The study evaluates the effectiveness of 3-arylidene-2-oxindole in reducing intraocular pressure in old animals

Alexander A. Spasov; Спасов Александр Александрович; Lyudmila V. Naumenko; Науменко Людмила Владимировна; Alyona S. Taran; Таран Алена Сергеевна; Alina M. Chebanko; Чебанько Алина Михайловна; Umida M. Ibragimova; Ибрагимова Умида Махсатовна; Dmitry S. Yakovlev; Яковлев Дмитрий Сергеевич; Maria S. Pshenichnikova; Пшеничникова Мария Сергеевна; Nadezhda M. Shcherbakova; Щербакова Надежда Манжиевна; Natalia A. Lozinskaya; Лозинская Наталья Александровна; Elena N. Bezsonova; Безсонова Елена Николаевна

doi:10.19163/1994-9480-2025-22-1-55-60

Оценка офтальмогипотензивной активности 3-арилиден-2-оксиндола на старых животных с повышенным внутриглазным давлением

Авторы: Спасов А.А.¹, Науменко Л.В.¹, Таран А.С.¹, Чебанько А.М.¹, Ибрагимова У.М.¹, Яковлев Д.С.¹, Пшеничникова М.С.¹, Щербакова Н.М.¹, Лозинская Н.А.², Безсонова Е.Н.²
Учреждения:
1. Волгоградский государственный медицинский университет
2. Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова
Выпуск: Том 22, № 1 (2025)
Страницы: 55-60
Раздел: Оригинальные исследования
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/683088
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2025-22-1-55-60
ID: 683088

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Цель. Изучение возможности изостера мелатонина, соединения К-165, снижать внутриглазное давление (ВГД) у старых животных с повышенным офтальмотонусом, оценка его местнораздражающего действия и цитотоксических свойств. Материалы и методы. Исследование проводили на старых крысах старше двух лет, уровень ВГД у которых свыше 16 мм рт. ст. Уровень офтальмотонуса измеряли с помощью портативного контактного тонометра Tonovet ICare (Финляндия). Наличие ВГД-снижающей активности исследуемого вещества оценивали по максимальному снижению офтальмотонуса по сравнению с исходными показателями давления. Оценку местнораздражающего действия проводили по трехбалльной шкале после нанесения вещества на ткани глаза лабораторного животного. Цитотоксичность изучалась на клетках линии HepG2 (гепатоцеллюлярной карциномы человека) (CLS CellLinesService). Результаты. Соединение K-165 снижает уровень ВГД у старых животных, превосходя по эффективности препарат сравнения мелатонин. Соединение К-165 снижает уровень офтальмотонуса к третьему часу на 21 % от исходного и не обладает местнораздражающим действием на конъюктиву глаза. Показано, что величина средней цитотоксической концентрации превышает величину 100 мкМ для соединения К-165 (R2 = 0,9), что соответствует веществам с низкой цитотоксичностью. Заключение. Соединение К-165, выраженно снижающее ВГД, не обладает меснораздражающим действием и относится к соединениям с низкой цитотоксичностью.

Ключевые слова

глаукома, повышеное ВГД, старые животные, биоизостеры мелатонина

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Глаукома – хронически прогрессирующая оптиконейропатия, являющаяся одной из ведущих причин полной утраты зрительной функции у людей по всему миру [1]. В настоящее время по всему миру насчитывается более 70 млн больных глаукомой, а по прогнозам к 2040 г. их количество достигнет 111,8 млн [2].

Глаукома имеет мультифакториальный характер и сводится к повреждению ганглиозных клеток сетчатки и нервных волокон зрительного тракта [1, 2]. Уровень офтальмотонуса – важная составляющая нормальной физиологии глаз, и при его изменении возникают те или иные патологические состояния. Чаще всего рост офтальмотонуса связывают с нарушением оттока водянистой влаги (ВВ) по патологически измененным трабекулярному и увеосклеральному пути. Возрастные сосудистые изменения, такие как ишемическая болезнь сердца (ИБС), гипертоническая болезнь, метаболический синдром и атеросклероз могут привести к значительным изменениям трофики глазных структур, вплоть до ишемии, что запускает апоптоз ганглиозных клеток сетчатки (ГКС) [1].

Против ГКС могут вырабатываться антитела и провоспалительные цитокины (IL-1, IL-6, TNF-α), что лежит в основе нейровоспалительного процесса. В результате компрессии головки зрительного нерва наступает прогрессирующая потеря нервных волокон зрительного тракта, как следствие – ухудшение зрительной функции и слепота [1]. Риск прогрессирования потери полей зрения у пациентов снижается на 10–15 % при снижении ВГД всего на 1 мм рт. ст. [3].

