SYNECOLOGICAL ANALYSIS OF THE MICROBIOCENOSYS OF LARGE POULTRY FARMS

Full Text

Отдельные аспекты проблемы циркуляции микроорганизмов в птицеводческих хозяйствах хорошо изучены. В промышленном птицеводстве большое внимание уделяется созданию эпизоотического благополучия, так как высокая концентрация поголовья животных на ограниченной территории неизбежно приводит к увеличению микробного фона на производственных площадках и окружающих территориях и создает благоприятные условия для быстрого распространения инфекционных заболеваний [1]. Кроме того, внимание направлено на обеспечение охраны здоровья персонала цехов птицефабрик, поскольку спектр эпидемиологически опасных микроорганизмов, персистирующих в кишечнике кур, достаточно широк. Птицы могут быть носителями многих зоопатогенных микроорганизмов, вызывающих острую кишечную инфекцию (ОКИ) у людей, таких как Escherichia coli, Citrobacter freundii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, а также эпидемиологически опасной кишечной микрофлоры, среди которых ведущие - Salmonella enteritidis (возбудитель сальмонеллеза) и Campylobacter jejuni (возбудитель кампилобактериоза) [2]. То есть, изучение микробиоценозов в данном случае является частью мероприятий по созданию эпидемиологического благополучия на птицефабрике, что должно способствовать производству высококачественной продукции, свободной от эпидемиологически опасной условно-патогенной микрофлоры. Однако, экологические особенности синэкологической структуры микробиоценозов в крупных птицеводческих хозяйствах остаются практически неисследованными. Цель работы: выявление особенностей видовой структуры сообществ микроорганизмов, циркулирующих среди персонала и поголовья птицы в трех крупных птицеводческих хозяйствах Нижегородской области. В этой работе мы впервые при помощи статистических методов и экологических индексов установили различие в видовом составе сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки персонала цехов крупных птицеводческих хозяйств и микробиоты кур. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Микробиоценозы изучали с помощью оптимизированного авторами классического бактериологического метода, позволяющего выделить широкий спектр видов микроорганизмов и идентифицировать их с примененим времяпролетного MALDI масс-спектрометра Autoflex (Bruker Daltonics, Германия) [3]. Была изучена микрофлора толстой кишки 223 сотрудников трех птицефабрик, непосредственно контактирующих с курами: птичницы, работники кормоцехов, сотрудники убойного цеха. Кроме того, исследованы микробиоценозы органов и систем 277 птиц: сердце, селезенка, зоб, желудок, желчный пузырь, тонкая и толстая кишка, яичники, лимфатические узлы, мозг. Всего проведено более 2000 исследований. Результаты микробиологического исследования (видовая представленность и численность каждого вида микроорганизмов в 1г субстрата) внесены в сформированную ранее базу данных и распределены по 29 группам-показателям, наиболее полно отражающим структуру микробиоценозов человека и животных. Внесенные записи систематизированы и обработаны с помощью созданной нами системы управления базой данных (СУБД) «Автоматизированная система микробиологического мониторинга микробиоценозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)» [4]. Статистический анализ полученных результатов проводили с применением статистических критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка, а также непараметрических критериев Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса. Для расчетов использовали разработанную нами «Автоматизированную систему микробиологического мониторинга микробиоценозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)» и программу STATISTICA 8.0 (StatSoft) [5, 6]. Критическое значение р-уровня принимали равным 0,05 [4, 6]. Экологический анализ перестройки видовой структуры (видового богатства и видового разнообразия) сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки людей и кишечника кур был проведен с применением индексов сходства (Жаккара и Коха), экологических индексов Шеннона, Симпсона, Маргалефа и Пиелу [3, 7]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ На первом этапе статистического анализа была проведена процедура проверки общей матрицы данных на нормальность распределения с помощью критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Анализ показал, что данные не подчиняются нормальному распределению. В связи с этим в дальнейшем использовали непараметрические статистические методы [6-8]. Статистический анализ различий в численности представителей кишечной микрофлоры людей, работающих на птицефабриках, был проведен с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Анализ проводился между сотрудниками, работающими на двух птицефабриках: птицефабрика А и птицефабрика В. В анализ были включены 15 показателей, одновременно встречающихся у людей в двух птицефабриках. Установлено, что статистически значимые различия между двумя исследованными птицефабриками наблюдались по пяти видам микрофлоры кишечника людей: Lactobacillus spp., Escherichia coli лактозопозитивная, E. coli (всего), Staphylococcus epidermidis и Klebsiella spp. (табл. 1). Статистический анализ различий в численности представителей микробиоты кур трех птицефабрик был проведен с помощью непараметрического критерия Крускалла-Уоллиса [6, 7]. В анализ были включены 9 показателей, одновременно встречающихся у кур на трех птицефабриках. Было установлено, что статистически значимые различия между тремя исследованными птицефабриками наблюдались по шести видам микробиоты кур: Salmonella spp., Lactobacillus spp., E. coli (всего), Staphylococcus epidermidis, Klebsiella spp., Enterobacter spp. (табл. 2). Таким образом, с применением критерия Крускалла-Уоллиса выявлено наличие статистически значимых различий в численности только определенных видов микроорганизмов. Для ответа на вопрос о наличии или отсутствии различий в численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки сотрудников и микробиоты кур, относящихся к одной птицефабрике, был проведен статистический анализ попарных различий с применением непараметрического критерия Манна-Уитни. В анализ были включены 11 видов симбиотических микроорганизмов, встречающихся одновременно у людей и кур птицефабрики А и 12 видов птицефабрики В. В ходе анализа в каждой птицефабрике были выявлены виды микроорганизмов, которые статистически значимо различались по численности между сотрудниками и курами (табл. 3). Экологический анализ перестройки видовой структуры (видового богатства и видового разнообразия) сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки людей и кишечника кур был проведен с применением индексов сходства (Жаккара и Коха) и экологических индексов Шеннона, Симпсона, Маргалефа и Пиелу [3, 7]. На начальном этапе с использованием коэффициента Жаккара (Cj) было проведено изучение сходства в видовом составе микробиоценоза толстой кишки сотрудников птицефабрик A, B. Анализ показал, что у сотрудников коэффициент сходства Жаккара составляет 0,71. Довольно высокий уровень сходства объясняется тем, что состав микробиоценоза кишечника (ядро микробиоты) человека относительно постоянен, несмотря на влияние различных факторов внешней среды (климат, питание и др.) [9]. Аналогичное изучение сходства видового состава микробиоценоза кур показало, что в этом случае коэффициент сходства Жаккара находится в неперекрывающемся с сотрудниками интервале 0,44÷0,61. С помощью индекса биотической дисперсии Коха (Ik) было оценено сходство видового состава микробиоценоза кишечника кур птицефабрик А, В и С, участвующих в анализе. Значение индекса Коха составило 0,51. Сравнительно низкий уровень сходства видового состава микробиоты кур объясняется разными условиями содержания птицы (на птицефабриках А и В напольное содержание, на птицефабрике С - клеточное), использованием разных кормов, воды, а также тем, что птицефабрики являются для кур «замкнутой» системой, в которой они находятся в течение всего жизненного цикла. Анализ сходства видового состава микробиоты кур и толстой кишки сотрудников цехов птицефабрик А и В с помощью коэффициента Жаккара (Cj) показал среднюю степень видового сходства (52%; СJ -0,52) между сравниваемыми группами (табл. 4). Синэкологический анализ предполагает анализ видовой структуры сообщества, которая характеризуется не только показателями видового богатства, но и видового разнообразия, учитывающего представленность каждого вида. Левич [10] подчеркивает, что видовая структура представляет собой экологическую «систему отсчета», поскольку именно изменения в численностях видов дают информацию о структуре и функционировании сообщества. Удобной формой свертывания информации о сообществе представляют собой экологические индексы: видового разнообразия Шеннона, доминирования Симпсона, видового богатства Маргалефа и выравненности Пиелу [10-14] (табл. 5). Следует подчеркнуть, что во всех птицефабриках, как у кур, так и персонала цехов при увеличении видового разнообразия сообществ симбиотических микроорганизмов, оцениваемого по индексу Шеннона, закономерно снижается доминирование (индекс Симпсона) и возрастает выравненность (индекс Пиелу) (табл. 5). Эти факты полностью согласуются с основными положениями теоретической экологии. В табл. 6 показан анализ видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки сотрудников цехов и микробиоты кур птицефабрик. Сравнение видового богатства микробиоты кур птицефабрик А, B и С показало, что в трех исследуемых птицефабриках присутствуют 12 общих видов микроорганизмов: Escherichia coli (всего), Lactobacillus spp, E. coli (лак+), Staphillococcus epidermidis, Klebsiella spp, Enterobacter spp., Pantoea spp., E. coli (лак-), Salmonella spp (S.enteritidis), микроорганизмы группы неферментирующих грамотрицательных бактерий, Proteus mirabilis. Сравнение видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки персонала цехов птицефабрик А, B показало, что в двух сравниваемых группах присутствуют 13 общих видов микроорганизмов: E.coli (лак+), Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Lactococcus spp., Enterococcus spp., E.coli (всего), Citrobacter spp., Staphylococcus epidermidis, E.coli гемолитические (способность к