APPLICATION OF THE IMPEDANCE METHOD FOR COMPARATIVE RESEARCH OF THE CHRONIC CHEMICAL STRESS IMPACT ON THE DEVELOPMENT OF THE GASTROINTESTINAL TRACT PATHOLOGY OF MALE AND FEMALE WHITE OUTBRED RATS

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Злокачественные опухоли желудка являются пятой по распространенности среди онкологических заболеваний (1,3 млн. случаев) и второй ведущей причиной смерти от рака во всем мире (819000 случаев)[1]. При этом отмечены гендерные различия по распространённости рака желудка (РЖ), который встречается в два раза чаще у мужчин, чем у женщин, и смертность среди заболевших мужчин также в полтора раза выше, по сравнению с женщинами [2]. Усугубляется проблема тем, что на момент постановки диагноза у большинства пациентов выявляется поздняя стадия заболевания, что приводит к общей низкой выживаемости [3, 4]. Несмотря на активное исследование канцерогенеза желудка механизм, лежащий в основе этого процесса, выяснен не полностью. Считается, что РЖ возникает вследствие длительного существования в условиях стресса, вызванного воздействием сложного комплекса факторов окружающей среды, среди которых не последнюю роль играет характер питания, в том числе нитритная нагрузка пищи [5, 6]. Длительное воздействие токсикантов даже в низких дозах, а также инвазивность и слабая селективность методов ранней диагностики могут способствовать широкому распространению РЖ человека и животных. РЖ не имеет специфических симптомов на ранних стадиях, когда он хирургически излечим. В то же время, на поздних стадиях имееются ограниченные варианты лечения, поскольку РЖ проявляет относительную резистентность к химиотерапии/лучевой терапии [7, 8]. Поэтому актуальным остается поиск минимально инвазивных методов для обнаружения РЖ на ранней стадии наряду с классическими диагностическими инструментами. Одним из возможных путей решения этой проблемы является исследование изменений электрических параметров: импеданса и коэффициента поляризации тканей на начальных этапах развития опухолевого процесса. По показателям импеданса тканей (например, взятых у пациента при диагностической биопсии) или эритроцитарной массы крови можно по снижению коэффициента поляризации определить наличие злокачественных новообразований, некротических изменений, оценить жизнеспособность тканей организма [9-11]. Полное электрическое сопротивление (импеданс) тканей, измеренное на высоких частотах, позволяет оценить внутриклеточные изменения, а в низкочастотном диапазоне импеданс обусловливается размерами межклеточных пространств, уровнем кровенаполнения и гидратации тканей. На практике же, как правило, анализируют относительные показатели импеданса здоровых тканей для оценки физиологической нормы и импеданса пораженного участка ткани. Исследуют также коэффициент поляризации (КП), равный отношению величин/показателей импеданса на двух фиксированных частотах низкой и высокой. КП характеризует общее состояние структурной организации тканей. При нарушении структуры, сопротивление на этих частотах постепенно выравнивается, и значение КП приближается к 1. Таким образом имеется возможность по показателям биоимпеданса судить о степени жизнеспособности ткани [12, 13]. Цель работы: на основе анализа изменений электрических параметров биотканей выявить влияние хронического химического стресса на развитие патологий желудочно-кишечного тракта самцов и самок белых беспородных крыс. Объекты и методы исследований. Исследование проводили на 80 беспородных белых крысах массой 220-250 г, разделенных на четыре (две опытные и две контрольные) группы по половой принадлежности, которые существовали в условиях перенаселения с соотношением см²/г массы тела = 0.3 (социальный стресс). Контрольные группы содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Животным в опытных группах в рацион добавляли 0,2% раствор NaNO2 в питьевой воде и ароматический амин м-толуидин (25 мг/кг веса) натощак вместе с кормом, расчет дозы осуществляли в соответствии с литературными данными. Продолжительность эксперимента составляла 270 суток. Из опыта крыс выводили декапитацией под легким эфирным наркозом. При работе с животными соблюдали правила в соответствии с протоколами Женевской конвенции и принципами надлежащей лабораторной практики (Национальный стандарт Российский Федерации ГОСТ Р 53434-2009). Гистологические исследования проводили по стандартной методике с изготовлением парафиновых блоков и окраской тонких срезов (3-5 мкм) гематоксилином и эозином. Измерение электрического импеданса выполняли в образцах тканей желудка, печени и отмытых эритроцитах. Эритроциты отделяли от сыворотки крови и отмывали 0,9% раствором хлорида натрия центрифугированием. Импедансометрию проводили на многочастотном анализаторе, состоящем из генератора сигналов Г6-27, цифрового вольтметра В7-27 А/1, блока питания К762 и кювет. Прибор предназначен для измерения величины импеданса в диапазоне частот 1 Гц - 1 МГц. Измерения выполняли на шести дискретных частотах от 50 гц до 100 кГц используя кювету (2 мл) с платиновым электродом для жидкой среды и игольчатые электроды погруженного типа, закрепленные на общем основании. Длина погруженной части 2 мм расстояние между иглами 15 мм. Рассчитывали коэффициент поляризации (или дисперсии) равный отношению импедансов на двух фиксированных частотах 100 гц и 100 кГц. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05. Полученные данные представлены как среднее±стандартная ошибка среднего. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ По результатам хронического воздействия нитритов, ароматического амина и социального стресса перенаселением после выведения животных из эксперимента при вскрытии были визуализированы патологии желудочно-кишечного тракта и селезёнки у 56% животных обоего пола, соотношение которых представлено на диаграмме рис.1, а примеры патологических изменений слизистой оболочки желудка на рис.2. Среди этих животных с выявленными патологиями было 28 самцов (70%, 28 из 40) и 17 самок (42%, 17 из 40), таким образом количество самцов с подтверждёнными гистологией опухолями желудка было в 1,6 раза выше, чем у самок. У 14 самок (35%) и 12 самцов (30%) выявили атрофический гастрит и дисплазию желез в желудке (рис. 3Б), которые являются предраковыми состояниями. Метастазы в печени и легких наблюдались у 70% крыс с аденокарциномой желудка (рис. 3В) независимо от пола животных. Метастатические узлы были представлены кластерами атипичных клеток с большими гиперхроматическими ядрами. 