Выделяют две большие группы препаратов, снижающих офтальмотонус. Первая группа включает препараты, улучшающие дренаж ВВ (аналоги простагландинов, например, латанопрост), которые способны понизить офтальмотонус на 30–35 % от исходного уровня за счет активации увеосклерального пути через простагландиновые рецепторы и расслабить гладкомышечные клетки трабекулярной сети [3]. Однако ряд пациентов ввиду своих генетических особенностей не восприимчивы к данному препарату [4].

Также отток ВВ можно стимулировать воздействием М-холиномиметиков на соответствующие рецепторы, например, пилокарпин способен снизить офтальмотонус на 20–25 % от исходных значений. Но данный препарат вызывает ряд системных (повышенная потливость, тошнота, одышка и др.) и местных (затуманивание зрения, ухудшение ночного зрения) побочных явлений.

Ко второй группе относятся препараты, угнетающие образование ВВ. Сюда относятся β-адреноблокаторы, например, тимолол, способный снижать уровень офтальмотонуса на 20–25 % от исходного уровня за счет блокады β1-, β2-адренорецепторы цилиарного тела [3, 5].

Данный препарат также всасывается в системный кровоток и влечет ряд нежелательных побочных реакций, таких как бронхоспазм и брадикардия, которые могут угрожать жизни пациента [6].

Таким образом, несмотря на большое количество противоглаукомных препаратов, остается актуальным поиск новых средств с выраженным офтальмогипотензивным эффектом и минимальными суточными колебаниями ВГД, хорошо переносимых и высоко безопасных. В ранее проведенных исследованиях [7] среди изостеров мелатонина было выявлено соединение К-165, обладающее офтальмогипотензивными свойствами.

Цель работы

Изучение возможности изостера мелатонина, соединения К-165, снижать внутриглазное давление у старых животных с повышенным офтальмотонусом, оценка его местнораздражающего действия и цитотоксических свойств.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Все манипуляции с лабораторными животными и условия их содержания проводились с соблюдением всех требований лабораторной практики при проведении доклинических исследований в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», [ГОСТ 33044-2014]. Все экспериментальные исследования выполнялись в соответствии с требованиями действующего «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Миронов А.Н., 2012), со статьей 11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» (Собрание законодательства Российской Федерации, 2010, № 16, ст. 1815; № 31, ст. 4161) и согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Межгосударственный стандарт [ГОСТ 33044-2014] и Приказ Минздрава России от 01.04.2016 N 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Все методические подходы использовались в соответствии с требованиями в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (Часть первая. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.)». Процедуры с участием лабораторных животных осуществлялись в соответствии с этическими нормами обращения с животными, принятыми в Директиве Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, использующихся для научных целей». Экспериментальное исследование одобрено этическим комитетом (справка № 2022/043 от 02.12.2022 года).

Исследование было выполнено на 40 старых белых беспородных крысах обоих полов [масса 400–530 г, возраст (24 ± 1) мес.] и уровнем ВГД >16 мм рт. ст. и 15 нелинейных морских свинках (масса 220–300 г, возраст 5 мес.) В ходе работы изучен изостер мелатонина – соединение К-165, синтезированный на кафедре медицинской химии и тонкого органического синтеза МГУ имени М.В. Ломоносова. В качестве препарата сравнения исследовался мелатонин (НАО «Северная звезда», Россия.)

На первом этапе проводили измерение исходного значения офтальмотонуса при помощи тонометра (Tonovet ICare, Финляндия). В экспериментальные группы включали животных старше двух лет, уровень ВГД у которых свыше 16 мм рт. ст.

Все животные были разделены на следующие группы:

исследуемая группа 1 (контроль): интактные животные (n = 10);
исследуемая группа 2 (контроль): старые животные с повышенным ВГД (n = 10);
исследуемая группа 3 (опыт): старые животные с повышенным ВГД (n = 10);
исследуемая группа 4 (препарат сравнения) (n = 10).

В качестве растворителя соединения К-165 и мелатонина использовалась деионизированная вода. Соединение К-165 и мелатонин, после разведения в деионизированной воде, закапывали животным однократно в тестовый (правый) глаз по 50 мкл 0,4%-го раствора. Левый глаз каждого животного выступал в качестве контрольного, в него производилась инстилляция 30 мкл деонизированной воды. Далее осуществляли тонометрию через 60, 120 и 180 мин.

Полученные данные обрабатывали в программе MicrosoftExcel 2020 и GraphPadPrism 8.0.

Для исключения возможного негативного влияния на результаты исследования циркадных биоритмов все экспериментальные исследования проводились в одинаковые интервалы времени (с 9.00).

Оценка местнораздражающего действия К-165 осуществлялась на морских свинках [8]. Изучаемое соединение было использовано в дозах, эквивалентных поступающим в организм животного при ЭД50 или 10-кратной ЭД50 (соответственно, 0,2%-й и 2%-й суспензий), для проведения конъюнктивальной пробы.