гемолизу как фактор патогенности), Klebsiella spp., E.coli (лак-), Proteus mirabilis, E.coli лактозодефективные, Staphylococcus aureus. Наличие Salmonella enteritidis в микробиоте кур и отсутствие этих микроорганизмов в микробиоценозе толстой кишки персонала можно объяснить тем, что в условиях постоянного инфицирования малыми дозами сальмонелл у работников птицеводческих хозяйств вырабатывается специфические сальмонеллезные антитела в высоких титрах, препятствующие появлению в микробиоте этих бактерий [15]. Сравнение видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки персонала цехов птицефабрики А и микробиоты кур птицефабрики А показало, что в двух сравниваемых группах присутствуют 12 общих видов микроорганизмов: E.coli (всего), Enterococcus spp., Lactobacillus spp., E.coli (лак+), Bifidobacterium spp., Staphylococcus epidermidis, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, E.coli (лак-), Proteus mirabilis, Дрожжевые клетки - дрожжеподобные грибы, не относящиеся к роду Candida (Saccharomyces spp., Kluiveromyces spp., Picchia spp. и др.), E.coli лактозодефективные. Сравнение видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки персонала цехов птицефабрики B и микробиоты кур птицефабрики B показало, что в двух сравниваемых группах присутствуют 11 общих видов микроорганизмов: E.coli (всего), Enterococcus spp., Lactobacillus spp., E.coli (лак+), Bifidobacterium spp., Staphylococcus epidermidis, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, E.coli (лак-), Proteus mirabilis, E.coli лактозодефективные. Таким образом, проведенный анализ результатов бактериологических исследований, проведенный c помощью общепринятых статистических критериев и экологических индексов, позволил сделать следующие выводы: ВЫВОДЫ Выявлены статистически значимые различия в численности видов микроорганизмов микробиоты кишечника сотрудников птицефабрик А, В: Lactobacillus spp., E. coli (лак + и всего), Klebsiella spp., S. epidermidis; и микробиоты кур птицефабрик А, В, С: Lactobacillus spp., E. coli (всего), Salmonella spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., S. epidermidis. В каждой из двух птицефабрик (А, В) выявлены статистически значимые различия в численности видов микроорганизмов микробиоты кишечника сотрудников и микробиоты кур. Анализ сходства в видовом составе микробиоценоза толстой кишки сотрудников птицефабрик A, B показал, что у сотрудников коэффициент сходства Жаккара составляет 0,71. Достаточно высокая степень сходства говорит о том, что состав микробиоценоза кишечника (ядро микробиоты) человека относительно постоянен, несмотря на влияние различных факторов внешней среды (климат, питание и др.). Анализ сходства в видовом составе микробиоценоза кур птицефабрик А, B установил, что коэффициент сходства Жаккара находится в неперекрывающемся с сотрудниками интервале 0,44÷0,61, оценка сходства в видовом составе микробиоты кур трех птицефабрик A, B, C при помощи индекса биотической дисперсии Коха показала низкий уровень сходства видового состава микробиоты (0,51). Это может объясняться разными условиями содержания птицы (на птицефабриках А и В напольное содержание, на птицефабрике С - клеточное), использованием разных кормов, воды, а также тем, что птицефабрики являются для кур «замкнутой» системой, в которой они находятся в течение всего жизненного цикла. Анализ сходства видового состава микробиоты кур и толстой кишки сотрудников цехов птицефабрик А и В с помощью коэффициента Жаккара (Cj) установил среднюю степень видового сходства (52%; СJ -0,52) между сравниваемыми группами. Синэкологический анализ показал, что во всех птицефабриках, как у кур, так и персонала цехов при увеличении видового разнообразия сообществ симбиотических микроорганизмов, оцениваемого по индексу Шеннона, закономерно снижается доминирование (индекс Симпсона) и возрастает выравненность (индекс Пиелу). Проведенный анализ видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов микробиоты сотрудников птицефабрик и кур выявил наличие 12 общих видов по птицефабрике А и 11 общих видов по птицефаб-рике В. Salmonella enteritidis была выделена только из микробиоты кур на всех птицеводческих площадках. Таблица 1. Различия в численности видов микроорганизмов микробиоты сотрудников цехов птицефабрик А и В (по критерию Манна-Уитни) Таблица 2. Различия в численности видов микроорганизмов микробиоты кур птицефабрик А, В и С (по критерию Крускалла-Уоллиса) Таблица 3. Статистически значимые численности видов микроорганизмов (показатели), выявленные при попарном сравнении видовой структуры микробиоты сотрудников и кур каждой птицефабрики (по критерию Манна-Уитни) Таблица 4. Сходство видового состава сообществ симбиотических микроорганизмов микробиоты кур и сотрудников цехов птицефабрик А и В, оцениваемое коэффициентом Жаккара Таблица 5. Показатели видовой структуры сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки сотрудников цехов и микробиоты кур птицефабрик Таблица 6. Сравнительный анализ видового богатства сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки сотрудников цехов и микробиоты кур птицефабрик