23% самцов крыс (9 из 40) продемонстрировали пептические язвы без предраковых или раковых изменений в желудке. Нормальные желудочные ткани представлены на рисунке 3А. Хроническая нитритная интоксикация является достаточно распространенным патологическим процессом, в котором эритроцитарная система рассматривается в качестве первой мишени действия нитритов [14]. В результате проведенного анализа электрических параметров эритроцитарной массы животных обоего пола (рис.4) установлено достоверное снижение коэффициента поляризации по отношению к контрольным группам как у самцов, так и у самок.Однако у самцов этот процесс проходил более интенсивно и КП снижался на 17%, а у самок только на 6% и оставался выше единицы (величина КП для самцов-1,07, для самок -1,45), что может свидетельствовать о частичной сохранности частотного градиента электропроводности и, соответственно, структуры ткани. Электроимпедансометрия слизистой оболочки желудка успешно применяется для диагностики форм гастрита, доброкачественных и злокачественных опухолей. По литературным данным известен интервал КП, характерный для злокачественных опухолей, он составляет от 15 до 40% снижения по сравнению с данными здоровой слизистой [13]. Данные, полученные в нашем эксперименте, свидетельствуют о снижении КП слизистой желудка на 43% у самцов и на 36% у самок (табл. 1), что соответствует развитию в тканях патологического процесса. Исследования выявили, что показатели величин импеданса ткани печени существенно отличаются от нормы как у самцов, так и у самок. Коэффициент поляризации понизился на 50 и 43% соответственно (табл.1). Обратил на себя внимание случай визуализации крупной опухоли на печени одного из животных (самца). Выявлено, что абсолютный показатель импеданса тканей печени, в которой диагностирована опухоль, при низкой частоте снижался на 67%, а КП - на 70% по сравнению с контрольным значением. Таким образом, можно констатировать, что уровень снижения исследуемых показателей соответствует степени развития заболевания [15]. Мы полагаем, что зарегистрированные достоверные изменения электрических характеристик клеток печени могут быть следствием длительного воздействия токсикантов, нарушивших барьерную функцию мембран, баланс ионов и трансмембранную разность потенциалов. Систематический прием токсических веществ (нитритов и аминов) вызывает компенсаторную перестройку метаболизма и развитие патологического типа обменных процессов, что и отражается на характере частотной зависимости импеданса. Для образцов тканей крыс, находившихся в условиях стресса и интоксикации, показана большая частота встречаемости предраковых патологий слизистой желудка и метастазов в печени. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Полученные в ходе эксперимента результаты свидетельствуют о наличии гендерных различий в электрических показателях тканей крыс при хроническом химическим стрессе, что может быть использовано для исследования динамики канцерогенеза in vivo на основе анализов импеданса эритроцитарной массы или исследования биоптатов.Показана большая подверженность процессам канцерогенеза особей мужского пола. Однако не выявлено различий в характере патологий, как ответной реакции на стресс. При моделировании хронического воздействия на животных мы использовали низкие концентрации токсикантов, с которыми люди сталкиваются в обычной жизни, потребляя продукты, содержащие повышенные концентрации нитритов, и ароматические амины, встречающиеся в копченых и жареных продуктах. Кроме того,использовано перенаселение клеток с животными, как вариант социального стресса, которому также подвержены люди.Вместе с тем разработанная нами модель является более информативной для выявления роли отдельных, главным образом физиологических факторов, в индуцировании РЖ без сопутствующих этомусоциально-экономических, этнических и религиозно-культурных различий, характерных для людей, которым приписывается существенная роль при канцерогенезе [16]. Поскольку одной из важнейших проблем онкологии является позднее выявление заболевания, развитие неивазивных методов диагностики в значительной мере может облегчить решение этой задачи, поскольку они характеризуются быстротой, безболезненностью, простотой, экономической доступностью и отсутствием побочных эффектов, что позволяет обеспечить быстрый предварительный мониторинг больших групп населения. Исследование электрических параметров как мониторингового метода может стать одним из важных элементов системы «настороженности» медперсонала по отношению к РЖ, что важно для снижения распространения этого агрессивного заболевания. Рис. 2. Фотографии нормальной (А) и пораженной (Б - язва желудка, В - новообразование в желудке) слизистой оболочки желудка крыс, как результат воздействия хронического стресса Рис. 1. Диаграмма распределения частоты встречаемости патологий крыс как результат хронического воздействия химического и социального стрессов Рис. 3. Гистологический анализ различных органов крыс: А - нормальная слизистая желудка; Б - дисплазия желез в желудке; В - высокодифференцированная аденокарциномажелудка; Г - метастазы в печени. Окраска гематоксилином и эозином Рис. 4. Электрические показатели эритроцитарной массы на двух фиксированных частотах в контрольных и опытных группах самок и самцов белых беспородных крыс: А - показатели импеданса (Z); Б - коэффициента поляризации (КП) Примечание: различия статистически значимы при (р<0,05) Таблица 1. Показатели импеданса (Z) и коэффициента поляризации (КП) тканей печени и желудка контрольных и опытных групп животных Примечания: достоверные различия показателей: *между контролем и опытом в каждой группе; # - экспериментальными группами самцов и самок; различия статистически значимы при (р<0.05).F- частота