Для этого глазной пипеткой в тестовый глаз производили инстилляцию 1 капли 0,2%-го и 2%-го водного раствора исследуемых веществ под верхнее веко животных. В контрольный глаз производили инстилляцию 1 капли дистиллированной воды.

Реакцию учитывали через 15 мин, 24 ч, оценивая в баллах по следующей шкале:

0 – полное отсутствие проявлений раздражающего действия;

1 – легкое покраснение слезного протока;

2 – покраснение слезного протока и склеры в направлении к роговице;

3 – покраснение всей конъюнктивы и склеры, реакция сопровождается почесыванием, возможно развитие гнойного воспаления. [2].

Цитотоксичность изучалась на клетках линии HepG2 (гепатоцеллюлярной карциномы человека) (CLS CellLinesService).

Принимая во внимание величину концентрации изучаемых веществ 0,1–0,4 %, демонстрирующую основное фармакодинамическое действие, диапазон тестируемых концентраций при изучении цитотоксичности составлял 0,00130 ммоль/л, достигая рабочих концентраций. В случае образования пересыщенных концентраций исследовалась суспензия, содержащая эквивалентное количество вещества. Использовали методику МТТ-теста [9] в модификации [10].

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программного обеспечения MARS Data Analysis Software, GraphPad Prism v.7.0 и Microsoft Office Excel 16 с расчетом показателя % выживаемости клеток в каждой изученной концентрации и концентрации, вызывающей цитостатический эффект на 50 % (СС50).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе исследования было выявлено, что уровень ВГД в контрольной группе старых животных был выше, чем в группе интактных животных, на 50 % (табл. 1).

Таблица 1

Влияние соединения К-165 на уровень внутриглазного давления в разных группах животных (М ± σ)

Группы	ВГД, мм рт. ст., 180 мин
Группа 1 (интактные)	11,11 ± 0,44
Группа 2 (старые животные)	16,70 ± 0,21*
Группа 3 (К-165)	13,2 ± 0,6^#
Группа 4 (мелатонин)	15,00 ± 0,35

* Показатели статистически значимо отличаются от группы контроля (интактные) при р < 0,05; t-критерий Стьюдента;

^# показатели статистически значимо отличаются от контрольной группы старых животных при р < 0,05; t-критерий Стьюдента.

В опытной группе (К-165) уровень ВГД под действием исследуемого соединения снизился на 21 % по сравнению с контрольной группой старых животных. У животных, которым вводили мелатонин, наблюдалась тенденция снижения ВГД.

Установлено, что соединение К-165 максимально снижает уровень офтальмотонуса к 3-му часу исследования, не оказывая похожего эффекта в коллатеральном глазу, что свидетельствует об отсутствии резорбтивного эффекта.

Исследуемое соединений К-165 также было изучено на возможность оказывать местнораздражающее действие на конъюктиву глаз морских свинок. В результате было показано, что соединения К-165 в концентрациях 0,2 % и 2 % не имеет собственно раздражающего действия на конъюнктиву. После закапывания соединения К-165 в любой из исследуемых концентраций у лабораторных животных отсутствовала гиперемия конъюнктивы, слизистое отделяемое и рефлекторное почесывание глаз.

Таблица 2

Величина цитотоксической концентрации для каждого исследуемого вещества

Шифр	Величина СС50, ммоль/л	R²
K-165	0,114	0,9
Мелатонин	4,700	0,9

Оценка цитотоксических свойств проводилась с использованием методики МТТ-теста на линии клеток HepG2. В результате исследования были установлены величины цитотоксической концентрации, вызывающей снижение метаболической активности клеток на 50 % для каждого вещества. Результаты предоставлены в табл. 2, рис. Показано, что величина средней цитотоксической концентрации превышает величину 100 мкМ как для соединения К-165 (R²= 0,9), так и для мелатонина (R² = 0,9) после 48 часовой инкубации в МТТ-тесте, что соответствует веществам с низкой цитотоксичностью.

Рис. Влияние соединений K-165 в концентрациях 0,001–30 ммоль/л на метаболическую активность (жизнеспособность) клеток лини HepG2 при 48 часовой инкубации в МТТ-тесте

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Производное 3-арилиден-2-оксиндола соединение К-165 в концентрации 0,4 % выражено снижает уровень ВГД у старых животных при однократном введении к 3-му часу исследования, превосходя по активности мелатонин. Также данное соединение не оказывает похожего эффекта в коллатеральном глазу, что свидетельствует об отсутствии резорбтивного эффекта. Соединение К-165 не раздражает конъюнктиву глаза и имеет низкую цитотоксичность, что делает его перспективным для дальнейших исследований.

***

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Финансирование: исследования выполнены при финансовой поддержке Российского научного фонда и администрации Волгоградской области, Проект 22-15-20025.

Funding: the research was supported by the Russian Science Foundation and the administration of the Volgograd region, Project 22-15-20025.