About the authors

Irina Vladlenovna Soloveva

Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod

Email: lab-lb@yandex.ru
Doctor of Biological Science, Head of the Laboratory of Human Microbiome and Means of its Correction

Alexander Nikolaevich Varichev

Lobachevsky State University

Email: alvarichev@gmail.com
candidate of Biological Science, Senior Lecturer of the Department of Ecology, Institute of Biology and Biomedicine Nizhni Novgorod

Irina Viktorovna Belova

Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod

Email: lab-lb@yandex.ru
candidate of Medical Science, Leading Research Scientist of the Laboratory of Human Microbiome and Means of its Correction

Anna Georgievna Tochilina

Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod

Email: lab-lb@yandex.ru
candidate of Biological Science, Senior Researcher, Laboratory of Human Microbioma and Means of its Correction

David Bezhanovich Gelashvili

Lobachevsky State University

Email: ecology@bio.unn.ru
Doctor of Biological Science, Head of Department of Ecology, Institute of Biology and Biomedicine Nizhni Novgorod

Galina Ivanovna Grigor’eva

Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod

Email: grigmicro@yandex.ru
Doctor of Biological Science, Substitute of the Head of the Scientific Work

Vladimir Anatol'evich Zhirnov

Blokhina Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology of Nizhny Novgorod

Email: lab-lb@yandex.ru
Candidate of Biological Science, research Scientist of the Laboratory of Human Microbiome and Means of its Correction

Iliya Nikolaevich Kalashnikov

Privolzhsky Research Medical University

Email: ilia17ne@mail.ru
Candidate of Biological Science, Associate Professor at the Biology Chair Nizhni Novgorod

References

Supplementary files