About the authors

Matvey Vladimirovich Kanevsky

Saratov State University

Email: matvejkanev@mail.ru
Ph.D. in Biology, Assistant Lecturer at the Department of Biochemistry and Biophysics

Irina Konstantinovna Mironova

Saratov State University

Email: mironovaik@mail.ru
Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Biochemistry and Biophysics

Svetlana Anatol'evna Konnova

Saratov State University

Email: Konnovasa@yandex.ru
Doctor of Biological Sciences, Professor, Head at the Department of Biochemistry and Biophysics

Anna Alekseevna Galitskaya

Saratov State University

Email: ann.gal@mail.ru
Candidate of Biological Sciences, Associate Professor at the Department of Biochemistry and Biophysics

Ilana Mikhaylovna Agranovich

Saratov State University

Email: ilana.agranovich@yandex.ru
Graduate Student of the Department of Human and Animal Physiology

Alexander Petrovich Khorovodov

Saratov State University

Email: Khorovodov2012@yandex.ru
Student of the Department of Human and Animal Physiology

Ekaterina Georgieva Borisova

Saratov State University

Email: ekaterina.borisova@gmail.com
Candidate of Physical and Mathematical Sciences, Associate Professor at the Department of Human and Animal Physiology

Oksana Valer'evna Semyachkina-Glushkovskaya

Saratov State University

Email: Konnovasa@yandex.ru
Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Human and Animal Physiology

References

Supplementary files