерий семейства Actinomycetales. Помимо этого, нами было выделено 14 штаммов грибов. Из них 10 штаммов родов Candida, 2 штамма Rhodotorula и по 1 штамму Cryptococcus и Mucor соответственно. В структуре грибов рода Candida выделено 5 штаммов C.albicans, 3 штамма C.dubliniensis и по 1 штамму C.guillermondii и C.tropicalis соответственно. Отдельный интерес, на наш взгляд, представляют случаи выделения штаммов грибов R. mucilaginosa. Данные штаммы выделены от 2 пациентов, дыхательные пути которых колонизированы клинически значимыми штаммами микроорганизмов. При этом у одного пациента отмечался высев B.cenocepacia из мокроты и жидкости НЛ, а у другого S.aureus из жидкости НЛ и интермиттирующие высевы P.aeruginosa из мокроты. Штаммы R. mucilaginosa выделены в ассоциации со штаммами НФГОБ и энтеробактериями, при этом у 1 пациента выделено 11, а у другого 10 штаммов микроорганизмов из жидкости назального лаважа. Среди 167 штаммов микроорганизмов, не имеющих клинического значения в патологии легких при муковисцидозе лидирующее место занимали грамположительные кокки - 129 штаммов. Структура выделенных штаммов показана на рисунке 7. В структуре бактерий рода Staphylococcus доминирующее положение занимал S.epidermidis - 39 штаммов, реже S.hominis - 8 штаммов, S.haemolyticus - 7 штаммов, S.warneri - 5 штаммов и 1 штамм S.saprophyticus. Структура бактерий рода Streptococcus представлена в таблице 4. Кроме этого, выделено 12 штаммов бактерий рода Rothia, среди которых 9 штаммов R.mucilaginosa и 3 штамма R.amarae, а также 6 штаммов бактерий рода Kocuria, из них 2 штамма K.carniphila и по 1 штамму K.kristinae, K.marinae, K.rhizophila, K.palistis соответственно. Помимо этого, выделено 12 штаммов M.luteus. Реже встречались грамположительные палочки - 16 штаммов. Из них 9 штаммов Corynebacterium spp., среди которых по 2 штамма C.pseudodiphteriticum, C.aurimucosum, C.accolens и по 1 штамму C.striatum, C.tuberculostriatum и C. imitans соответственно. Также выделено 3 штамма Microbacterium spp., 2 штамма A.oris и по 1 штамму A.italicus и B.cereus. Среди грамотрицательных и грамвариабельных кокков и коккобацилл, а также палочек, не относящихся к НФГОБ и семейству Enterobacteriaceae выделено 22 штамма. Структура выделенных штаммов представлена на рисунке 8. Среди бактерий рода Moraxella выделено 4 штамма M.catarrhalis и 2 штамма M.osloensis. В структуре бактерий рода Neisseria доминировали N.flavescens - 6 штаммов и N.subflava - 4 штамма, также выделено по 1 штамму N.elongata и N.mucosa соответственно. Было выделено по 1 штамму G.haemolysans и G.sanguinis, а также 2 штамма H.parainfluenzae. ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведенного исследования было показано, что структура и видовой состав микрофлоры ПС коррелирует с микрофлорой НДП у пациентов с МВ. При этом ПС могут быть зоной для адаптации агрессивных клонов бактерий и источником для инфицирования НДП. Регулярное микробиологическое исследование микрофлоры из жидкости НЛ позволяет выявить клинически значимые микроорганизмы на раннем этапе и может рассматриваться как способ ранней профилактики формирования хронической бактериальной инфекции НДП при МВ. Регулярное микробиологическое исследование микрофлоры жидкости НЛ может быть рекомендовано всем пациентам с МВ, а особенно пациентам, планирующим трансплантацию легких. Пациенты, имеющие высев клинически значимых патогенов из жидкости НЛ должны рассматриваться как находящиеся в группе риска по формированию бактериальных осложнений легких. Учитывая вышеизложенное, проводимая антибактериальная терапия при МВ должна затрагивать не только НДП, но и ПС. Рис. 1. Среднее количество штаммов, выделенных от пациентов с различными клинически значимыми патогенами (в штаммах) Рис. 2. Структура клинически значимых штаммов микроорганизмов, выделенных из жидкости назального лаважа (в %) Рис. 3. Процентное соотношение проб с выделенными клинически значимыми штаммами в монокультуре (в %) Рис. 4. Процентное соотношение комбинаций клинически значимых штаммов микроорганизмов, выделенных из жидкости назального лаважа (в %) Рис. 5. Структура штаммов НФГОБ - представителей второй группы, выделенных из жидкости назального лаважа (в %) Таблица 1. Структура бактерий рода Pseudomonas, выделенных из жидкости назального лаважа Таблица 2. Структура бактерий рода Acinetobacter, выделенных из жидкости назального лаважа № Микроорганизм Количество штаммов % 1 A.junii 7 36,8% 2 A.ursungii 3 15,8% 3 A.johnsonii 2 10,5% 4 A.haemolyticus 3 15,8% 5 A.schindleri 1 5,3% 6 A.Iwoffii 1 5,3% 7 A.pitti 2 10,5% № Микроорганизм Количество штаммов % 1 P.orizihabitans 2 20% 2 P.marginalis 1 10% 3 P.balerica 1 10% 4 P.orientalis 1 10% 5 P.montelli 1 10% 6 P.stutzeri 2 20% 7 P.alcaligenes 2 20% Таблица 3. Структура бактерий рода Brevundimonas, выделенных из жидкости назального лаважа Рис. 6. Структура штаммов семейства Enterobacteriaceae, выделенных из жидкости назального лаважа (в %) Рис. 7. Структура грамположительных бактерий - представителей нормальной микрофлоры дыхательных путей и окружающей среды, выделенных из жидкости назального лаважа (в %) № Микроорганизм Количество штаммов % 1 S.oralis 8 20,5% 2 S.salivarius 9 23,1% 3 S.sanguinis 2 5,1% 4 S.agalactiae 2 5,1% 5 S.mitis 10 25,7% 6 S.parasanguinis 2 5,1% 7 S.vestibularis 2 5,1% 8 S.infants 1 2,6% 9 E.faecium 2 5,1% 10 E.faecalis 1 2,6% Таблица 4. Структура бактерий рода Streptococcus, выделенных из жидкости назального лаважа Рис. 8. Структура грамотрицательных и грамвариабельных кокков и коккобацилл, а также палочек, не относящихся к НФГОБ и семейству Enterobacteriaceae, выделенных из жидкости назального лаважа (в %)

Об авторах

Ольга Владимировна Кондратенко

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет МЗ РФ

Email: helga1983@yandex.ru
кандидат медицинских наук, доцент кафедры общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии

Александр Викторович Жестков

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет МЗ РФ

Email: avzhestkov2015@yandex.ru
профессор, заведующий кафедрой общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии

Екатерина Дмитриевна Медведева

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет МЗ РФ

Email: katemed96@gmail.com
студент

Анастасия Вячеславовна Ермолаева

ФГБОУ ВО Самарский государственный медицинский университет МЗ РФ

Email: ermolaeva95@mail.ru
студент

Елена Александровна Васильева

ГБУЗ Самарская областная детская клиническая больница им. Н. Н. Ивановой

Email: vasileva@rcf.ru
врач высшей категории, руководитель Самарского областного центра по лечению муковисцидоза

Список литературы

Дополнительные файлы